Une nouvelle technique pour l'analyse quantitative de la perte de cheveux chez la souris Utilisation de l'analyse des niveaux de gris

Résumé

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Résumé

L'alopécie est une forme courante de perte de cheveux qui peut se produire dans de nombreuses conditions différentes, y compris le dessin male perte de cheveux, le syndrome des ovaires polykystiques, et la pelade. L'alopécie peut également se produire comme un effet secondaire de la chimiothérapie chez les patients cancéreux. Dans cette étude, notre objectif était de développer une méthode cohérente et fiable de quantifier la perte de cheveux chez la souris, ce qui permettra aux enquêteurs d'évaluer et de comparer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces différentes formes d'alopécie précision. Le procédé utilise un imageur de gel standard pour obtenir des images et le processus de souris, mesurant l'absorption de lumière, qui se produit en proportion approximative de la quantité de cheveux noir (ou gris) sur la souris. Les données qui ont été quantifiés de cette manière peuvent ensuite être analysés en utilisant des techniques statistiques standard (ce est à dire, analyse de la variance, T-test). Cette méthodologie a été testée dans des modèles murins de l'alopécie induite par la chimiothérapie, la pelade et l'alopécie de l'épilation. Dans ce rapport, le protocole détaillé est presENTED pour effectuer ces mesures, y compris les données de validation de C57BL / 6 et C3H / HeJ souches de souris. Cette nouvelle technique offre un certain nombre d'avantages, y compris relative simplicité d'application, le recours à l'équipement qui est facilement disponible dans la plupart des laboratoires de recherche, et en appliquant une évaluation objective et quantitative qui est plus robuste que les évaluations subjectives. L'amélioration de la quantification de la croissance des cheveux chez la souris permettra d'améliorer l'étude des modèles de l'alopécie et de faciliter l'évaluation de nouveaux traitements prometteurs dans les études précliniques.

Introduction

Alopécie (perte de cheveux) peut être un événement psychologiquement et émotionnellement pénible aux causes multiples. Homme-calvitie est la cause la plus commune de l'alopécie, affectant environ deux tiers des hommes de 35 ans ^1. Une tendance similaire de la perte de cheveux peut être observée chez les femelles présentant un syndrome des ovaires polykystiques. Dans ces deux troubles, la perte de cheveux est médiée androgène. Alopécie peut également se produire comme une maladie auto-immune, la pelade, qui touche 1,7% de la population ^2. L'alopécie peut se produire comme un effet secondaire de certains traitements médicaux, tels que la chimiothérapie ^3. Un pourcentage élevé (65-85%) des patients en chimiothérapie expérience dans une certaine mesure de l'alopécie ^4,5. Les conséquences psychologiques de la perte de cheveux ont été bien étudiés dans le cadre de la chimiothérapie. Alopécie induite par la chimiothérapie peut entraîner de l'anxiété, la dépression, une image négative de leur corps, réduit l'estime de soi et un sentiment réduite de bien-être ^6,7. Une haute peourcentage (47-58%) des patients atteints de cancer chez les femmes considèrent la perte de cheveux à l'aspect le plus traumatisant de la chimiothérapie, et jusqu'à 8% de baisse de traitement par crainte de la perte de cheveux ^4,6. Il existe également des preuves dans l'alopécie androgénique pour soutenir thérapie pour réduire les conséquences psychologiques et même médicaux de perte de cheveux ^8,9. De même, la pelade a été signalé à avoir des conséquences psychologiques graves ^2, et de la nature inégale de la perte de cheveux peut conduire à un résultat esthétique plus désagréable que la plupart des autres causes de perte de cheveux.

Alors que les médicaments ayant des effets anti-androgènes doux (ce est à dire, la spironolactone) avaient été utilisées avec un succès limité comme traitement pour l'alopécie, le premier médicament efficace pour l'alopécie était minoxidil ^10. Ce antihypertenseur a un effet secondaire observé de provoquer la croissance des cheveux, et est maintenant utilisé comme traitement topique pour de nombreuses formes d'alopécie. Cependant, les réponses sont souvent incomplets, certains sujets ne montrant que lentetion de la perte de cheveux plutôt que ¹⁰ repousse réel. Le finastéride est un antagoniste compétitif de taper II 5α-réductase qui bloque la conversion de testostérone en dihydrotestostérone, résultant en des améliorations dans l'alopécie androgénique au détriment de blocage androgénique partielle systémique. Les taux de réponse avec à long terme (10 ans) thérapie sont environ 50% ^11. Globalement, malgré des recherches considérables dans ce domaine, il n'y a toujours pas de thérapie adéquate pour la perte de cheveux.

