Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

Resumo

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Resumo

Alopecia é uma forma comum de perda de cabelo, que pode ocorrer em diversas condições, incluindo a perda de padrão masculino de cabelo, síndrome do ovário policístico, e alopecia areata. Alopecia também pode ocorrer como um efeito secundário da quimioterapia em pacientes com cancro. Neste estudo, o nosso objectivo foi desenvolver um método consistente e fiável para quantificar a perda de cabelo em ratinhos, o que vai permitir aos investigadores comparar e avaliar com precisão a novas abordagens terapêuticas para estas várias formas de alopécia. O método utiliza um gerador de imagens de gel padrão de obtenção e processamento de imagens de ratos, medindo a absorção de luz, o que ocorre em proporção com a quantidade aproximada de cabelo preto (ou cinzento) no rato. Os dados que foram quantificados desta forma podem ser analisados ​​utilizando técnicas estatísticas padrão (ou seja, ANOVA, teste t). Esta metodologia foi testada em modelos de rato de alopecia induzida por quimioterapia, alopécia areata e alopécia de depilação. Neste relatório, o protocolo detalhado é prestura orientada para a execução dessas medidas, incluindo dados de validação de C57BL / 6 e C3H / HeJ cepas de camundongos. Esta nova técnica oferece uma série de vantagens, incluindo a relativa simplicidade de aplicação, a confiança no equipamento que está prontamente disponível na maioria dos laboratórios de pesquisa, e aplicar uma avaliação objectiva, quantitativa que é mais robusto do que avaliações subjetivas. Melhorias na quantificação do crescimento do cabelo em camundongos vai melhorar estudo de modelos de alopecia e facilitar a avaliação de novas terapias promissoras em estudos pré-clínicos.

Introdução

Alopecia (queda de cabelo) pode ser um evento psicologicamente e emocionalmente estressante com múltiplas causas. Calvície de padrão masculino é a causa mais comum de alopecia, que afecta cerca de dois terços do sexo masculino de 35 anos ^1. Um padrão semelhante de perda de cabelo pode ser observado em mulheres com síndrome do ovário policístico. Em ambos estes distúrbios, a perda de cabelo é mediada androgénio. Alopecia também pode ocorrer como uma doença auto-imune, alopecia areata, que afecta 1,7% da população ^2. Alopecia pode ocorrer como um efeito colateral de alguns tratamentos médicos, tais como a quimioterapia e ^3. Uma elevada percentagem (65-85%) dos pacientes de quimioterapia experimentam algum grau de alopecia ^4,5. As consequências psicológicas da perda de cabelo foram bem estudados no cenário quimioterapia. Alopecia induzida pela quimioterapia pode resultar em ansiedade, depressão, uma imagem corporal negativa, baixa auto-estima e um senso reduzido de bem-estar ^6,7. Uma alta eprcentage (47-58%) de pacientes com câncer feminino considerar a perda de cabelo para ser o aspecto mais traumático da quimioterapia, e até 8% declínio tratamento por medo de perda de cabelo ^4,6. Há também evidências de alopecia androgênica para apoiar a terapia para reduzir as conseqüências psicológicas e até mesmo médicos de perda de cabelo ^8,9. Da mesma forma, a alopecia areata foi reportado ter consequências psicológicas graves ^2, e a natureza irregular da perda de cabelo pode levar a um resultado estético mais desagradável do que a maioria das outras causas de perda de cabelo.

Enquanto as drogas com efeitos anti-androgênicos leves (ie, espironolactona) tinham sido utilizados com sucesso limitado como terapia para alopecia, o primeiro medicamento eficaz para alopecia foi minoxidil ^10. Este anti-hipertensora tem um efeito secundário observado de provocar o crescimento do cabelo, e é agora utilizada como terapia tópica para muitas formas de alopecia. No entanto, as respostas são muitas vezes incompleta, com alguns assuntos mostrando apenas lentoção de perda de cabelo em vez de rebrota real ^10. Finasteride é um antagonista competitivo de tipo II 5α-redutase, que bloqueia a conversão de testosterona em di-hidrotestosterona, resultando em melhorias na alopecia androgénica, em detrimento de androgénio bloqueio parcial sistémica. As taxas de resposta com a longo prazo (10 anos), a terapia são em torno de 50% ^11. No geral, apesar de considerável pesquisa nesta área, ainda não há uma terapia adequada para a perda de cabelo.

