La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA) para el estudio de las interacciones RNA-proteína: El IRE / IRP Ejemplo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para analizar las interacciones RNA / proteína. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) se basa en la migración diferencial de los complejos de ARN / proteína y ARN libre durante la electroforesis en gel nativo. Mediante el uso de una sonda de RNA radiomarcada, complejos / proteína de ARN pueden ser visualizados por autorradiografía.

Resumen

Interacciones RNA / proteína son críticos para las vías de regulación post-transcripcional. Entre las proteínas de unión al ARN citosólicos mejor caracterizados son proteínas reguladoras del hierro, IRP1 y IRP2. Se unen al hierro elementos de respuesta (IRES) dentro de las regiones no traducidas (UTRs) de varios mRNAs objetivo, controlando así la traducción o la estabilidad ARNm. Interacciones IRE / IRP han sido ampliamente estudiados por la EMSA. Aquí se describe el protocolo de EMSA para analizar la actividad de unión a IRE de IRP1 y IRP2, que se puede generalizar para evaluar la actividad de otras proteínas de unión al ARN también. Un lisado de proteína cruda que contiene una proteína de unión al ARN, o una preparación purificada de esta proteína, se incuba con un exceso de ³² sonda de ARN marcado con P, lo que permite la formación de complejos. La heparina se añade para impedir la proteína no específica a la unión de la sonda. Posteriormente, la mezcla se analizó por electroforesis no desnaturalizante en gel de poliacrilamida. La sonda libremigra rápido, mientras que el ARN / proteína exposiciones complejas movilidad retrasados; por lo tanto, el procedimiento se denomina también "retardo en gel" o ensayo "bandshift". Después de la finalización de la electroforesis, el gel se seca y complejos de ARN / proteína, así como sonda libre, se detectan por autorradiografía. El objetivo general del protocolo es detectar y cuantificar IRE / IRP y otras interacciones RNA / proteína. Por otra parte, EMSA también se puede utilizar para determinar la especificidad, afinidad de unión, y la estequiometría de la interacción de ARN / proteína bajo investigación.

Introducción

La EMSA se desarrolló originalmente para estudiar la asociación de las proteínas de unión al ADN con secuencias de ADN diana ^1,2. El principio es similar para las interacciones RNA / proteína ^3, que es el foco de este artículo. Brevemente, el ARN está cargado negativamente y migrará hacia el ánodo durante la electroforesis no desnaturalizante de poliacrilamida en (o agarosa) geles. La migración dentro del gel depende del tamaño de la ARN, que es proporcional a su carga. La unión específica de una proteína de ARN altera su movilidad, y los complejos migra más lento en comparación con el RNA libre. Esto se debe principalmente a un aumento en la masa molecular, pero también a alteraciones en la carga y posiblemente conformación. Utilizando un ARN marcado como sonda permite un fácil monitoreo del "retardo en gel" o "bandshift". El uso de ³² sondas de ARN P-etiquetados es muy común y ofrece una alta sensibilidad. La migración de ARN / complejos de proteínas y ARN libre se detectanpor autorradiografía. Los inconvenientes son la corta vida media de ³² P (14,29 días), el deterioro progresivo de la calidad de la sonda debido a radiólisis, la exigencia de una licencia de radiactividad y la infraestructura para el trabajo de la radiactividad, y posibles problemas de seguridad de la biotecnología. Por lo tanto, los métodos no isotópicos alternativos para marcar la sonda de ARN se han desarrollado, por ejemplo, con fluoróforos o biotina, que permiten la detección mediante formación de imágenes fluorescente o quimioluminiscente ^4,5. Las limitaciones de estos métodos son el mayor costo y, a menudo sensibilidad reducida en comparación con marcaje isotópico, y el potencial de marcadores no isotópicos para interferir con la interacción de ARN / proteína. Geles de poliacrilamida no desnaturalizantes son adecuados para la mayoría de aplicaciones EMSA y se usan comúnmente. En ocasiones, geles de agarosa pueden representar una alternativa para el análisis de grandes complejos.