Pendant des décennies, les scientifiques et les cliniciens ont examiné les méthodes de mesure de la croissance de cheveux de cuir chevelu dans les essais cliniques. Avec le développement de médicaments utilisés pour traiter l'alopécie, on a un besoin accru de moyens fiables, économiques et peu invasive de mesure de la croissance des cheveux et, plus particulièrement, la réponse au traitement. Image en technologie d'analyse pour une quantification précise de la densité des cheveux chez les patients présentant des troubles de perte de cheveux a abouti à des résultats cohérents et valables dans le passé en utilisant une variété de techniques, y compris l'analyse des images numérisées ^12, analyse de l'image de poils individuels et les lésions ¹³ peau, et le balayage au microscope à quantifier la masse de cheveux dans une région du cuir chevelu ¹⁴ défini.

Malheureusement, alors que les méthodes ci-dessus ont permis d'améliorer l'évaluation de l'efficacité pour les cheveux favorisant la croissance interventions dans les essais cliniques, ces méthodes ne ont pas été appliquées aux études sur les rongeurs dans les études précliniques. Notre objectif est de développer une méthode cohérente et fiable de quantifier la perte de cheveux chez la souris, ce qui permettra aux enquêteurs d'évaluer et de comparer de nouvelles approches thérapeutiques pour diverses formes d'alopécie plus de précision. Nous avons développé une méthodologie utilisant des équipements facilement disponibles dans la plupart des laboratoires qui permettront quantification rapide et fiable de la densité des cheveux chez la souris avec des cheveux bruns ou noirs. Cette méthodologie a été testée dans des modèles murins de l'alopécie induite par la chimiothérapie, la pelade, l'alopécie et de Waxing. Un protocole détaillé est présenté pour l'exécution de ces mesures, y compris les données de validation de C57BL / 6 et C3H / HeJ souches de souris. Comme cette technique repose sur la détection de l'absorption de lumière à partir de pigments dans la tige du cheveu, il ne peut être utilisé pour détecter la croissance des cheveux chez les souris blanches ou des souris albinos.

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Protocole

Déclaration éthique: Toutes les études portant sur des animaux doivent être approuvés par le IACUC de l'institution (pour les données qui suivent, les protocoles ont été approuvés par le IACUC Montefiore, le protocole # 11-6-240 et 13-7-100 #). Les animaux sont fournis anesthésie légère comme indiqué dans le seul but de les garder encore pendant la photographie, il n'y a pas de procédures douloureuses requises pour ce protocole.

1. Acquisition de Photographies

1. Mise au point et le champ de vision pour imageur de gel en utilisant du papier avec du texte imprimé. Vérifiez uniformité de source de lumière à travers la région photographiée. Pour assurer l'uniformité, utiliser un imageur de gel avec un construit en source de lumière pour la photographie réfléchissante. Ne pas utiliser une source de lumière de transillumination, car cela créerait une silhouette de l'animal qui est impropre à une analyse plus approfondie en niveaux de gris.
   NOTE: Ceci placera la souris légèrement floue, qui fournit moyenne optique à travers la région d'intérêt (ROI) et la volontéaider à réduire les erreurs quantiques pour les très petites régions (c.-à-<10 pixels) d'intérêt. Grandes régions d'intérêt ne seront pas affectés par cette mineure réglage de la focalisation, ils ne seront pas affectées par les différences dans la taille de l'animal.
2. Anesthésier des animaux à l'aide de kétamine (100 mg / ml) / xylazine (20 mg / ml) (2: 1), cela fournit l'effet de l'anesthésie rapide et une récupération rapide et est optimal pour photographier plusieurs animaux.
   NOTE: L'anesthésie est confirmé lorsque l'animal est encore assez pour permettre la photographie. Comme les animaux récupèrent de cette lumière dans l'anesthésie 10-15 min, le vétérinaire n'a pas recommandé l'utilisation de pommades ophtalmiques.
3. Placer sur les animaux anesthésiés imageur gel en alignement vertical (aussi près que possible parallèle).
   1. Pour les photographies dorsales, placer les animaux en décubitus ventral avec des membres étendus.
   2. Pour les photographies ventrales, placer les animaux dans la position couchée, en prenant soin que les animaux ne sont pas pivoté latéralement.
4. Placez norme niveaux de gris dans la région photographiée.
5. Fermer la porte d'accès. Important: La lumière ambiante peut introduire des variations dans l'exposition.
6. Réglez F-stop à une exposition qui place la région d'intérêt au sein de la gamme linéaire de l'acquisition (lecture F-stop).
   REMARQUE: La plupart des systèmes afficher où l'image est saturée.
7. Prenez la photo.
8. Changer F-stop à un autre réglage de l'exposition qui place la région d'intérêt au sein de la gamme linéaire en augmentant ou en diminuant le F-stop par une, de sorte que tant la norme et la région d'intérêt restent dans une plage linéaire d'acquisition (référence F arrêtez).
9. Prenez la photo.
10. Une fois que la photographie est terminé, placer les animaux sur une table de réchauffement et de suivre jusqu'à ce qu'ils puissent maintenir décubitus sternal. Retour animaux dans leurs cages. Remettre le groupe d'animaux le vivarium fois tous les animaux sont complètement rétablis.

