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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine ​​e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.

Abstract

Interazioni RNA / proteine ​​sono fondamentali per vie di regolazione post-trascrizionale. Tra le RNA-binding proteins citosoliche più caratterizzati sono proteine ​​regolatrici del ferro, IRP1 e IRP2. Si legano al ferro elementi responsivi (IRES) all'interno delle regioni non tradotte (UTR) dei diversi mRNA bersaglio, controllando così la traduzione mRNA o la stabilità. Interazioni IRE / IRP sono stati ampiamente studiati da EMSA. Qui, descriviamo il protocollo EMSA per analizzare l'attività IRE vincolante di IRP1 e IRP2, che può essere generalizzato per valutare l'attività di altri RNA-binding proteins pure. Un lisato proteina grezza contenente una proteina legante l'RNA, o una preparazione purificata di questa proteina, viene incubato con un eccesso di 32 sonda RNA P-marcato, consentendo la formazione del complesso. L'eparina è aggiunto precludere proteina non specifica per sondare vincolante. Successivamente, la miscela viene analizzata mediante elettroforesi non denaturante su un gel di poliacrilammide. La sonda gratuitomigra veloce, mentre l'RNA / proteine ​​mostre complesse mobilità ritardato; di conseguenza, la procedura è chiamata anche "il ritardo gel" e il dosaggio "bandshift". Dopo il completamento della elettroforesi, il gel viene essiccato e complessi RNA / proteine, così come sonda free, vengono rilevati mediante autoradiografia. L'obiettivo generale del protocollo è quello di individuare e quantificare IRE / IRP e altre interazioni RNA / proteine. Inoltre, EMSA può anche essere usato per determinare la specificità, l'affinità di legame, e stechiometria dell'interazione RNA / proteina in esame.

Introduzione

L'EMSA è stato originariamente sviluppato per studiare l'associazione di proteine ​​che legano il DNA con sequenze di DNA bersaglio 1,2. Il principio è simile per le interazioni RNA / proteine ​​3, che è il focus di questo articolo. Brevemente, l'RNA è caricato negativamente e migrerà verso l'anodo durante non denaturante elettroforesi in poliacrilammide (o agarosio gel). Migrazione nel gel dipende dalla dimensione del RNA, che è proporzionale alla sua carica. Legame specifico di una proteina di RNA altera la sua mobilità, e le migra complessi più lento rispetto alla RNA libera. Ciò è dovuto principalmente ad un aumento della massa molecolare, ma anche ad alterazioni nella carica e possibilmente conformazione. Utilizzando un RNA marcato come sonda permette un facile monitoraggio del "ritardo gel" o "bandshift". L'utilizzo di 32 sonde RNA P-marcato è molto comune e offre alta sensibilità. La migrazione di RNA / complessi proteici e RNA libero vengono rilevatimediante autoradiografia. Inconvenienti sono breve emivita di 32 P (14,29 giorni), il progressivo deterioramento della qualità della sonda a causa radiolisi, il requisito di una licenza radioattività e infrastruttura per lavoro radioattività, e potenziali problemi di biosicurezza. Pertanto, sono stati sviluppati metodi non isotopici alternativi per etichettare la sonda RNA, per esempio con fluorofori o biotina, che consentono il rilevamento da parte di imaging fluorescente o chemiluminescente 4,5. Limitazioni di questi metodi sono il costo elevato e spesso ridotta sensibilità rispetto all'etichettatura isotopica, e il potenziale di etichette non isotopici di interferire con l'interazione RNA / proteine. Gel non denaturante di poliacrilammide sono adatti per la maggior parte delle applicazioni di EMSA e sono comunemente usati. Occasionalmente, gel di agarosio possono rappresentare un'alternativa per l'analisi di grandi complessi.

Il principale vantaggio di EMSA è che combina semplicità, sensibilità, robustezza e 4 </ Sup>. Il test può essere completato nel giro di poche ore e non richiede una strumentazione sofisticata. Interazioni RNA / proteine ​​possono essere rilevati da EMSA a concentrazioni basse come 0,1 nm o inferiori, e all'interno di una vasta gamma di condizioni vincolanti (pH 4,0-9,5, la concentrazione di sale monovalente 1-300 mM, e la temperatura 0 - 60 ° C).

