טכניקה חדשה לניתוח כמותי של נשירת שיער בעכברים באמצעות ניתוח גווני אפור

Summary

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Abstract

Alopecia הוא צורה נפוצה של נשירת שיער אשר יכול להתרחש בתנאים רבים ושונים, לרבות אובדן זכר-דפוס שיער, תסמונת שחלות פוליציסטיות, וalopecia areata. Alopecia יכול להתרחש גם כתופעת לוואי של כימותרפיה בחולי סרטן. במחקר זה, המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה עקבית ואמינה לכמת נשירת שיער בעכברים, שיאפשר לחוקרים להעריך באופן מדויק ולהשוות גישות טיפוליות חדשות לאלה צורות שונות של התקרחות. השיטה משתמשת תרמי ג'ל סטנדרטי להשיג ותהליך תמונות של עכברים, מדידת קליטת האור, אשר מתרחשת בחלק מחוספס לכמות שיער שחור (או אפור) על העכבר. נתונים שכבר לכמת באופן זה אז יכול להיות מנותח באמצעות טכניקות סטטיסטיות סטנדרטיים (כלומר, ANOVA, T-test). מתודולוגיה זו נבדקה במודלים של עכברים של התקרחות בעקבות כימותרפיה, areata התקרחות ונשירת שיער מהשעווה. בדוח זה, הפרוטוקול מפורט הוא פרהented לביצוע מדידות אלה, ובכלל זה נתונים אימות מC57BL / 6 וC3H / זני HeJ של עכברים. טכניקה חדשה זו מציעה מספר היתרונות, ביניהם פשטות היחסית של יישום, הסתמכות על ציוד שהוא זמין ברוב מעבדות מחקר, ומיישום מטרה, הערכה כמותית שהוא יותר חזק מאשר הערכות סובייקטיביות. השיפורים בכימות של צמיחת שיער בעכברים ישפרו מחקר של מודלים התקרחות ולהקל על הערכה של טיפולים חדשים ומבטיחים בניסויים פרה-קליניים.

Introduction

Alopecia (נשירת שיער) יכול להיות אירוע נפשי ורגשי מצער עם גורמים רבים. התקרחות גברית-תבנית היא הגורם השכיח ביותר של התקרחות, המשפיע על כשני שלישים מהגברים בגיל 35 ^1. דפוס דומה של אובדן שיער יכול להיות שנצפה בנשים עם תסמונת שחלות פוליציסטיות. בשתי הפרעות אלו, נשירת השיער היא אנדרוגן בתיווך. Alopecia יכול להתרחש גם כמחלה אוטואימונית, alopecia areata, אשר משפיעה על 1.7% מכלל האוכלוסייה ^2. Alopecia יכול להתרחש כתופעת לוואי של כמה טיפולים רפואיים, כגון כימותרפיה ^3. אחוז גבוה (65-85%) של חולי כימותרפיה חוויה מסוים של התקרחות ^4,5. ההשלכות הפסיכולוגיות של אובדן שיער נחקרו היטב בהגדרת כימותרפיה. התקרחות בעקבות כימותרפיה יכולה לגרום לחרדה, דיכאון, דימוי גוף שלילי, הערכה עצמית נמוכה ותחושה של רווחה ^6,7 מופחתת. Pe גבוהrcentage (47-58%) של חולי סרטן נשיים לשקול נשירת שיער להיות ההיבט הטראומתי ביותר של כימותרפיה, ועד טיפול ירידה של 8% מחשש ^ל4,6 נשירת שיער. יש גם עדויות בהתקרחות אנדרוגנית לתמוך טיפול להפחתת השלכות פסיכולוגיות ואפילו רפואיות של ^8,9 נשירת שיער. כמו כן, אלופציה אריאטה דווחה להיות השלכות פסיכולוגיות קשות ^2, ואת האופי אחיד של נשירת השיער יכול להוביל לתוצאה קוסמטית לא נעימות, יותר מרוב הגורמים אחרים לנשירת שיער.

בעוד תרופות עם השפעות מתונות אנטי-אנדרוגנית (כלומר, ספירונולקטון) היו בשימוש עם הצלחה מוגבלת כטיפול להתקרחות, התרופה היעילה הראשונה להתקרחות מינוקסידיל הייתה ^10. יש להורדת לחץ דם זה תופעות לוואי שנצפה בגרימת צמיחת שיער, ועכשיו משמשת כטיפול מקומי לצורות רבות של התקרחות. עם זאת, תגובות הן לעתים קרובות לא שלמות, עם כמה נושאים המראים רק איטיing של נשירת שיער ולא לצמיחה מחודשת בפועל ^10. פינסטריד הוא אנטגוניסט תחרותי להקליד השני 5α-רדוקטאז שהמרה בלוקים של טסטוסטרון לדיהידרוטסטוסטרון, וכתוצאה מכך השיפור בהתקרחות אנדרוגנית על חשבון מצור אנדרוגן המערכתי חלקי. שיעורי תגובה עם טווח ארוך טיפול (10 שנים) הם סביב 50% ^-11. בסך הכל, למרות מחקר רב בתחום זה, עדיין אין טיפול הולם לנשירת שיער.