2. Quantification de l'absorption de lumière

1. Marquer les régions d'intérêt sur les images des animaux avec le logiciel fourni pour le gel imageur.
   1. Pour toute vue dorsale de l'animal, utiliser une image rectangulaire ou ovale se étendant à partir des membres supérieurs aux membres inférieurs, se étendant latéralement autant que possible de telle sorte qu'aucune partie de la boîte se étend au-delà du dos de l'animal, comme illustré sur la figure 1A.
      NOTE: On peut aussi marquer la zone d'intérêt en utilisant un outil de dessin à main levée.
   2. Pour animal entier vue ventrale, utiliser deux rectangles: l'un couvrant la région pelvienne et une couvrant la région de la poitrine comme le montre la figure 1B.
   3. Pour une plus petite région d'intérêt, ce est à dire, l'emplacement de l'administration du médicament, marque le cas échéant.
2. Mark région (s) d'intérêt sur la norme d'absorption en niveaux de gris.
3. l'absorption d'enregistrement de chacune des régions marquées d'intérêt.

3. Analyse

les niveaux d'absorption obtained pour les régions d'intérêt peut avoir besoin d'être normalisée à la norme de référence pour la comparaison entre les photographies. La relation entre l'exposition à l'absorption est logarithmique (ce est à dire, la relation est linéaire entre log (exposition) et log (absorption)). En utilisant cette relation, l'absorption de la région d'intérêt peut être normalisée à une valeur de référence standard, ce qui permettra absorptions à être comparées directement entre les différentes photographies, y compris celles qui sont prises à des moments différents (par exemple, des mesures en série au sein d'un protocole de l'étude). La procédure pour effectuer ces corrections est détaillé dans des étapes facultatives 3.1 et 3.2.

1. (Facultatif) courbe de Terrain de log (exposition) en fonction de log (absorption) en utilisant les valeurs obtenues à partir de la norme d'absorption en niveaux de gris.
2. (Facultatif) Réglez les variations dans le niveau de chaque photographie comme suit:
   1. Sélectionnez F-stop pour la lecture (tel que déterminé dans l'étape 1.6) et F-stop pour référence (tel que déterminé à sTep 1,8).
   2. Calculer absorption moyenne de la norme dans toutes les photographies à la lecture F-stop. Cette moyenne est la Valeur de référence standard (RSV).
   3. Calculer différence d'absorption entre la lecture et de référence réglages F-stop dans chaque photographie pour la norme (delta-S) et pour chaque ROI définie (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
   4. Calculer l'absorption corrigé pour chaque ROI comme suit: absorption corrigé (ROI-X) = Absorption (ROI-X) pour lire les F-stop + (RSV - absorption de la norme à lecture F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
3. Compiler les données expérimentales et effectuer des analyses de données en utilisant des techniques statistiques standard pour les variables continues (c.-à-ANOVA, T-test).

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Résultats

Cette technique a été validée à l'aide souris C3H / HeJ greffées, le modèle murin de la pelade ^16. Ces animaux développent la perte de cheveux mondiale qui progresse graduellement avec le temps. Cependant, la perte de cheveux survient chez des correctifs, et peut varier d'une souris pour la prochaine, en introduisant une variabilité considérable et entrave les évaluations qualitatives. Ce modèle a permis de tester les corrélations entre les mesures de la densité optique à différents end...

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Discussion

Dans ce rapport, une description détaillée est fournie d'une nouvelle technique pour quantifier la perte de cheveux chez les rongeurs. Cette technique utilise un imageur gel d'acquisition d'images et d'analyse, un équipement qui est facilement disponible dans la plupart des laboratoires. Les mesures ont été montrés pour être robuste aux variations mineures dans la technique (figures 4-5), et sont bien en corrélation avec le degré de perte de cheveux visuelle dans des modèles de...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest		Greyscale standard
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study
C3H/HeJ engrafted mouse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study