Una nueva técnica de análisis cuantitativos de la pérdida del pelo en ratones Uso del análisis de escala de grises

Resumen

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Resumen

La alopecia es una forma común de pérdida de cabello que puede ocurrir en muchas condiciones diferentes, incluyendo la pérdida de cabello de patrón masculino, el síndrome de ovario poliquístico, y la alopecia areata. Alopecia también puede ocurrir como un efecto secundario de la quimioterapia en pacientes con cáncer. En este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar un método consistente y fiable para cuantificar la pérdida del pelo en ratones, lo que permitirá a los investigadores a evaluar con precisión y comparar los nuevos enfoques terapéuticos para estas diversas formas de alopecia. El método utiliza un generador de imágenes de gel estándar para obtener y procesar imágenes de los ratones, la medición de la absorción de la luz, que se produce en una proporción aproximada a la cantidad de pelo negro (o gris) en el ratón. Los datos que han sido cuantificados de esta manera se pueden analizar utilizando técnicas estadísticas estándar (es decir, ANOVA, t-test). Esta metodología fue probada en modelos de ratón de la alopecia inducida por quimioterapia, alopecia areata y la alopecia de la depilación. En este informe, el protocolo detallado es presentados para realizar estas mediciones, incluidos los datos de validación de C57BL / 6 y C3H / HeJ cepas de ratones. Esta nueva técnica ofrece una serie de ventajas, incluyendo la relativa simplicidad de aplicación, la confianza en el equipo que está fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios de investigación, y la aplicación de una evaluación objetiva, cuantitativa que es más robusto que las evaluaciones subjetivas. Las mejoras en la cuantificación del crecimiento del pelo en ratones mejorarán estudio de los modelos de alopecia y facilitar la evaluación de nuevas terapias prometedoras en estudios preclínicos.

Introducción

La alopecia (caída del cabello) puede ser un evento psicológicamente y emocionalmente angustiante con múltiples causas. Calvicie de patrón masculino es la causa más común de alopecia, que afecta a aproximadamente dos tercios de los hombres a los 35 años ^1. Un patrón similar de pérdida de cabello se puede observar en las mujeres con síndrome de ovario poliquístico. En ambos de estos trastornos, la pérdida de cabello es de andrógenos mediada. Alopecia también puede ocurrir como una enfermedad autoinmune, alopecia areata, que afecta a 1,7% de la población ^2. La alopecia puede ocurrir como efecto secundario de algunos tratamientos médicos, como la quimioterapia ^3. Un alto porcentaje (65-85%) de los pacientes de quimioterapia experimentan algún grado de alopecia ^4,5. Las consecuencias psicológicas de la pérdida de cabello se han estudiado bien en el entorno de la quimioterapia. Alopecia inducida por la quimioterapia puede provocar ansiedad, depresión, una imagen corporal negativa, baja autoestima y un sentido reducido de bienestar ^6,7. Un alto percentaje (47-58%) de los pacientes de cáncer femeninas consideran la pérdida del cabello a ser el aspecto más traumática de la quimioterapia, y hasta 8% de tratamiento de disminución por temor a ^4,6 pérdida de cabello. También hay evidencia en la alopecia androgénica para apoyar a la terapia para reducir las consecuencias psicológicas y médicas, incluso de ^8,9 pérdida de cabello. Asimismo, se ha informado de la alopecia areata tener graves consecuencias psicológicas ^2, y de la naturaleza irregular de la pérdida de cabello puede conducir a un resultado cosmético más desagradable que la mayoría de otras causas de pérdida de cabello.

Mientras que las drogas con efectos anti-androgénicos leves (es decir, espironolactona) se habían utilizado con éxito limitado como tratamiento para la alopecia, el primer medicamento eficaz para la alopecia fue minoxidil ^10. Este antihipertensivo tiene un efecto secundario observado de causar el crecimiento del cabello, y ahora se utiliza como terapia tópica para muchas formas de alopecia. Sin embargo, las respuestas son a menudo incompletos, con algunos temas mostrando sólo lentaing de pérdida de cabello en lugar de rebrote real ^10. Finasteride es un antagonista competitivo de tipo II 5α-reductasa que bloquea la conversión de testosterona a dihidrotestosterona, que resulta en mejoras en la alopecia androgénica, a expensas de bloqueo parcial de andrógenos sistémica. Las tasas de respuesta con a largo plazo (10 años), la terapia son alrededor del 50% ^11. En general, a pesar de una considerable investigación en esta área, aún no existe una terapia adecuada para la pérdida del cabello.