במשך עשרות שנים, מדענים ורופאים בחנו את שיטות של מדידת צמיחת שיער קרקפת בניסויים קליניים. עם התפתחותה של תרופות המטפלות בהתקרחות, חל צורך גדול יותר באמצעי אמין, חסכוני ופולשנית למדידת צמיחת שיער ו, במיוחד, תגובה לטיפול. טכנולוגית ניתוח תמונה לכימות מדויק של צפיפות שיער בחולים עם הפרעות נשירת שיער הניבה תוצאות עקביות ותקפה בעבר תוך שימוש במגוון של techniques, כולל ניתוח של תמונות דיגיטציה ^12, ניתוח תמונה של שערות בודדות ועור נגעים ^13, וסריקה מיקרוסקופית לכמת המוני שיער באזור קרקפת מוגדר ^14.

למרבה הצער, בעת מתודולוגיות מעל סיפקו הערכה משופרת של יעילות לשיער צמיחה-קידום התערבויות בניסויים קליניים, שיטות אלה לא הוחלו על מחקרים במכרסמים בחקירות פרה-קליניים. המטרה שלנו היא לפתח שיטה עקבית ואמינה לכמת נשירת שיער בעכברים, שיאפשר לחוקרים להעריך בצורה מדויקת יותר ולהשוות גישות טיפוליות חדשות לצורות שונות של התקרחות. פיתחנו מתודולוגיה שימוש בציוד זמין ברוב המעבדות אשר תאפשר כימות מהיר ואמין של צפיפות שיער בעכברים עם שיער שחור או חום. מתודולוגיה זו נבדקה במודלים של עכברים של התקרחות בעקבות כימותרפיה, alopecia areata, והתקרחות מwaxing. פרוטוקול מפורט מוצג לביצוע מדידות אלה, ובכלל זה נתונים אימות מC57BL / 6 וC3H / זני HeJ של עכברים. כטכניקה זו מסתמכת על גילוי קליטת אור מפיגמנטים בשערה, זה לא יכול לשמש כדי לזהות את צמיחת שיער בעכברים לבנים או עכברים לבקן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל המחקרים שכללו בעלי חיים חייבים להיות מאושרים על ידי IACUC של המוסד (לנתונים העוקב, פרוטוקולים אושרו על ידי מונטיפיורי IACUC, פרוטוקול # 11-6-240 ו# 13-7-100). בעלי חיים מסופקים הרדמה אור כפי שצוינו למטרה הבלעדית של שמירה עליהם עדיין בצילום, אין נהלים כואבים הנדרשים לפרוטוקול זה.

1. רכישת תמונות

1. קבע את מוקד ושדה הראייה לתרמי ג'ל משתמש בנייר עם טקסט מודפס. ודא אחידות של מקור אור על פני אזור מצולם. כדי להבטיח אחידות, להשתמש תרמי ג'ל עם שנבנה במקור אור לצילום רעיוני. אל תשתמש במקור אור שקוף, כמו זה ליצור צללית של החיה שאינה מתאים לניתוח בגווני אפור נוסף.
   הערה: זה יהיה מקום העכבר קצת מחוץ לפוקוס, המספק מיצוע אופטי על פני האזור של העניין (ROI) ולעזור להפחית את שגיאות quantal לאזורים (כלומר, <10 פיקסל) קטנים מאוד של עניין. אזורים גדולים יותר של ריבית לא יושפעו על ידי קטין זה מתמקד התאמה, לא יהיה להם להיות מושפע מהבדלים בגודל של החיה.
2. להרדים בעלי חיים באמצעות קטמין (100 מ"ג / מיליליטר) / xylazine (20 מ"ג / מיליליטר) (2: 1), כפי שזה מספק השפעת הרדמה מהירה והתאוששות מהירה ואופטימלי לצילום בעלי חיים רבים.
   הערה: הרדמה הוא אישר כאשר החיה היא עדיין מספיק כדי לאפשר צילום. כבעלי חיים בדרך כלל להתאושש מההרדמה האור הזה בתוך 10-15 דקות, הווטרינר לא מומלץ שימוש במשחות עיניים.
3. הנח בעלי חיים הרדימו על תרמי ג'ל ביישור אנכי (קרוב במקביל ככל האפשר).
   1. לצילומי גב, הנח את בעלי החיים במצב שכיבה עם גפיים מורחבים.
   2. לצילומי הגחון, למקם את בעלי חיים במצב שכיבה, דואג שבעלי החיים לא מסובבים רוחבי.
4. הנח סטנדרטי בגווני אפור באזור מצולם.
5. דלת גישה קרובה. החשוב: Ambient אור יכול להציג את השינויים בחשיפה.
6. הגדר F-stop לחשיפה המעמידה את האזור של עניין בטווח ליניארי של רכישה (קריאת F-stop).
   הערה: רוב המערכות תציג בי התמונה רוויה.
7. קח תמונה.
8. שינוי F-להפסיק להגדרת חשיפה נוספת המעמידה את האזור של עניין בטווח ליניארי על ידי הגדלת או הקטנת F-stop על ידי 1, כך ששניהם הסטנדרטי באזור של עניין ולהישאר בטווח ליניארי של רכישה (התייחסות F- לעצור).
9. קח תמונה.
10. ברגע צילום הושלם, למקם את בעלי החיים על שולחן התחממות ולעקוב אחר עד שהם יכולים לשמור על כיבו sternal. חזור חיות בכלובים שלהם. להחזיר את הקבוצה של בעלי חיים לביבר לאחר שכל בעלי החיים התאוששו באופן מלא.