Durante décadas, cientistas e médicos examinaram métodos de medir o crescimento do cabelo do couro cabeludo em ensaios clínicos. Com o desenvolvimento de drogas que tratam alopecia, tem havido uma necessidade maior de meios fiáveis, económicos e minimamente invasivas de medição do crescimento do cabelo e, especificamente, a resposta à terapia. Tecnologia de análise de imagem para uma quantificação precisa de densidade do cabelo em pacientes com distúrbios de perda de cabelo produziu resultados consistentes e válidos no passado usando uma variedade de techniques, incluindo a análise de imagens digitalizadas ^12, análise de imagem de cabelos individuais e lesões cutâneas ^13, e digitalização microscópica para quantificar a massa de cabelo em uma região do couro cabeludo definido ^14.

Infelizmente, enquanto as metodologias acima têm proporcionado uma melhor avaliação da eficácia para o cabelo crescimento promovendo intervenções em ensaios clínicos, estes métodos não tenham sido aplicadas a estudos com roedores em investigações pré-clínicas. Nosso objetivo é desenvolver um método consistente e confiável para quantificar a perda de cabelo em ratos, o que permitirá que os investigadores a avaliar com mais precisão e comparar novas abordagens terapêuticas para várias formas de alopecia. Nós desenvolvemos uma metodologia utilizando equipamento prontamente disponível na maioria dos laboratórios que permitam a quantificação rápida e confiável de densidade de cabelo em ratos com cabelo marrom ou preto. Esta metodologia foi testada em modelos de rato de alopecia induzida por quimioterapia, alopécia areata e alopécia de waxing. Um protocolo detalhado é apresentado para a execução dessas medidas, incluindo dados de validação de C57BL / 6 e C3H / HeJ cepas de camundongos. Como esta técnica baseia-se na detecção de absorção de luz a partir de pigmentos na haste do cabelo, que não pode ser usado para detectar o crescimento de cabelo em ratinhos ou ratos albinos brancos.

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Protocolo

Declaração de Ética: Todos os estudos que envolvam animais devem ser aprovados pelo IACUC da instituição (para os dados que se segue, os protocolos foram aprovados pela Montefiore IACUC, protocolo nº 11-6-240 e # 13-7-100). Animais são fornecidos anestesia luz, como indicado para o único propósito de mantê-los ainda durante a fotografia, não há procedimentos dolorosos necessários para este protocolo.

1. Aquisição de fotografias

1. Definir o foco e campo de visão para imager gel usando papel com texto impresso. Verifique uniformidade da fonte de luz em toda a região fotografada. Para ajudar a garantir a uniformidade, usar um gerador de imagens gel com um construído em fonte de luz para a fotografia reflexiva. Não utilize uma fonte de luz transillumination, pois isso criaria uma silhueta do animal que não é adequado para uma análise mais aprofundada em tons de cinza.
   NOTA: Isto irá colocar o mouse ligeiramente fora de foco, que fornece a média óptica em toda a região de interesse (ROI) e vontadeajudar a reduzir erros quantais para regiões muito pequenas (isto é, <10 pixels) de interesse. Regiões maiores de interesse não será afetado por este menor focando ajuste, nem serão afetados por diferenças no tamanho do animal.
2. Anestesiar os animais utilizando cetamina (100 mg / mL) / xilazina (20 mg / mL) (2: 1), pois isso proporciona um efeito de anestesia e uma recuperação rápida rápida e é ideal para fotografar vários animais.
   NOTA: A anestesia é confirmada quando o animal ainda é suficiente para permitir a fotografia. Como os animais tipicamente recuperar desta anestesia luz dentro de 10-15 min, o veterinário não recomenda o uso de pomadas para os olhos.
3. Coloque animais anestesiados em imager gel em alinhamento vertical (o mais próximo possível paralelo quanto possível).
   1. Para fotografias dorsais, colocar os animais em decúbito ventral, com os membros estendidos.
   2. Para fotografias ventral, colocar os animais em decúbito dorsal, tomando cuidado para que os animais não são rodado lateralmente.
4. Coloque padrão em tons de cinza na região fotografada.
5. Feche a porta de acesso. Importante: A luz ambiente pode apresentar variações na exposição.
6. Defina F-stop para uma exposição que coloca a região de interesse dentro da faixa linear de aquisição (leitura F-stop).
   NOTA: A maioria dos sistemas irá mostrar onde a imagem está saturada.
7. Tirar a fotografia.
8. Alterar F-stop para outra configuração de exposição que coloca a região de interesse dentro do intervalo linear, aumentando ou diminuindo o F-stop por 1, tal que tanto o padrão e a região de interesse permanece num intervalo linear de aquisição (referência F- pare).
9. Tirar a fotografia.
10. Uma vez que a fotografia é concluída, colocar os animais em uma tabela de aquecimento e monitorar até que possam manter decúbito esternal. Retorno animais para suas gaiolas. Retorne o grupo de animais ao biotério uma vez que todos os animais são totalmente recuperado.

