Новая технология для количественного анализа выпадения волос у мышей, используя анализ градаций серого

Резюме

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Аннотация

Выпадение волос является распространенной формой выпадения волос, которые могут возникнуть в различных условиях, в том числе мужскому типу потери волос, синдром поликистозных яичников, и очаговая алопеция. Выпадение волос может также произойти как побочный эффект химиотерапии у онкологических больных. В этом исследовании, наша цель в том, чтобы разработать последовательную и надежный метод количественного выпадения волос у мышей, которая позволит исследователям точно оценивать и сравнивать новые терапевтические подходы для этих различных форм алопеции. Метод использует стандартную тепловизор гель для получения и обработки изображений мышей, измерения поглощения света, которое происходит в грубой пропорционально количеству черного (или серый) волос на мыши. Данные, которые были количественно таким образом могут быть проанализированы с использованием стандартных статистических методов (т.е., ANOVA, T-тест). Эта методика была опробована в мышиных моделях, вызванной химиотерапией алопеция, очаговая алопеция и алопеции от воска. В этом докладе, подробная протокол пресподарил для выполнения этих измерений, в том числе данных проверки от C57BL / 6 и С3Н / штаммов Хэй мышей. Этот новый метод имеет ряд преимуществ, в том числе относительной простоте применения, опора на оборудовании, которое легко доступны в большинстве научно-исследовательских лабораторий, а также применение объективного, количественной оценки, который является более надежной, чем субъективных оценок. Улучшения в количественной роста волос у мышей улучшит изучение моделей облысения и облегчения оценки перспективных новых методов лечения в доклинических исследованиях.

Введение

Алопеция (выпадение волос) может быть психологически и эмоционально тревогу мероприятие с несколькими причинами. Облысение является наиболее распространенной причиной облысения, влияя на приблизительно две трети мужчин от 35 лет ^1. Аналогичная картина выпадения волос может наблюдаться у женщин с синдромом поликистозных яичников. В обоих этих расстройств, выпадение волос андрогенов опосредовано. Выпадение волос может также произойти как аутоиммунное заболевание, очаговая алопеция, которая влияет на 1,7% населения ^2. Выпадение волос может происходить как побочный эффект некоторых медицинских процедур, таких как химиотерапия ^3. Высокий процент (65-85%) пациентов химиотерапии испытать некоторую степень облысения ^4,5. Психологические последствия выпадения волос были хорошо изучены в условиях химиотерапии. Химиотерапия индуцированных алопеция может привести к тревожности, депрессии, отрицательным изображением тела, снижение самооценки и снижение чувства благополучия ^6,7. Высокая PErcentage (47-58%) женщин больных раком рассмотреть выпадение волос, чтобы быть наиболее травматический аспект химиотерапии, и до 8% лечения снижение из-за страха потери волос ^4,6. Существует также доказательство в андрогенной алопеции, чтобы поддержать терапии для снижения психологические и даже медицинские последствия выпадения волос ^8,9. Кроме того, гнездная алопеция, как сообщается, имеют серьезные психологические последствия ^2, и неоднородными характер потери волос, может привести к более неприятного косметического результата, чем большинство других причин потери волос.

В то время как препараты с мягким антиандрогенным эффектами (например, спиронолактон) были использованы с ограниченным успехом в качестве терапии облысения, первый эффективный препарат для алопеция миноксидил ^10. Это антигипертензивных имеет наблюдаемый побочный эффект вызывает рост волос, и в настоящее время используется в качестве местной терапии для многих форм облысения. Тем не менее, ответы часто являются неполными, а некоторые предметы, показывая только медленночисле выпадения волос, а не фактического отрастания ^10. Финастерид является конкурентным антагонистом, чтобы типа II 5α-редуктазы, который блокирует превращение тестостерона в дигидротестостерон, в результате чего улучшение андрогенной алопеции за счет частичного системной андрогенной блокады. Частота ответа с долгосрочными (10 лет) терапии около 50% ^11. В целом, несмотря на значительный исследований в этой области, до сих пор не адекватная терапия для выпадения волос.

