그레이 스케일 분석을 사용하여 마우스의 탈모의 정량 분석​​을위한 새로운 기술

요약

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

초록

탈모증 남성형 탈모, 다낭성 난소 증후군, 및 원형 탈모증 등 다양한 조건에서 발생할 수있는 탈모의 일반적인 형태이다. 탈모증은 암 환자의 화학 요법의 부작용으로 발생할 수있다. 이 연구에서 우리의 목표는 연구자가 정확하게 평가하고 탈모의 이러한 다양한 형태의 새로운 치료 방법을 비교 할 수 마우스에서 탈모를 정량화 할 수있는 일관되고 신뢰할 수있는 방법을 개발하는 것이 었습니다. 방법 마우스 검정 (또는 회색) 모발의 양에 비례하여 발생 거친 광 흡수를 측정 마우스의 이미지를 획득하고 처리하는 표준 겔 이미 저를 이용한다. 이러한 방식으로 정량화 된 데이터는 표준 통계 기법 (즉, ANOVA, T 시험)을 사용하여 분석 될 수있다. 이 방법은 왁싱에서 화학 요법에 의한 탈모증, 원형 탈모증과 탈모의 마우스 모델에서 테스트되었습니다. 이 보고서에서 상세한 프로토콜 대가입니다ented 검증 C57BL / 6의 데이터와 C3H / 마우스의 HEJ 균주를 포함하여 이러한 측정을 수행합니다. 이 새로운 기술은 애플리케이션의 상대적인 단순성, 대부분의 연구 실험실에서 쉽게 사용할 장비에 의존하고 대물인가 주관적인 평가보다 더 강력하다 정량적 평가를 포함하여 다수의 이점을 제공한다. 쥐의 모발 성장의 정량화 개선 탈모증 모델의 연구를 개선하고 전임상 연구에서 유망한 새로운 치료법의 평가를 더 용이하게 할 것입니다.

서문

탈모증 (탈모)는 여러 원인으로 심리적으로 감정적으로 고통 이벤트가 될 수 있습니다. 남성 패턴 대머리는 35 세 ^1로 남성의 약 3 분의 2에 영향을 미치는 탈모의 가장 흔한 원인이다. 탈모의 유사한 패턴은 다낭성 난소 증후군을 가진 여성에서 관찰 할 수있다. 이러한 질환의 모두에서, 탈모 안드로겐 매개된다. 탈모증은 인구 ^2의 1.7 %에 영향을 미치는자가 면역 질환, 원형 탈모증으로 발생할 수 있습니다. 탈모는 화학 요법과 같은 ^세 응급 치료의 부작용으로 발생할 수있다. 화학 요법 환자의 높은 비율 (65~85%)는 탈모 ^4,5 어느 정도 경험한다. 탈모의 심리적 영향은 잘 설정 화학 요법으로 연구되어왔다. 화학 요법에 의한 탈모는 불안, 우울증, 부정적인 신체 이미지 저하 자부심과 ^6,7 복지의 축소 된 의미에서 발생할 수 있습니다. 높은 체육여성 암 환자의 rcentage (47-58%)는 화학 요법의 가장 충격적인 양상으로 탈모를 고려, 8 % 감소 치료까지 탈모 ^4,6의 두려움. 탈모 ^8,9 심리적 심지어 의료 결과를 줄이는 치료를 지원하는 안드로겐 성 탈모증의 증거가있다. 마찬가지로, 원형 탈모증은 심리적 ^영향이 심한 ^{것으로보고되었으며,} 탈모의 고르지 자연 탈모의 원인은 대부분의 다른보다 더 불쾌한 화장품 결과로 이어질 수있다.

가벼운 항 안드로겐 효과 (예, 스피로 노 락톤)와 약물이 탈모에 대한 치료와 같은 제한적인 성공에 사용 된 반면, 탈모의 첫 번째 효과적인 약물은 미녹시딜 ^{(10)이었다.} 이러한 항 고혈압은 모발 성장을 야기 관찰 부작​​용을 갖고, 이제 많은 형태의 탈모증 용 국소 요법으로서 사용된다. 그러나 반응은 일부 과목 만 느린 보여주는 종종 불완전실제 재성장 ^{(10)보다는} 탈모 보내고. 피나스테라이드 부분 전신 안드로겐 봉쇄의 비용 안드로겐 탈모증의 개선의 결과로, 디 하이드로 테스토스테론을 차단 변환 II 5α 환원 효소를 입력 할 수있는 경쟁력 길항제이다. 장기 (10 년) 치료와 응답의 비율은 약 50 % ^(11)이다. 전반적으로,이 분야에서 상당한 연구에도 불구하고, 여전히 탈모에 대한 적절한 치료가 없다.

