Una nuova tecnica di analisi quantitativa di perdita dei capelli nei topi mediante analisi in scala di grigi

Riepilogo

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Abstract

Alopecia è una forma comune di perdita dei capelli che può verificarsi in diverse condizioni, tra cui la perdita di capelli maschile-modello, la sindrome dell'ovaio policistico, e alopecia areata. Alopecia può verificarsi anche come effetto collaterale della chemioterapia in pazienti affetti da cancro. In questo studio, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo coerente e affidabile per quantificare la perdita dei capelli nei topi, che permetterà agli investigatori di valutare con precisione e confrontare nuovi approcci terapeutici per queste varie forme di alopecia. Il metodo utilizza un imager gel standard per ottenere ed elaborare immagini di topi, misurando l'assorbimento di luce, che si verifica in proporzione agitato per la quantità di capelli nero (o grigio) sul mouse. Dati che sono stati quantificati in questo modo possono essere analizzati con tecniche statistiche standard (ad esempio, ANOVA, T-test). Questa metodologia è stata testata in modelli murini di chemioterapia-indotta alopecia, alopecia areata e alopecia da ceretta. In questo rapporto, il protocollo dettagliato è presENTED per l'esecuzione di queste misure, compresi i dati di convalida da C57BL / 6 e C3H / ceppi HeJ di topi. Questa nuova tecnica offre una serie di vantaggi, tra cui relativa semplicità di applicazione, dipendenza apparecchiature che è prontamente disponibile nella maggior parte dei laboratori di ricerca, e l'applicazione di un obiettivo, valutazione quantitativa che è più robusto di valutazioni soggettive. Miglioramenti nella quantificazione della crescita dei capelli nei topi miglioreranno studio di modelli alopecia e facilitare la valutazione di promettenti nuove terapie in studi preclinici.

Introduzione

Alopecia (perdita dei capelli) può essere un evento psicologicamente ed emotivamente angosciante con molteplici cause. Maschio-calvizie è la causa più comune di alopecia, che colpisce circa due terzi dei maschi per età 35 ^1. Un modello simile di perdita dei capelli può essere osservato nelle donne con sindrome dell'ovaio policistico. In entrambi questi disturbi, la perdita di capelli è mediata androgeni. Alopecia può verificarsi anche come una malattia autoimmune, alopecia areata, che colpisce 1,7% della popolazione ^2. Alopecia può verificarsi come un effetto collaterale di alcuni trattamenti medici, come la chemioterapia ^3. Una percentuale elevata (65-85%) dei pazienti in chemioterapia esperienza un certo grado di alopecia ^4,5. Le conseguenze psicologiche della perdita di capelli sono stati ben studiati in ambito chemioterapia. Alopecia indotta da chemioterapia può causare ansia, depressione, un'immagine negativa del corpo, abbassato l'autostima e una riduzione del senso di benessere ^6,7. Un alto percentuale (47-58%) dei pazienti oncologici femminili considerare la perdita di capelli per essere l'aspetto più traumatico della chemioterapia, e fino a 8% trattamento calo per paura di perdita di capelli ^4,6. Ci sono anche prove in alopecia androgenetica per sostenere la terapia per ridurre le conseguenze psicologiche e anche medici di perdita di capelli ^8,9. Allo stesso modo, l'alopecia areata è stato segnalato per avere gravi conseguenze psicologiche ^2, e la natura irregolare della perdita dei capelli può portare a un risultato estetico più sgradevole rispetto alla maggior parte altre cause di perdita dei capelli.

Mentre i farmaci con effetti anti-androgenici lieve (cioè, spironolattone) erano stati utilizzati con successo limitato come terapia per l'alopecia, il primo farmaco efficace per l'alopecia era minoxidil ^10. Questo antipertensivo ha un osservato effetto collaterale di causare la crescita dei capelli, ed è ora utilizzato come terapia topica per molte forme di alopecia. Tuttavia, le risposte sono spesso incomplete, con alcuni soggetti che mostra solo lentoing di perdita di capelli, piuttosto che la ricrescita reale ^10. Finasteride è un antagonista competitivo di tipo II 5α-reduttasi che blocca la conversione del testosterone in diidrotestosterone, con conseguente miglioramento della alopecia androgenetica a scapito di parziale androgeni blocco sistemico. I tassi di risposta con-lungo termine (10 anni) terapia sono circa il 50% ^11. Nel complesso, nonostante una notevole ricerca in questo settore, non c'è ancora una terapia adeguata per la perdita dei capelli.