RNA / proteine ​​formazione del complesso può essere studiato mediante il saggio filtro vincolante. Questa è una procedura semplice, veloce ed economico basato sulla conservazione dei complessi RNA / proteine ​​in un filtro di nitrocellulosa, mentre una sonda di RNA libera attraversa 6. Rispetto al EMSA, è limitato nei casi in cui la sonda RNA contiene più siti di legame, o l'estratto grezzo contiene più di un RNA-binding proteins che si legano alla sonda nello stesso sito. Mentre molteplici interazioni RNA / proteine ​​sfuggiranno rilevamento da parte del saggio di filtro di legame, possono essere facilmente visualizzati tramite EMSA. In alcuni casi, la visualizzazione è vigilian possibile quando due complessi RNA / proteine ​​co-migrazione (per esempio, IRP1 umana / IRE e IRP2 / complessi IRE), con l'aggiunta di un anticorpo contro una delle RNA-binding proteins alla reazione EMSA, ottenendo un'ulteriore ritardo sul gel ( "supershift") 7.

L'EMSA è stato ampiamente utilizzato per studiare IRP1 e IRP2, che sono regolatori post-trascrizionali del metabolismo del ferro 8-10. Operano legandosi a IRE, strutture tornante filogeneticamente conservate nelle UTR di diversi mRNA 11. IRE sono stati scoperti nel mRNA codificanti ferritina 12 e transferrina recettore 1 (TfR1) 13, proteine ​​di stoccaggio ferro e l'assorbimento, rispettivamente. Più tardi, IRE sono stati trovati in specifici eritroide aminolevulinato sintasi (ALAS2) 14, aconitasi mitocondriale 15, ferroportina 16, divalente metallo transporter 1 (DMT1) 17, ipossia fattore inducibile 2 α (HIF2α) 18, e altri mRNA 19-21. Il H- prototipi e mRNA L-ferritina contengono una IRE nella loro 5 'UTR, mentre TfR1 mRNA contiene più IRE nel suo 3' UTR. Interazioni IRE / GIV specificamente inibiscono ferritina traduzione mRNA da stericamente bloccando la sua associazione delle subunità ribosomiale 43S; inoltre, si stabilizzano TfR1 mRNA contro taglio endonucleolitico. IRP1 e quota IRP2 ampia similarità di sequenza e presentano un'elevata attività-IRE legame in cellule di ferro-fame. Nelle cellule ferro-piena, IRP1 assembla un cubano Fe-S cluster che converte in aconitasi citosolica a scapito della sua attività IRE vincolante, mentre IRP2 subisce la degradazione del proteasoma. Pertanto, le interazioni IRE / IRP dipendono dal livello di ferro cellulare, ma sono anche regolati da altri segnali, quali H 2 O 2, ossido nitrico (NO) o ipossia. Qui, descriviamo il protocollo per valutare l'attività IRE vincolante da estratti di cellule e tessuti greggi da EMSA. Abbiamo utilizzato un 32 P-marcato H-ferritina sonda IRE che è stato generato mediante trascrizione in vitro da un modello DNA plasmidico (I-12.CAT), dove la sequenza IRE è stato inizialmente introdotto in orientamento senso valle del sito polimerasi T7 RNA da clonazione di ricotto oligonucleotidi sintetici 22.

Protocollo

Procedure sperimentali con i topi sono stati approvati dal Comitato di McGill University (protocollo 4966) Animal Care.

1. Preparazione di estratti proteici di cellule in coltura

  1. Lavare le cellule in coltura per due volte con 10 ml di fosfato ghiacciata salina tamponata (PBS).
  2. Raschiare cellule aderenti sia con un poliziotto gomma o un raschietto cellulare plastica in 1 ml di sospensione di PBS, trasferimento fredda in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  3. Spin in una microcentrifuga per 5 minuti a 700 xg, a 4 ° C. Aspirare PBS.
  4. Aggiungere 100 ml di tampone di lisi citoplasmatica ghiacciata (Tabella 1) per 10 7 cellule, e pipetta su e giù.
  5. Incubare in ghiaccio per 20 min.
  6. Spin per 10 min a piena velocità in una microcentrifuga a 4 ° C.
  7. Pellet Rifiuta. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e tenere in ghiaccio.
  8. Detconcentrazione ermine di proteine ​​(di solito 1-10 mg / mL) con il saggio Bradford 23.
  9. Aliquota e cellulari negozio estratti a -80 ° C fino al momento dell'uso.