В течение многих десятилетий ученые и клиницисты были рассмотрены методы измерения роста волос на голове в клинических испытаниях. С развитием лекарств, которые лечат облысение, было больше потребность в надежных, экономичных и минимально инвазивных средств измерения роста волос и, в частности, ответ на терапию. Технология анализа изображения для точного количественного определения плотности волос у пациентов с расстройствами потери волос дали последовательные и достоверные результаты в прошлом, используя различные techniquES, в том числе анализа оцифрованных изображений ^12, анализа изображений отдельных волосков и повреждений кожи ¹³ и микроскопического сканирования для количественной массы волос в определенной головы области ^14.

К сожалению, в то время как выше методологии при условии, повысить эффективность оценки эффективности для роста волос, способствующих вмешательства в клинических испытаниях, эти методы не были применены к исследованиях на грызунах в доклинических исследованиях. Наша цель состоит в том, чтобы разработать последовательную и надежный метод количественного выпадения волос у мышей, которая позволит исследователям более точно оценить и сравнить новые терапевтические подходы для различных форм алопеции. Мы разработали методику, используя оборудование легко доступны в большинстве лабораторий, которые позволят быстро и надежно количественно оценить плотность волос у мышей с коричневым или черным волосам. Эта методика была опробована в мышиных моделях, вызванной химиотерапией алопеция, очаговая алопеция и алопеции от waxinг. Подробный протокол представлен для выполнения этих измерений, в том числе данных проверки от C57BL / 6 и С3Н / штаммов Хэй мышей. Как этот метод основан на обнаружении поглощения света от пигментов в стержне волоса, он не может быть использован для обнаружения роста волос на белых мышах или белых мышей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

О себе Этика: Все исследования с участием животных, должны быть одобрены IACUC учреждения (для данных, которые следует протоколы были одобрены Монтефиоре IACUC, протокол # 11-6-240 и # 13-7-100). Животные обеспечены легкой анестезией, как указано с единственной целью сохранения их еще в течение фотографии, нет болезненных процедур, необходимых для этого протокола.

1. Приобретение фотографий

1. Установить фокус и поле зрения для геля тепловизора Использование бумаги с напечатанным текстом. Проверьте равномерность источника света через сфотографировали регионе. Чтобы обеспечить единообразие, используйте гель камера с встроенным источником света для отражающей фотографии. Не используйте просвечивание источник света, так как это создаст силуэт животного, которые не подходят для дальнейшего оттенках серого анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это поместит курсор немного не в фокусе, которая обеспечивает оптический усреднение по области интереса (ROI) и будетпомочь уменьшить квантовых ошибок для очень маленьких (например, <10 пикселей) областях, представляющих интерес. Большие регионах, представляющих интерес не будет зависеть от этого минора Фокусировка, и они не будут влиять различия в размерах животного.
2. Обезболить животных с помощью кетамина (100 мг / мл) / ксилазина (20 мг / мл) (2: 1), так как это обеспечивает быстрый эффект анестезии и быстрое восстановление и является оптимальным для съемки нескольких животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия подтверждается, когда животное еще достаточно, чтобы позволить фотографии. Как животные, как правило, оправиться от этого света анестезии в течение 10-15 мин, ветеринар не рекомендуется применение глазных мазей.
3. Поместите наркотизированных животных на гелевой тепловизора на одной вертикальной линии (как можно ближе к параллельным, как это возможно).
   1. Для спинных фотографий, размещать животных в положении лежа с конечностей продлен.
   2. Для вентральной фотографий, размещать животных в положении лежа на спине, заботясь о том, что животные не вбок поворачивается.
4. Поместите в оттенках серого стандарт в сфотографировали регионе.
5. Закрыть дверцу. Важно: Окружающий свет может ввести изменения в экспозиции.
6. Установите F-стоп на экспозиции, которая ставит область интереса в пределах линейного диапазона приобретения (чтение F-стоп).
   Примечание: В большинстве систем будет отображать, где изображение является насыщенным.
7. Возьмите фотографию.
8. Изменить F-стоп на другой экспозицией, которая ставит область интереса в пределах линейного диапазона путем увеличения или уменьшения F-стоп на 1, так что оба стандарта и область интереса оставаться в линейном диапазоне приобретения (ссылка F- стоп).
9. Возьмите фотографию.
10. После того, как съемка завершена, помещайте животных на столе потепления и контролировать, пока они не могут поддерживать грудины лежачее положение. Вернуться животных в их клетки. Возвращает группу животных в виварии, когда все животные были полностью восстановлены.