Per decenni, gli scienziati e medici hanno esaminato i metodi di misurazione della crescita dei capelli del cuoio capelluto in studi clinici. Con lo sviluppo di farmaci che trattano alopecia, vi è stata una maggiore necessità di mezzo affidabile, economico e minimamente invasivi per misurare la crescita dei capelli e, in particolare, la risposta alla terapia. Tecnologia di analisi di immagine per una quantificazione precisa della densità dei capelli in pazienti con disturbi di perdita dei capelli ha dato risultati coerenti e validi in passato utilizzando una varietà di techniques, compresa l'analisi delle immagini digitalizzate ^12, l'analisi delle immagini di singoli peli e lesioni ¹³ della pelle, e la scansione microscopica per quantificare la massa di capelli in una regione del cuoio capelluto definita ^14.

Purtroppo, mentre le metodologie di cui sopra hanno fornito una migliore valutazione dell'efficacia per i capelli la crescita-promuovere interventi in studi clinici, questi metodi non siano state applicate a studi su roditori in studi preclinici. Il nostro obiettivo è quello di sviluppare un metodo coerente e affidabile per quantificare la perdita dei capelli nei topi, che permetterà ai ricercatori di valutare con maggiore precisione e confrontare nuovi approcci terapeutici per varie forme di alopecia. Abbiamo sviluppato una metodologia utilizzando attrezzature facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori che permetteranno la quantificazione rapida e affidabile della densità dei capelli nei topi con capelli castani o neri. Questa metodologia è stata testata in modelli murini di chemioterapia-indotta alopecia, alopecia areata, e alopecia da waxing. Un protocollo dettagliato è presentato per l'esecuzione di queste misure, compresi i dati di convalida da C57BL / 6 e C3H / ceppi HeJ di topi. Poiché questa tecnica si basa sulla rilevazione di assorbimento della luce da pigmenti nel capello, non può essere utilizzato per rilevare la crescita dei capelli in topi bianchi o topi albini.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutti gli studi che coinvolgono animali devono essere approvate dal IACUC dell'istituzione (per i dati che segue, i protocolli sono stati approvati dal Montefiore IACUC, protocollo # 11-6-240 e 13-7-100 #). Gli animali vengono forniti anestesia leggeri come indicato al solo scopo di tenerli fermi durante fotografia, non esistono procedure dolorose richieste per questo protocollo.

1. Acquisizione di fotografie

1. Impostare fuoco e campo visivo per imager gel utilizzando carta con il testo stampato. Verificare uniformità della fonte di luce in tutta regione fotografato. Per garantire l'uniformità, utilizzare un imager gel con un costruito in fonte di luce per la fotografia riflettente. Non utilizzare una fonte di luce transilluminazione, in quanto ciò creerebbe una silhouette dell'animale, che non è adatto per ulteriori analisi in scala di grigi.
   NOTA: Questo metterà il mouse leggermente fuori fuoco, che fornisce media ottica in tutta la regione di interesse (ROI) e volontàridurre gli errori quantali molto piccoli (cioè <10 pixel) regioni di interesse. Regioni più grandi d'interesse non saranno interessati da questo piccolo fuoco di regolazione, né saranno influenzati dalle differenze nelle dimensioni dell'animale.
2. Anestetizzare animali utilizzando ketamina (100 mg / ml) / xilazina (20 mg / ml) (2: 1), in quanto fornisce un rapido effetto anestesia e rapido recupero ed è ottimale per fotografare multipli animali.
   NOTA: L'anestesia è confermata quando l'animale è ancora sufficiente per permettere fotografia. Come animali in genere recuperano da questa luce anestesia entro 10-15 minuti, il veterinario non ha raccomandato l'uso di pomate oculari.
3. Inserire animali anestetizzati su gel imager in allineamento verticale (più vicino a parallelo possibile).
   1. Per le fotografie dorsali, mettere gli animali in posizione prona con gli arti estesi.
   2. Per le fotografie ventrali, mettere gli animali in posizione supina, facendo attenzione che gli animali non sono ruotati lateralmente.
4. Luogo di serie in scala di grigi nella regione fotografato.
5. Chiudere la porta di accesso. Importante: luce ambientale può introdurre variazioni di esposizione.
6. Set F-stop di un'esposizione che pone la regione di interesse all'interno della gamma lineare di acquisizione (lettura F-stop).
   NOTA: La maggior parte dei sistemi saranno visualizzare in cui l'immagine è satura.
7. Prendere fotografia.
8. Change F-Stop un'altra impostazione dell'esposizione che pone la regione di interesse all'interno del range lineare aumentando o diminuendo il F-stop da 1, tale che sia il livello e la regione di interesse rimangono in una serie lineare di acquisizione (domanda F- stop).
9. Prendere fotografia.
10. Una volta che la fotografia è completata, posizionare gli animali su un tavolo di riscaldamento e monitorare fino a che non possono mantenere decubito sternale. Animali tornare alle loro gabbie. Restituisce il gruppo di animali di vivaio una volta che tutti gli animali sono completamente recuperati.