La principal ventaja de EMSA es que combina la simplicidad, sensibilidad y robustez ^{4 <}/ Sup>. El ensayo puede completarse en unas pocas horas y no requiere instrumentación sofisticada. Interacciones ARN / proteína pueden ser detectados por la EMSA, en concentraciones tan bajas como 0,1 nM o menos, y dentro de una amplia gama de condiciones de unión (pH 4,0 a 9,5, la concentración de sal monovalente 1 - 300 mM, y la temperatura de 0 - 60 ° C).

La formación de complejos de ARN / proteína también puede ser estudiada por el filtro obligatorio de ensayo. Este es un procedimiento simple, rápido y barato basado en la retención de los complejos de ARN / proteína en un filtro de nitrocelulosa, mientras que una sonda de ARN libre pasa a través de ^6. En comparación con EMSA, se limita en los casos en que la sonda de ARN contiene múltiples sitios de unión, o el extracto crudo contiene más de una proteínas de unión al ARN que se unen a la sonda en el mismo sitio. Mientras múltiples interacciones RNA / proteína no se detectarán por el filtro obligatorio de ensayo, que se pueden visualizar fácilmente por EMSA. En algunos casos, la visualización es vísperan posible cuando dos complejos de ARN / proteína co-migran (por ejemplo, humano IRP1 / IRE y complejos IRP2 / IRE), mediante la adición de un anticuerpo contra una de las proteínas de unión al ARN a la reacción de EMSA, produciendo más retraso en el gel ( "supershift") ^7.

El EMSA se ha utilizado ampliamente para estudiar IRP1 y IRP2, que son reguladores post-transcripcional del metabolismo del hierro ^8-10. Operan mediante la unión a IRE, estructuras de horquilla conservadas filogenéticamente dentro de los UTRs de varios mRNAs ^11. IREs fueron descubiertos por primera vez en los ARNm que codifican la ferritina y transferrina ¹² receptor 1 (TfR1) ^13, las proteínas de almacenamiento de hierro y la absorción, respectivamente. Más tarde, IREs se encontraron en erythroid específicos aminolevulinato sintasa (ALAS2) ^14, aconitasa mitocondrial ^15, ferroportina ^16, transportador de metales divalentes 1 (DMT1) ^17, factor inducible por hipoxia 2 α (HIF2α) ^18, y otra ARNm ^19-21. El H- prototipo y ARNm de L-ferritina contienen uno IRE en sus 5 'UTR, mientras TfR1 ARNm contiene múltiples IREs en su extremo 3' UTR. Interacciones IRE / IRP inhiben específicamente ferritina traducción de ARNm bloqueando estéricamente su asociación de los 43S subunidad ribosomal; además, se estabilizan mRNA TfR1 contra la escisión endonucleolítica. IRP1 y compartir IRP2 extensa similitud de secuencia y exhiben alta actividad de unión IRE-en las células hierro de hambre. En las células de hierro repleta, IRP1 reúne un cubane Fe-S clúster que convierte a la aconitasa citosólica a expensas de su actividad de unión a IRE, mientras IRP2 sufre degradación proteasomal. Por lo tanto, las interacciones IRE / IRP dependen del estado del hierro celular, sino que también están regulados por otras señales, tales como H ₂ O _2, el óxido nítrico (NO) o hipoxia. Aquí se describe el protocolo para evaluar la actividad de unión a IRE a partir de extractos crudos de células y tejidos por EMSA. Se utilizó una sonda de IRE marcado con ^32P H-ferritina que se ha generado mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plásmido (I-12.CAT), donde la secuencia IRE se introdujo originalmente en orientación sentido aguas abajo del sitio de la polimerasa T7 RNA por clonación de los oligonucleótidos sintéticos hibridados ^22.

Protocolo

Los procedimientos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill (protocolo 4966).

1. Preparación de extractos de proteínas de las células cultivadas

1. Lavar las células cultivadas dos veces con 10 ml de fosfato enfriada con hielo de solución salina tamponada (PBS).
2. Raspe células adherentes ya sea con una goma de policía o un raspador de células de plástico en 1 ml de suspensión de PBS, la transferencia enfriado con hielo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Girar en una microcentrífuga durante 5 min a 700 xg, a 4 ° C. Aspirar PBS.
4. Añadir 100 l de tampón de lisis citoplasmática helado (Tabla 1) por 10 ⁷ células, y la pipeta hacia arriba y abajo.
5. Incubar en hielo durante 20 min.
6. Centrifugado durante 10 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga a 4 ° C.
7. Pellet Descartar. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1.5 ml y mantener en hielo.
8. Detconcentración ermine proteína (normalmente 1 - 10 mg / l) utilizando el ensayo de Bradford ^23.
9. Alícuotas y celulares tienda extractos a -80 ° C hasta su uso.