2. Количественная оценка поглощения света

1. Все регионы интерес на изображениях животных использовании прилагаемого программного обеспечения для геля томографа.
   1. Для всей зрения животного спинной, использовать прямоугольную или овальную изображение, проходящую от верхних конечностей в нижних конечностей, расширение в поперечном направлении как можно больше, так что ни одна часть коробки не выходит за пределы задней части животного, как показано на фиг.1А.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно также отметить сферу интересов с помощью свободной руки инструмент для рисования.
   2. Для целого животного брюшной зрения, использовать 2 прямоугольника: один, охватывающий область таза и один, охватывающий область грудной клетки, как показано на рисунке 1В.
   3. Для меньших области интереса, т.е. месте введения препарата, марки по мере необходимости.
2. Отметить область (области) процентов по оттенках серого стандарта поглощения.
3. Запись поглощения от каждого из отмеченных областей, представляющих интерес.

3. Анализ

Уровни поглощения obtaineд для регионов интереса возможно, должны быть нормализованы к фоновому стандарта для сравнения фотографий. Отношения воздействия поглощения логарифмическая (т.е. отношения линейный между журнала (облучения) и войти (поглощение)). Используя эту связь, поглощение интересующей области могут быть нормализованы к стандартному фонового значения, что позволит поглощения непосредственно сравнивать между различными фотографиями, в том числе приняты в различные моменты времени (то есть, серийные измерений в пределах протокола исследования). Процедура выполнения этих поправок, подробно изложены в дополнительных шагов 3,1 и 3,2.

1. (Необязательно) Земельный участок кривой журнала (воздействия) против журнала (поглощения), используя значения, полученные из оттенков серого стандарта поглощения.
2. (Необязательно) Установите для вариациям в стандарте каждой фотографии выглядит следующим образом:
   1. Выберите F-стоп для чтения (как определено на этапе 1.6) и F-стоп при условии ссылки (как определено в стТеп 1,8).
   2. Рассчитать среднюю абсорбцию стандарта во всех фотографиях в читальном F-стоп. Это среднее Ссылка на стандарт стоимость (RSV).
   3. Рассчитать разницу в поглощении между чтением и справочных параметров F-стоп на каждой фотографии для стандарта (дельта-S) и для каждого определенного ROI (дельта-ROI-1, дельта-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
   4. Расчета скорректированного поглощения для каждого ROI следующим образом: Скорректированная поглощения (ROI-X) = Поглощение (ROI-X) при чтении F-Stop + (RSV - поглощение стандарта при чтении F-стоп) * (дельта-ROI-X / дельта-S),
3. Компиляция экспериментальных данных и выполнять анализ данных с помощью стандартных статистических методов для непрерывных переменных (т.е., ANOVA, T-тест).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Эта методика была проверена с помощью C3H / HeJ привитых мышей, модель мыши очаговая алопеция ^16. Эти животные развивать глобальную потерю волос, которая прогрессирует постепенно с течением времени. Тем не менее, потеря волос происходит в участках, и может варьироваться от одной мыши ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом докладе подробно рассказывается в новой методики для количественного выпадения волос у грызунов. Эта методика использует гель формирования изображения для получения и анализа изображений, оборудование, которые легко доступны в большинстве лабораторий. Измерения показали, что...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest		Greyscale standard
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study
C3H/HeJ engrafted mouse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study