2. Preparazione di estratti di proteine ​​di topo fegato e milza

  1. Euthanize un mouse con CO 2 inalazione.
  2. Posare l'animale eutanasia su un tappetino pulito su una tavola di dissezione. Aprire l'addome con le forbici.
  3. Staccare il fegato e la milza, utilizzando forbici e pinze, e lavare ogni tessuto in circa 50 ml ghiacciata PBS.
  4. Subito tagliare tessuti in piccoli pezzi con un bisturi (ad esempio: circa 1 - 2 mm 3).
  5. Senza indugio, mettere pezzi di tessuto in una fresca cryotube e quindi far scattare congelarli in azoto liquido. Conservare snap-congelati aliquote tessuto a -80 ° C fino al momento dell'uso.
  6. Omogeneizzare un pezzo di tessuto congelato (circa 1 - 2 mm 3) in 0,25-0,5 ml dighiacciato tampone di lisi citoplasmatica (Tabella 1) con un omogeneizzatore tessuto per 10 sec.
  7. Trasferimento omogeneizzato a 1,5 ml provetta e freddo in ghiaccio per 20 min.
  8. Spin per 10 min a piena velocità in una microcentrifuga a 4 ° C.
  9. Eliminare pellet e trasferimento surnatante in nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mantenere su ghiaccio.
  10. Determinare la concentrazione di proteine ​​(di solito 1-10 mg / mL) con il saggio Bradford 23.
  11. Aliquota e cellulari negozio estratti a -80 ° C fino al momento dell'uso.

3. Preparazione di marcata radioattivamente IRE-probe

  1. Linearizzare il IRE contenenti plasmide I-12.CAT 22 incubando a 37 ° C per 1 ora con l'endonucleasi di restrizione XbaI (1 U per pg di plasmide), che scinde a valle della sequenza IRE. Il plasmide linearizzato sarà utilizzato come stampo per la trascrizione in vitro.
  2. Impostare unn in vitro reazione di trascrizione in un volume totale di 20 microlitri. Utilizzare le soluzioni azionari riportati in Tabella 2 e aggiungere: 1 ml modello plasmide linearizzato, buffer di trascrizione 4 ml; 1 ml mix di ATP mix / CTP / GTP, 10 ml [α- 32 P] -UTP, 2 microlitri ditiotreitolo, inibitore RNasi 1 ml e 1 ml T7 RNA polimerasi. Mescolare pipettando su e giù.
  3. Incubare a 40 ° C per 1 ora 24.

4. Purificazione di marcata radioattivamente IRE-probe

  1. Terminare la reazione di trascrizione in vitro con l'aggiunta di 1 ml di 0,5 M EDTA, pH 8. Mix pipettando su e giù.
  2. Aggiungere 10 ml di 10 mg / ml tRNA, come supporto per una migliore precipitazione. Mescolare pipettando su e giù.
  3. Aggiungere 82,5 ml di 3 M acetato di ammonio. Mescolare nel vortex.
  4. Aggiungere 273 ml di etanolo. Mescolare nel vortex.
  5. Lasciar riposare a temperatura ambiente per 5 min.
  6. Spin per 10 min a piena velocità in una microcentrifuga a RT. Surnatante Rifiuta.
  7. Lavare pellet con 100 ml di etanolo al 70%.
  8. Spin per 10 min a piena velocità in una microcentrifuga a RT. Surnatante Rifiuta.
  9. Aria pellet secco per 10 min.
  10. Risospendere pellet in 100 ml di bidistillata, precedentemente sterilizzato in autoclave H 2 O.
  11. Quantificare la radioattività in un contatore a scintillazione liquida, sonda IRE aliquota radiomarcato e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso. Aliquote congelate possono essere usati fino a 3 settimane.