2. Preparación de extractos de proteínas de ratón hígado y el bazo

1. La eutanasia a un ratón con inhalación de _CO2.
2. Coloque el animal sacrificado en un cojín limpio sobre una tabla de disección. Abra el abdomen con unas tijeras.
3. Diseccionar el hígado y el bazo mediante el uso de tijeras y fórceps, y enjuagar cada tejido en PBS aproximadamente 50 ml de hielo-frío.
4. Inmediatamente cortar tejidos en trozos pequeños con un bisturí (por ejemplo: aproximadamente 1 - 2 mm ^3).
5. Sin demora, poner trozos de tejidos en un criotubo fresco y luego haga presión para congelar en nitrógeno líquido. Tienda complemento congelados alícuotas de tejido a -80 ° C hasta su uso.
6. Homogeneizar una pieza de tejido congelado (aproximadamente 1 - 2 mm ³⁾ en 0,25 hasta 0,5 ml detampón de lisis enfriado con hielo citoplásmica (Tabla 1) con un homogeneizador de tejidos durante 10 s.
7. Transferencia homogeneizado a 1,5 ml tubo de microcentrífuga y enfriar en hielo durante 20 min.
8. Centrifugado durante 10 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga a 4 ° C.
9. Deseche pellet y transferencia sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantener en hielo.
10. Determinar la concentración de proteína (normalmente 1 - 10 mg / l) utilizando el ensayo de Bradford ^23.
11. Alícuotas y celulares tienda extractos a -80 ° C hasta su uso.

3. Preparación de sonda radiomarcada IRE-

1. Linealizar el plásmido I-12.CAT IRE-que contiene ²² mediante la incubación a 37 ° C durante 1 hora con la endonucleasa de restricción XbaI (1 U por g de plásmido), que escinde aguas abajo de la secuencia IRE. El plásmido linealizado se usó como molde para la transcripción in vitro.
2. Configurar unan in vitro reacción de transcripción en un volumen total de 20 l. Utilice las soluciones madre se muestran en la Tabla 2 y añadir: 1 l plantilla plásmido linealizado, tampón de transcripción 4 l; 1 l de mezcla de ATP mezcla / CTP / GTP, 10 l [α- ³² P] -UTP, 2 l de ditiotreitol, inhibidor de RNasa 1 l y 1 l de ARN polimerasa T7. Mezclar pipeteando arriba y abajo.
3. Incubar a 40 ° C durante 1 hr ^24.

4. Purificación de radiomarcado IRE-sonda

1. Terminar vitro reacción de transcripción in mediante la adición de 1 l de 0,5 M EDTA, pH 8. Mix pipeteando arriba y abajo.
2. Añadir 10 l de 10 mg / ml tRNA, como vehículo para una mejor precipitación. Mezclar pipeteando arriba y abajo.
3. Añadir 82,5 l de acetato de amonio 3 M. Mezclar por agitación.
4. Añadir 273 l de etanol. Mezclar por agitación.
5. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
6. Haga girar durante 10 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga a RT. Sobrenadante Descartar.
7. Lavar el precipitado con 100 l de etanol al 70%.
8. Haga girar durante 10 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga a RT. Sobrenadante Descartar.
9. Aire pellet seco durante 10 min.
10. Resuspender pellet en 100 l de doble destilada, autoclave previamente H ₂ O.
11. Cuantificar la radiactividad en un contador de centelleo líquido, sonda IRE radiomarcado alícuota y almacenar a -80 ° C hasta su uso. Alícuotas congeladas se pueden utilizar durante un máximo de 3 semanas.