Durante décadas, los científicos y los médicos han examinado métodos de medición de crecimiento del pelo del cuero cabelludo en ensayos clínicos. Con el desarrollo de medicamentos que tratan la alopecia, ha habido una mayor necesidad de medios fiables, económicas y mínimamente invasivos de medición de crecimiento del cabello y, específicamente, la respuesta a la terapia. La tecnología de análisis de imágenes para una cuantificación precisa de la densidad del pelo en pacientes con trastornos de pérdida de cabello produjeron resultados coherentes y válidos en el pasado usando una variedad de techniquES, incluyendo el análisis de imágenes digitalizadas ^12, análisis de imágenes de los pelos individuales y las lesiones de la piel ^13, y el escaneo microscópico para cuantificar la masa de pelo del cuero cabelludo en una región definida ^14.

Desafortunadamente, mientras que las metodologías anteriores han proporcionado una mejor evaluación de la eficacia para el cabello intervenciones en los ensayos clínicos promotora del crecimiento, estos métodos no han sido aplicados a los estudios con roedores en investigaciones preclínicas. Nuestro objetivo es desarrollar un método consistente y fiable para cuantificar la pérdida de cabello en ratones, lo que permitirá a los investigadores a evaluar con mayor precisión y comparar nuevos enfoques terapéuticos para diversas formas de alopecia. Hemos desarrollado una metodología utilizando equipos disponibles en la mayoría de los laboratorios que permitirán la cuantificación rápida y fiable de la densidad del pelo en ratones con pelo marrón o negro. Esta metodología ha sido probada en modelos de ratón de la alopecia inducida por quimioterapia, alopecia areata y la alopecia de waxing. Un protocolo detallado se presenta para realizar estas mediciones, incluidos los datos de validación de C57BL / 6 y C3H / HeJ cepas de ratones. Como esta técnica se basa en la detección de la absorción de luz a partir de pigmentos en el eje del pelo, no puede ser utilizado para detectar el crecimiento del cabello en ratones blancos o ratones albinos.

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Protocolo

Declaración de Ética: Todos los estudios con animales deben ser aprobados por el IACUC de la institución (por los datos que siguen, los protocolos fueron aprobados por el Montefiore IACUC, protocolo # 11-6-240 y # 13-7-100). Animales se proporcionan anestesia luz como se indica con la única finalidad de mantenerlos quietos durante la fotografía, no hay procedimientos dolorosos requeridos para este protocolo.

1. Adquisición de fotografías

1. Ajuste el enfoque y campo de visión para reproductor de imágenes de gel utilizando papel con el texto impreso. Verificar la uniformidad de la fuente de luz en toda la región fotografiada. Para ayudar a asegurar la uniformidad, utilice un generador de imágenes de gel con un sistema incorporado en la fuente de luz para la fotografía reflexiva. No utilice una fuente de luz transiluminación, ya que esto crearía una silueta del animal que no es adecuado para su posterior análisis en escala de grises.
   NOTA: Esto colocará el ratón ligeramente fuera de foco, que proporciona un promedio óptica a través de la región de interés (ROI) y la voluntadayudar a reducir los errores cuánticos para regiones muy pequeñas (es decir, <10 píxeles) de interés. Regiones más grandes de interés no se verán afectados por esta menor centrándose ajuste, ni serán afectados por las diferencias en el tamaño del animal.
2. Anestesiar a los animales, utilizando ketamina (100 mg / ml) / xilazina (20 mg / ml) (2: 1), ya que esto proporciona un efecto de la anestesia rápida y recuperación rápida y es óptimo para fotografiar múltiples animales.
   NOTA: La anestesia se confirmó cuando el animal es todavía suficiente para permitir la fotografía. Como los animales se recuperan de esta luz anestesia dentro de 10-15 minutos, el veterinario no ha recomendado el uso de ungüentos para los ojos.
3. Coloque los animales anestesiados en gel de imágenes en alineación vertical (tan cerca como sea posible a paralelo).
   1. Para las fotografías dorsales, colocar los animales en decúbito prono, con los miembros extendidos.
   2. Para las fotografías ventrales, colocar los animales en decúbito supino, con cuidado de que los animales no se rotan lateralmente.
4. Coloque estándar en escala de grises en la región fotografiada.
5. Cierre la puerta de acceso. Importante: La luz ambiental puede introducir variaciones en la exposición.
6. Establecer F-stop a una exposición que sitúa a la región de interés dentro del rango lineal de adquisición (lectura F-parada).
   NOTA: La mayoría de los sistemas se mostrarán donde la imagen está saturado.
7. Tome la fotografía.
8. Cambio F-parar a otro ajuste de exposición que sitúa a la región de interés dentro del rango lineal aumentando o disminuyendo la ventanilla F por 1, de manera que tanto la norma y la región de interés se mantienen en un rango lineal de adquisición (referencia F- deténgase).
9. Tome la fotografía.
10. Una vez que la fotografía se ha completado, colocar los animales en una mesa de calentamiento y monitorear hasta que puedan mantener decúbito esternal. Vuelta de los animales a sus jaulas. Devuelva el grupo de animales para el vivero, una vez que todos los animales están completamente recuperados.