수십 년 동안 과학자와 임상 임상 시험에서 두피 모발 성장을 측정하는 방법을 살펴 보았다. 탈모증을 치료 약물의 개발로, 모발 성장 및 치료에 특히 응답을 측정, 경제적이고 신뢰성있는 최소 침습 수단 클 필요가 있었다. 탈모 질환 환자의 머리 밀도의 정확한 정량에 대한 이미지 분석 기술은 techniqu의 다양한 사용하여 과거에 일관되고 유효한 결과를 산출디지털 이미지 ^(12)의 분석, 개별 머리카락의 이미지 분석과 피부 ⁽¹³⁾ 병변 및 정의 두피 영역 ^(14)의 머리 질량을 정량화 현미경 스캐닝을 포함하여, ES.

위의 방법은 머리가 임상 시험에서 개입을 성장 촉진 효과의 개선 된 평가를 제공하고 불행히도, 이러한 방법은 전임상 연구에서 설치류 연구에 적용되지 않았다. 우리의 목표는 연구자가보다 정확하게 평가하고 탈모의 다양한 형태에 대한 새로운 치료 방법을 비교 할 수 마우스에서 탈모를 정량화 할 수있는 일관되고 신뢰할 수있는 방법을 개발하는 것입니다. 우리는 갈색 또는 검은 색 머리를 가진 생쥐의 머리 밀도의 신속하고 신뢰할 수있는 정량을 수 있습니다 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 장비를 사용하는 방법을 개발했다. 이 방법은 waxin에서 화학 요법에 의한 탈모증, 원형 탈모증, 탈모증의 마우스 모델에서 테스트되었습니다g. 자세한 프로토콜 검증 C57BL / 6의 데이터와 C3H / 마우스의 HEJ 균주를 포함하여이 측정을 수행하기 위해 제공됩니다. 이 기술은 모간의 안료에서 광 흡수를 검출에 의존 같이, 흰색 알비노 마우스 또는 마우스에서 모발 성장을 검출하는데 사용될 수 없다.

프로토콜

윤리 문 : 동물을 포함한 모든 연구 기관의 IACUC의 승인을 받아야합니다 (다음 데이터는, 프로토콜은 몬테 피오레 IACUC, 프로토콜 번호 11-6-240 및 # 13-7-100에 의해 승인되었다). 촬영시에는 여전히 그들을 유지하기위한 목적으로 지시 된 바와 같이 동물이 빛 마취를 제공,이 프로토콜에 대한 요구되는 고통스러운 절차는 없습니다.

사진 1. 취득

1. 인쇄 된 텍스트와 종이를 사용하여 겔 이미 저에 대한보기의 설정 포커스와 필드. 촬영 지역에 걸쳐 광원의 균일 성을 확인합니다. , 균일 성을 보장 반사 사진에 대한 광원 내장 된 젤 화상 카메라를 사용하는 데 도움이. 이 더 그레이 스케일 분석에 적합하지 않은 동물의 실루엣을 만드는 것처럼, transillumination 광원을 사용하지 마십시오.
   참고 :이 약간 관심 (ROI)의 지역에 걸쳐 광학 평균을 제공한다 초점에서 마우스를 배치하고 의지합니다관심의 매우 작은 (즉, <10 픽셀) 지역에 대한 계량 적 오류를 줄일 수 있습니다. 관심 영역 확대 핀트 조정이 마이너 의해 영향을받지 않으며 동물의 크기의 차이에 의해 영향을받을 것이다.
2. 케타민 (100 ㎎ / ㎖) / 자일 라진 (xylazine) (20 ㎎ / ㎖)를 사용하여 동물을 마취 (2 : 1)이 빠른 마취 효과와 신속한 복구를 제공하고 여러 동물을 촬영에 최적으로.
   참고 : 동물이 스틸 사진을 허용하기에 충분 때 마취가 확인됩니다. 동물은 일반적으로 10 ~ 15 분 내에서이 빛 마취에서 회복으로, 수의사는 눈 연고의 사용을 권장하지 않았습니다.
3. (가까운 가능한 평행하는) 수직 정렬 젤 이미 저에 마취 동물을 놓습니다.
   1. 등의 사진의 경우, 확장 사지에 발생하기 쉬운 위치에 동물을 배치합니다.
   2. 복부 사진의 경우, 동물이 옆으로 회전되지 않습니다주의하면서 앙와위에서 동물을 배치합니다.
4. 촬영 지역의 그레이 스케일 표준을 놓습니다.
5. 닫기 액세스 도어. 중요 : 주변 광 노출의 변화를 소개 할 수 있습니다.
6. 인수의 선형 범위 내의 관심 영역을 배치 노광 F 스톱 세트 (F 스톱를 판독).
   참고 : 이미지가 포화되는 경우 대부분의 시스템이 표시됩니다.
7. 사진을 가져 가라.
8. 변경 증가 또는 그러한 표준과 관심 영역 모두 취득 (기준 직선 범위에 있도록, 1 F 스톱을 감소시켜 선형 범위 내에서 관심 영역을 배치 다른 노출 설정으로 F는 스톱 F- ) 중지합니다.
9. 사진을 가져 가라.
10. 촬영이 완료되면, 온난화 테이블에 동물을 배치하고 그들이 흉골 드러 누움을 유지 할 수있을 때까지 모니터링 할 수 있습니다. 새장에 동물을 돌려줍니다. 한 번에 모든 동물이 완전히 회복 된 동식물 사육장에 동물의 그룹을 돌려줍니다.