5. Preparación de un gel de poliacrilamida nativo para EMSA

1. Montar el gel (16 x 16 cm) mediante el uso de espaciadores 1,5 mm y un peine.
2. Para preparar un gel de poliacrilamida nativo 6%, utilice las soluciones de reserva que se muestran en la Tabla 3 Mezclar 7,5 ml de 40% de acrilamida:. Bisacrilamida, 5 ml de 5x TBE y 37,5 mldoble _H2O destilada
3. Añadir 0,5 ml de persulfato 10% recién preparada de amonio (APS) y 25 l tetrametiletilendiamina (TEMED).
4. Inmediatamente vierta la solución de acrilamida al gel y se deja polimerizar. Espere aproximadamente 30 min.
5. Montar el aparato de electroforesis con gel, llenar los tanques con TBE 0,5x y conectar con la fuente de alimentación.

Ensayo de cambio de movilidad electroforética 6.

1. Diluir 25 g de extracto de proteína a partir de células o tejidos con tampón de lisis citoplásmica (Tabla 1) en un volumen total de 10 l en (concentraciones de proteína más bajas también se pueden utilizar). Mantener en hielo. Si es necesario, añadir 1 l de 1: 4 diluido 2-mercaptoetanol (2-ME) para activar IRP1 latente (concentración final: 2%) ^25.
2. Diluir la sonda IRE radiomarcado en doble H ₂ O destilada a 200.000 cpm / l, desnaturalización por calor a 95 °C durante 1 minuto, y se enfríe a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos.
3. Configurar una reacción EMSA añadiendo 1 l de sonda IRE radiomarcado al extracto de proteínas.
4. Incubar durante 20 min a TA.
5. Añadir 1 l de 50 mg / ml de heparina a la reacción (para inhibir las interacciones no específicas de proteínas con la sonda ⁹⁾ y continuar la incubación durante otros 10 min. Alícuota de la solución madre de heparina (50 mg / ml) y se almacena a -80 ° C.
6. Cuando se utilizan sondas radiomarcadas largos (> 60 nucleótidos), añadir 1 l de RNasa T1 (1 U / l) y se incuba durante 10 min a RT para reducir la proteína de unión no específica a la sonda, y para permitir una mejor separación de la ARN / proteína complejo durante la electroforesis.
7. Añadir 3 l de tampón de carga (80% de glicerol + azul de bromofenol), mezcla y carga sobre la no desnaturalización gel de poliacrilamida al 6%.
8. Ejecutar el gel durante 60 min a 130 V (5 V / cm).
9. Transfer el gel sobre un papel de filtro grande y seco.
10. Exponer a una película y desarrollar autorradiografía. El tiempo de exposición puede variar de 1 hr (o menos) hasta O / N.

Resultados

Una sonda IRE radiomarcado se prepara, como se describe en las secciones 3 y 4 del protocolo. La secuencia de la sonda era 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; los nucleótidos en negrita representan un residuo C desapareado y el bucle, que son características críticas de IRE. La radiactividad específica de la sonda fue de 4,5 x 10 ⁹ cpm / g de ARN.

Para evaluar los efectos de las perturbaciones de...

Discusión

En este documento, se describe un protocolo que se ha desarrollado para estudiar las actividades IRE-unión de IRP1 y IRP2, y mostramos datos representativos. Mediante el uso de diferentes sondas, este protocolo también se puede ajustar para el estudio de otras proteínas de unión al ARN. Un paso crítico es el tamaño de la sonda. El uso de sondas largas, que es común cuando el sitio de unión exacto es desconocido, puede dar lugar a complejos de ARN / proteína que no migran de manera diferente que el ARN libre. En...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
leupeptin	SIGMA	L2884
PMSF	SIGMA	78830
BioRad Protein Assay	BIORAD	500-0006
T7 RNA polymerase	Thermoscientific	EPO111
RNase Inhibitor	Invitrogen	15518-012
UTP [alpha-32P]	Perkin-Elmer	NEG507H
Scintillation liquid	Beckman Coulter	141349
heparin	SIGMA	H0777
Rnase T1	Thermoscientific	EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor	Qiagen	9001271
Scintillation counter	Beckman Coulter	LS6500
Protean II xi Cell	BIORAD	165-1834
20 wells combs	BIORAD	165-1868	1.5 mm thick
1.5 mm spacers	BIORAD	165-1849
PowerPac	BIORAD	164-5070