2. כימות קליטת אור

1. אזורי מארק ריבית על התמונות של בעלי החיים באמצעות סיפקו תוכנה לתרמי ג'ל.
   1. להשקפת גב חיה שלמה, להשתמש בתמונה מלבנית או סגלגלה המשתרעת מהגפיים העליונים לגפיים התחתונים, המשתרעת לרוחב ככל האפשר כך ששום חלק של התיבה חורגת האחורי של בעלי החיים, כפי שמוצג באיור 1 א.
      הערה: אפשר גם לסמן את השטח של עניין באמצעות כלי ציור ביד חופשית.
   2. לתצוגת הגחון בעלי חיים שלמה, להשתמש 2 מלבנים: אחד המכסה את אזור אגן ואחד המכסה את אזור החזה, כפי שמוצג באיור 1 ב.
   3. לאזור קטן יותר של עניין, כלומר, מיקום של מתן תרופה, סימן כמתאים.
2. מארק אזור (ים) של ריבית על תקן קליטה בגווני אפור.
3. שיא קליטה מכל אחד מהאזורים המסומנים של עניין.

3. ניתוח

obtaine רמות הקליטהד לאזורים של עניין ייתכן שיהיה הצורך מנורמל לסטנדרטי רקע להשוואה בין צילומים. מערכת היחסים של חשיפה לקליטה הוא לוג-לוג (כלומר, מערכת היחסים הוא ליניארי בין יומן (חשיפה) ולהיכנס (קליטה)). שימוש במערכת יחסים זו, הקליטה של האזור של עניין יכולה להיות מנורמלת לערך רקע סטנדרטי, אשר יאפשר קליטה להשוואה ישירה בין תמונות שונות, כוללים אלה שצולמו בנקודות זמן שונות (כלומר, מדידות סידוריים בתוך פרוטוקול מחקר). ההליך לביצוע תיקונים אלה מפורט בשלבים אופציונליים 3.1 ו -3.2.

1. עקומה (אופציונלית) מגרש של יומן (חשיפה) לעומת יומן (קליטה) תוך שימוש בערכים המתקבלים מתקן קליטה בגווני אפור.
2. (אופציונאלי) כוון לוריאציות ברמת כל תצלום כדלקמן:
   1. בחר F-stop לקריאה (כפי שנקבע בשלב 1.6) ו- F-stop להתייחסות (כפי שנקבע בסעיףTEP 1.8).
   2. לחשב קליטה ממוצעת של סטנדרטי בכל התמונות בF-להפסיק לקרוא. ממוצע זה הוא התייחסות תקן הערך (RSV).
   3. לחשב הבדל בקליטה בין הקריאה והגדרות F-stop התייחסות בכל תצלום לסטנדרטי (דלתא-S) ולכל ROI המוגדר (דלתא-ROI-1, דלתא-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
   4. לחשב את הספיגה המתוקנת לכל החזר על השקעה באופן הבא: קליטה מתוקנת (ROI-X) = קליטה (ROI-X) בקריאת F-stop + (RSV - קליטה סטנדרטית בקריאת F-stop) * (דלתא-ROI-X / דלתא-S)
3. לקמפל נתוני ניסוי ולבצע ניתוח נתונים תוך שימוש בטכניקות סטטיסטיות סטנדרטית למשתנים רציפים (כלומר, ANOVA, T-test).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

טכניקה זו קיבלה תוקף באמצעות C3H / עכברים HeJ engrafted, מודל העכבר של אלופסיה ^16. בעלי חיים אלה לפתח נשירת שיער בעולם, אשר מתקדמת בהדרגה לאורך זמן. עם זאת, נשירת השיער מתרחשת בטלאים, ועשויה להשתנות מעכבר אחד למשנהו, מציגה השתנות ניכרת ופוגעת הערכות איכותיות. מודל זה סיפק ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בדוח זה תיאור מפורט מסופק בטכניקה חדשה לכימות נשירת שיער במכרסמים. טכניקה זו מנצלת תרמי ג'ל לרכישת תמונה וניתוח, ציוד שהוא זמין ברוב המעבדות. המדידות הוכחו להיות חזק כדי שינויים קלים בטכניקה (איורים 4-5), ומתואמים היטב לדרגת אובדן ראייה שיער במודלים של טיפול...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest		Greyscale standard
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study
C3H/HeJ engrafted mouse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study