2. Quantificação da absorção de luz

1. Marcar regiões de interesse nas imagens dos animais utilizando software fornecido para imager gel.
   1. Para ver o animal inteiro dorsal, utilizar uma imagem rectangular ou oval que se estende a partir das extremidades superiores dos membros inferiores, que se prolonga lateralmente, tanto quanto possível, de tal modo que nenhuma parte da caixa se estende para além da parte de trás do animal, tal como mostrado na Figura 1A.
      NOTA: Pode-se também marcar a área de interesse, utilizando uma ferramenta de desenho à mão livre.
   2. Para animal inteiro ventral vista, use 2 retângulos: uma que cobre a região pélvica e um cobrindo a área do peito, como mostrado na Figura 1B.
   3. Para uma região menor de interesse, ou seja, o local da administração da droga, marca, conforme apropriado.
2. Região (s) Mark de juros sobre o padrão de absorção em tons de cinza.
3. Absorção da ficha de cada uma das regiões marcadas de interesse.

3. Análise

Níveis de absorção obtained para as regiões de interesse podem necessitar de ser normalizadas para o padrão de fundo para comparação entre as fotografias. A relação de absorção é a exposição log-log (isto é, a relação é linear entre o log (exposição) e log (absorção)). Usando esta relação, a absorção da região de interesse pode ser normalizada a um padrão de valor de fundo, o que permitirá que as absorções de ser directamente comparados entre diferentes, incluindo as fotografias tomadas em diferentes pontos de tempo (isto é, medidas em série dentro de um protocolo de estudo). O procedimento para a execução dessas correções é detalhada em etapas opcionais 3.1 e 3.2.

1. (Opcional) curva Lote de log (exposição) vs. log (absorção), utilizando os valores obtidos a partir de padrão de absorção em tons de cinza.
2. (Opcional) Ajuste para variações no padrão de cada fotografia da seguinte forma:
   1. Selecione F-stop para a leitura (como determinado na etapa 1.6) e F-stop para a referência (conforme determinado no step 1,8).
   2. Calcule a absorção média do padrão em todas as fotografias na leitura de F-stop. Esta média é o Valor de Referência Padrão (RSV).
   3. Calcular diferença de absorção entre a leitura e de referência configurações F-stop em cada fotografia para o padrão (delta-S) e para cada ROI definido (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
   4. Calcule a absorção corrigido para cada ROI da seguinte forma: de absorção corrigido (ROI-X) = Absorção (ROI-X) com a leitura F-stop + (RSV - absorção de padrão na leitura de F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
3. Compilar os dados experimentais e executar análise de dados usando técnicas estatísticas padrão para variáveis ​​contínuas (ie, ANOVA, T-teste).

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Resultados

Esta técnica foi validado utilizando camundongos C3H / HeJ em vós implantada, a modelo de rato com alopecia areata ^16. Estes animais desenvolvem a perda de cabelo global que progride de forma gradual ao longo do tempo. No entanto, a perda de cabelo ocorre em manchas, e pode variar de um rato para o outro, a introdução de uma grande variabilidade e dificulta as avaliações qualitativas. Este modelo proporcionou uma oportunidade para testar as correlações entre as medições de densidade óptica em difer...

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Discussão

Neste relatório, uma descrição detalhada é fornecida de uma nova técnica para quantificar a perda de cabelo em roedores. Esta técnica utiliza um gerador de imagens de gel para aquisição e análise de imagem, o equipamento que está prontamente disponível, na maioria dos laboratórios. As medições foram mostrados para ser robusto para pequenas variações na técnica (Figuras 4-5), e está bem correlacionada com o grau de perda de cabelo visual em modelos de tratamento (Figura 6).

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest		Greyscale standard
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study
C3H/HeJ engrafted mouse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study