광 흡수 2. 정량

1. 동물의 이미지에 대한이자의 마크 영역은 젤 이미 저를위한 소프트웨어를 제공하는 사용.
   1. 전체 동물의 등쪽 뷰 가능한 횡만큼 연장되는 하부 사지 상지로부터 연장되는 직사각형 또는 타원형 이미지를 사용하도록도 1a에 도시 된 바와 같이 상자의 일부 동물의이면 넘어 연장하지 않는다.
      참고 : 하나는 또한 프리 핸드 드로잉 도구를 사용하여 관심 영역을 표시 할 수 있습니다.
   2. 골반 영역을 덮는 온 및도 1b에 도시 된 바와 같이, 가슴 부분을 커버 하나 동물 전체 뷰를 들어 복부,이 사각형을 사용한다.
   3. 적절한 관심, 즉, 약물 투여의 위치, 마크의 작은 지역.
2. 그레이 스케일 흡수 표준에 대한 관심의 표시 영역 (들).
3. 관심 표시된 영역 각각에서 기록 흡수.

3. 분석

흡수 레벨 obtaine관심 지역에 대한 D는 사진의 비교에 대한 배경 표준을 정규화해야 할 수도 있습니다. 흡수에 노출 관계는 로그 - 로그 (즉, 관계가 로그 (노광 간의 선형 임) 및 로그 (흡수))이다. 이 관계를 사용하여, 관심 영역의 흡수는 흡수도가 상이한 시점 (연구 프로토콜 내에서, 즉, 일련의 측정)에서 찍은 포함한 다른 사진 사이에 직접적으로 비교 될 수 있도록 표준 배경 값으로 정규화 될 수있다. 이러한 정정을 수행하기위한 절차는 선택적 단계 3.1 및 3.2에 설명된다.

1. 그레이 스케일 흡수 표준에서 얻은 값을 사용하여 로그 (흡수) 대 로그 (노출)의 (선택 사항) 플롯 곡선.
2. 다음 (선택 사항) 각 사진의 표준 편차를 조정합니다 :
   1. 의 결정으로 (참조 및 F 스톱 (단계 1.6에서 결정) 읽기 위해 F-중지를 선택) 1.8 TEP.
   2. 독서 F-정류장에서 모든 사진에 표준의 평균 흡수를 계산합니다. 이 평균은 참조 표준 값 (RSV)입니다.
   3. (델타 ROI-1, 델타 ROI-2 ... ..delta-ROI-X) 표준 (델타-S)에 대한 각각의 정의 ROI에 대한 각각의 사진에 읽기 및 참조 F-정지 설정 사이의 흡수의 차이를 계산
   4. 다음과 같이 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 수정 흡수를 계산 : 수정 흡수 (ROI-X) = 흡수 (ROI-X)를 읽고 F-정류장에서 + (RSV -에서 표준의 흡수 읽는 F-정지) * (델타 ROI-X / 델타-S)
3. 실험 데이터를 컴파일하고 연속 변수에 대한 표준 통계 기법을 사용하여 데이터 분석을 수행 (즉, ANOVA, T-시험).

결과

이 기술은 C3H / 마우스 개체로 이식 HEJ ¹⁶ 원형 탈모증 탈모증 마우스 모델을 이용하여 검증 하였다. 이러한 동물은 시간에 따라 서서히 진행 글로벌 탈모를 개발한다. 그러나, 탈모 패치에서 발생, 상당한 변동성을 도입하고 질적 평가를 방해 한 마우스에서 다음에 따라 달라질 수 있습니다. 이 모델은 유효성의 평가로서 마우스의 상이한 위치에서 측정 한 광학 밀도 사이의 상관 관계를 ?...

토론

이 보고서에서, 상세한 설명은 설치류 탈모 정​​량화 새로운 기술이 제공된다. 이 기술은 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 이미지 수집 및 분석, 장비 젤 이미 저를 사용합니다. 측정 기법에서 작은 변화 (도 4-5)에 강인하도록 도시되었으며, 치료 모델에서 시각적 탈모 (도 6)의 정도에 잘 상관된다. 이러한 기술들은 성공적 탈모증 ^(17)의 평가 실험 치료에 사용?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest, http://www.imatest.com/docs/q13/		Greyscale standard
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study
C3H/HeJ engrafted mouse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study