5. Preparazione di un gel di poliacrilammide nativo per EMSA

  1. Montare il gel (16 x 16 cm), utilizzando 1,5 millimetri distanziali e pettine.
  2. Per preparare un gel di poliacrilammide nativo il 6%, utilizzare le soluzioni madre indicate nella Tabella 3 Mescolare 7,5 ml di 40% acrilamide:. Bisacrilammide, 5 ml di 5x TBE e 37,5 mldoppia H distillata 2 O.
  3. Aggiungere 0,5 ml di 10% persolfato preparata ammonio (APS) e 25 ml tetrametiletilendiammina (TEMED).
  4. Versare immediatamente la soluzione acrilamide al gel e lasciare polimerizzare. Attendere per circa 30 min.
  5. Montare l'apparecchiatura elettroforesi con il gel, riempire i serbatoi con 0,5x TBE e connettersi con l'alimentazione.

6. Electrophoretic Mobility Shift Assay

  1. Diluire 25 mg di estratto proteico da cellule o tessuti con citoplasmatica tampone di lisi (Tabella 1) in un volume totale di 10 microlitri in (concentrazioni proteiche inferiori possono anche essere utilizzati). Mantenere su ghiaccio. Se necessario, aggiungere 1 ml di 1: 4 diluito 2-mercaptoetanolo (2-ME) per attivare IRP1 dormiente (concentrazione finale: 2%) 25.
  2. Diluire la sonda radioattivo IRE in doppia H 2 O distillata a 200.000 cpm / ml, denaturare calore a 95 °C per 1 min e raffreddare a temperatura ambiente per almeno 5 minuti.
  3. Impostare una reazione EMSA aggiungendo 1 ml di sonda IRE radioattivo al estratto proteico.
  4. Incubare per 20 minuti a RT.
  5. Aggiungere 1 ml di 50 mg / ml di eparina alla reazione (per inibire le interazioni proteina non specifiche con la sonda 9) e continuare l'incubazione per altri 10 min. Aliquota della soluzione madre di eparina (50 mg / ml) e conservare a -80 ° C.
  6. Quando si utilizzano sonde lunghe radiomarcati (> 60 nucleotidi), aggiungere 1 ml RNasi T1 (1 U / ml) e incubare per 10 minuti a RT per ridurre proteina legame non specifico alla sonda, e per consentire una migliore separazione della RNA / proteine complesso durante l'elettroforesi.
  7. Aggiungere 3 ml di tampone di caricamento (80% glicerolo + bromofenolo blu), mescolare e carico sul non-denaturazione gel di poliacrilammide al 6%.
  8. Eseguire il gel per 60 min a 130 V (5 V / cm).
  9. Trasferimento il gel su una grande carta da filtro e asciutta.
  10. Esporre a un film e sviluppare autoradiografia. Tempo di esposizione può variare da 1 ora (o meno) fino a O / N.

Risultati

Una sonda radiomarcata IRE è stato preparato, come descritto nelle sezioni 3 e 4 del protocollo. La sequenza della sonda era 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; i nucleotidi in grassetto rappresentano un residuo C spaiato e il ciclo, che sono caratteristiche critiche IRE. La radioattività specifica della sonda era 4,5 x 10 9 cpm / mg di RNA.

Per valutare gli effetti delle perturbazioni ferro sull&#...

Discussione

Qui, descriviamo un protocollo che è stato sviluppato per studiare le attività IRE vincolanti di IRP1 e IRP2, e mostriamo dati rappresentativi. Utilizzando diverse sonde, questo protocollo può essere regolato anche per lo studio di altre proteine-RNA vincolante. Un punto critico è la dimensione della sonda. L'utilizzo di sonde lunghe, che è comune quando l'esatto sito di legame è sconosciuto, può portare a complessi RNA / proteine ​​che non migrano in modo diverso rispetto alla RNA gratuito. In questo...

Divulgazioni

The authors declare that they have no competing financial interests.

Riconoscimenti

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
leupeptinSIGMAL2884
PMSFSIGMA78830
BioRad Protein AssayBIORAD500-0006
T7 RNA polymeraseThermoscientificEPO111
RNase InhibitorInvitrogen15518-012
UTP [alpha-32P]Perkin-ElmerNEG507H
Scintillation liquidBeckman Coulter141349
heparinSIGMAH0777
Rnase T1ThermoscientificEN0541
Name of the Equipment
Tissue RuptorQiagen9001271
Scintillation counterBeckman CoulterLS6500
Protean II xi CellBIORAD165-1834
20 wells combsBIORAD165-18681.5 mm thick
1.5 mm spacersBIORAD165-1849
PowerPacBIORAD164-5070

Riferimenti

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