2. Quantificazione di assorbimento della luce

1. Regioni Mark di interesse sulle immagini degli animali uso del software fornito per il gel imager.
   1. Per tutta la vista dorsale animale, utilizzare un'immagine rettangolare o ovale estende dalle arti superiori agli arti inferiori, che si estende lateralmente per quanto possibile tale che nessuna parte della scatola si estende oltre la parte posteriore dell'animale come mostrato nella Figura 1A.
      NOTA: Si potrebbe anche segnare l'area di interesse utilizzando uno strumento di disegno a mano libera.
   2. Per animale intero vista ventrale, utilizzare 2 rettangoli: coprire la regione pelvica e coprire la zona del torace come mostrato nella Figura 1B.
   3. Per una regione più piccola di interesse, vale a dire, la posizione di somministrazione del farmaco, marchio a seconda dei casi.
2. Regione Mark (s) di interesse sullo standard di assorbimento in scala di grigi.
3. Assorbimento Registrare da ciascuna delle regioni marcate di interesse.

3. Analisi

Livelli di assorbimento richiederlod per le regioni di interesse potrebbe essere necessario normalizzato allo standard di sfondo per il confronto tra le fotografie. Il rapporto di esposizione ad assorbimento è log-log (cioè, il rapporto è lineare tra log (esposizione) e di registro (assorbimento)). Con questo rapporto, l'assorbimento della regione di interesse può essere normalizzato ad un valore sfondo standard, che permetterà assorbimenti di essere confrontati direttamente tra diverse fotografie, comprese quelle prese a diversi momenti (ad esempio, le misurazioni seriali all'interno di un protocollo di studio). La procedura per l'esecuzione di queste correzioni è dettagliata in passaggi facoltativi 3.1 e 3.2.

1. (Opzionale) curva Aree log (esposizione) vs. log (assorbimento) con valori ottenuti dallo standard di assorbimento in scala di grigi.
2. (Opzionale) Regolare le variazioni di livello di ogni fotografia come segue:
   1. Selezionare F-stop per la lettura (come determinato al punto 1.6) e F-stop di riferimento (come determinato in sTep 1.8).
   2. Calcolare assorbimento medio dello standard in tutte le fotografie alla lettura F-stop. Questa media è il valore di riferimento standard (RSV).
   3. Calcolare differenza di assorbimento tra la lettura e le impostazioni di F-stop di riferimento in ogni fotografia per lo standard (delta-S) e per ogni ROI definita (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
   4. Calcolare l'assorbimento corretto per ogni ROI come segue: assorbimento corretto (ROI-X) = Assorbimento (ROI-X) a lettura F-stop + (RSV - assorbimento di serie a leggere F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
3. Compilare i dati sperimentali ed eseguire l'analisi dei dati utilizzando tecniche statistiche standard per le variabili continue (ad esempio, ANOVA, T-test).

Risultati

Questa tecnica è stata convalidata utilizzando C3H / HeJ trapiantate, il modello murino di alopecia areata ^16. Questi animali sviluppano la perdita di capelli globale che progredisce gradualmente nel tempo. Tuttavia, la perdita dei capelli avviene a chiazze, e può variare da un mouse al successivo, introducendo notevole variabilità e ostacolando valutazioni qualitative. Questo modello ha fornito l'occasione per testare le correlazioni tra misurazioni della densità ottica in diversi punti il ​​mous...

Discussione

In questo rapporto una descrizione dettagliata è dotata di una nuova tecnica per quantificare la perdita dei capelli nei roditori. Questa tecnica utilizza un imager gel per l'acquisizione delle immagini e analisi, apparecchi che è prontamente disponibile in molti laboratori. Le misurazioni hanno dimostrato di essere robusto per piccole variazioni nella tecnica (figure 4 - 5), e sono ben correlati al grado di perdita di capelli visiva in modelli di trattamento (Figura 6).

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest, http://www.imatest.com/docs/q13/		Greyscale standard
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study
C3H/HeJ engrafted mouse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study