2. Cuantificación de absorción de la luz

1. Marcar las regiones de interés en las imágenes de los animales utilizar el software proporcionado por imager gel.
   1. Para vista dorsal animal completo, utilice una imagen rectangular u oval que se extiende desde los miembros superiores a las extremidades inferiores, que se extiende lateralmente tanto como sea posible de tal manera que ninguna parte de la caja se extiende más allá de la parte posterior del animal, como se muestra en la Figura 1A.
      NOTA: También se podría marcar el área de interés utilizando una herramienta de dibujo a mano alzada.
   2. Para el conjunto de vista ventral animal, utilizar 2 rectángulos: uno que cubre la región pélvica y uno que cubre la zona del pecho, como se muestra en la Figura 1B.
   3. Para una región más pequeña de interés, es decir, la ubicación de la administración del fármaco, marca, según corresponda.
2. Marcos región (s) de interés en el estándar de absorción de escala de grises.
3. Absorción registro de cada una de las regiones marcadas de interés.

3. Análisis

Niveles de absorción obtained para las regiones de interés puede necesitar ser normalizados a la norma de fondo para la comparación entre las fotografías. La relación de la exposición a la absorción es log-log (es decir, la relación es lineal entre log (exposición) y log (absorción)). Usando esta relación, la absorción de la región de interés puede ser normalizado a un valor de fondo estándar, que permitirá absorciones que deben compararse directamente entre diferentes fotografías, incluidas las tomadas en diferentes puntos de tiempo (es decir, mediciones en serie dentro de un protocolo de estudio). El procedimiento para realizar estas correcciones se detalla en los pasos opcionales 3.1 y 3.2.

1. (Opcional) curva Parcela de registro (exposición) vs log (absorción) utilizando los valores obtenidos de la norma de absorción de escala de grises.
2. (Opcional) ajustar las variaciones en el nivel de cada fotografía como sigue:
   1. Seleccione F-stop para la lectura (según lo determinado en el paso 1.6) y F-stop para referencia (como se determina en sTEP 1,8).
   2. Calcular la absorción media de la norma en todas las fotografías en la lectura de F-stop. Este promedio es el estándar de referencia Valor (RSV).
   3. Calcular la diferencia en la absorción entre la lectura y de referencia configuración F-stop en cada fotografía para el estándar (delta-S) y para cada ROI definido (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
   4. Calcular la absorción corregido para cada ROI de la siguiente manera: la absorción corregida (ROI-X) = Absorción (ROI-X) en la lectura de F-stop + (RSV - absorción de la norma en la lectura de F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
3. Recopilar datos experimentales y realizar análisis de datos utilizando técnicas estadísticas estándar para las variables continuas (es decir, ANOVA, t-test).

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Resultados

Esta técnica fue validada utilizando / HeJ injertadas C3H, el modelo de ratón de la alopecia areata ^16. Estos animales desarrollan la pérdida mundial de cabello que progresa gradualmente con el tiempo. Sin embargo, la pérdida de cabello se produce en parches, y puede variar de un ratón a la siguiente, la introducción de una variabilidad considerable y obstaculizando evaluaciones cualitativas. Este modelo proporciona una oportunidad para poner a prueba las correlaciones entre las mediciones de densidad ?...

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Discusión

En este informe una descripción detallada se proporciona de una nueva técnica para la cuantificación de la pérdida de cabello en los roedores. Esta técnica utiliza un generador de imágenes de gel para la adquisición y análisis de imágenes, equipo que está fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios. Las mediciones han demostrado ser robusto a las variaciones menores en la técnica (Figuras 4 - 5), y están bien correlacionados con el grado de pérdida de cabello ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest		Greyscale standard
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study
C3H/HeJ engrafted mouse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study