Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo

Resumo

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

Resumo

Interações RNA / proteínas são fundamentais para vias de regulação pós-transcricional. Entre as proteínas de ligação a ARN citosólicos melhor caracterizados são proteínas reguladoras de ferro, e IRP1 IRP2. Eles ligam-se a elementos responsivos de ferro (IRES) dentro das regiões não traduzidas (UTRs) de vários mRNAs alvo, controlando assim a tradução de mRNAs ou estabilidade. Interações IRE / PIA têm sido amplamente estudados pela EMSA. Aqui, nós descrevemos o protocolo de EMSA para analisar a actividade de ligação de IRE-IRP1 e IRP2, que pode ser generalizado para avaliar a actividade de outras proteínas de ligação a ARN, bem. Um lisato de proteína bruto contendo uma proteína de ligação de ARN, ou uma preparação purificada desta proteína, é incubado com um excesso de ³² sonda de ARN marcada com P, para permitir a formação do complexo. A heparina é adicionado para impedir a proteína não específica para sondar ligação. Subsequentemente, a mistura é analisada por electroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida. A sonda livremigra rapidamente, enquanto que o ARN / proteína apresenta complexos de mobilidade retardada; daí, o procedimento também é chamado de "retardamento em gel" ou ensaio "bandshift". Depois de completada a electroforese, o gel é seco e complexos de ARN / proteína, bem como sonda livre, são detectados por auto-radiografia. O objetivo geral do protocolo é para detectar e quantificar IRE / IRP e outras interações RNA / proteína. Além disso, a EMSA também pode ser utilizado para determinar a especificidade, a afinidade de ligação, e a estequiometria da interacção de ARN / proteína sob investigação.

Introdução

A EMSA foi originalmente desenvolvido para o estudo da associação de proteínas de ligação de DNA com sequências de ADN alvo ^1,2. O princípio é semelhante para as interacções de ARN / proteína ^3, o que é o foco deste artigo. Resumidamente, o ARN é negativamente carregado e irá migrar em direcção ao ânodo durante a electroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida (ou géis de agarose). A migração dentro do gel depende do tamanho do ARN, que é proporcional à sua carga. De ligação específica de uma proteína de ARN altera a sua mobilidade, e as complexo migra mais lenta em comparação com o ARN livre. Isto é devido principalmente a um aumento na massa molecular, mas também às alterações na carga e, eventualmente, conformação. Utilizando um RNA rotulado como sonda permite fácil monitoramento do "atraso gel" ou "bandshift". Uso de ³² sondas de ARN marcadas com P é muito comum e oferece uma elevada sensibilidade. A migração de RNA / complexos de proteínas e RNA livre são detectadospor autorradiografia. Inconvenientes são o meia-vida curta de ³² P (14,29 dias), a deterioração gradual da qualidade da sonda devido a radiólise, a exigência de uma licença de radioatividade e infra-estrutura para o trabalho de radioatividade, e potenciais preocupações de biossegurança. Portanto, foram desenvolvidos métodos alternativos não isotópicas para etiquetar a sonda de RNA, por exemplo, com fluoróforos ou biotina, que permitem a detecção por imagem fluorescente ou quimioluminescente ^4,5. As limitações destes métodos são o custo mais elevado e frequentemente sensibilidade reduzida em comparação com a marcação isotópica, e o potencial de marcadores não isotópicos para interferir com a interacção de ARN / proteína. Géis de poliacrilamida não desnaturantes são adequados para a maioria das aplicações de EMSA e são normalmente utilizados. Na ocasião, géis de agarose pode representar uma alternativa para a análise de grandes complexos.

A principal vantagem de EMSA é que ele combina simplicidade, sensibilidade e robustez ^{4 <}/ Sup>. O ensaio pode ser concluída dentro de algumas horas e não requer instrumentação sofisticada. Interacções de ARN / proteína pode ser detectada por EMSA em concentrações tão baixas como 0,1 nM ou menos, e dentro de uma ampla gama de condições de ligação (pH 4,0-9,5, a concentração de sal monovalente 1-300 mM, e a temperatura 0-60 ° C).

ARN / proteína a formação do complexo também pode ser estudada pelo ensaio de ligação ao filtro. Este é um procedimento simples, rápido e barato, baseado na retenção dos complexos de ARN / proteína em um filtro de nitrocelulose, enquanto que uma sonda de RNA livre passa por ^6. Em comparação com a EMSA, é limitado nos casos em que a sonda de ARN contém múltiplos locais de ligação, ou o extracto em bruto contém mais do que uma proteína de ligação a ARN que se ligam a sonda no mesmo local. Enquanto múltiplas interacções ARN / proteína vai escapar à detecção por ensaio de ligação ao filtro, que pode ser facilmente visualizado por EMSA. Em alguns casos, a visualização é vésperan possível quando dois complexos de ARN / proteína co-migrar (por exemplo, humano IRP1 / IRE e IRP2 / complexos IRE), por adição de um anticorpo contra uma das proteínas de ligação a ARN para a reacção de EMSA, obtendo-se ainda mais sobre o gel de retardo ( "supershift") ^7.

O EMSA tem sido amplamente utilizado para estudar e IRP1 IRP2, que são reguladores pós-transcricional do metabolismo do ferro ^8-10. Eles operam através da ligação a IRES, estruturas hairpin filogeneticamente conservados dentro das UTRs de vários mRNAs ^11. IRES foram descobertos pela primeira vez nos mRNAs que codificam ¹² ferritina e transferrina receptor 1 (TfR1) ^13, proteínas de armazenamento de ferro e absorção, respectivamente. Mais tarde, IRES foram encontrados em específico-erythroid aminolevulinato sintase (ALAS2) ^14, aconitase mitocondrial ^15, ferroportin ^16, transportador de metal divalente 1 (DMT1) ^17, hipóxia fator induzível 2 α (HIF2α) ^18, e outro mRNAs ^19-21. O protótipo H- e mRNAs L-ferritina conter um IRE na sua UTR 5 ', enquanto TfR1 ARNm contém múltiplos IRES em sua extremidade 3' UTR. Interações IRE / PIA especificamente inibir a tradução do mRNA ferritina por estericamente bloqueando a sua associação dos 43S da subunidade ribossômica; Além disso, eles estabilizar TfR1 mRNA contra clivagem endonucleolítica. IRP1 e share IRP2 extensa seqüência de similaridade e apresentam alta atividade de ligação IRE em células sedentos de ferro. Em células repletas de ferro, IRP1 monta um aglomerado cubano Fe-S que converte para aconitase citosólico em detrimento da sua actividade de ligação ao IRE, enquanto IRP2 sofre degradação proteossoma. Assim, as interacções IRE / PIA depender do estado celular de ferro, mas também são regulados por outros sinais, tais como H ₂ O _2, o óxido nítrico (NO) ou hipoxia. Aqui, descrevemos o protocolo para avaliar a atividade IRE de ligação a partir de extratos de células de tecido cru e por eMSA. Utilizou-se um marcado com ³² P H-ferritina sonda IRE que foi gerado por transcrição in vitro a partir de um molde de ADN de plasmídeo (I-12.CAT), onde a sequência IRE foi originalmente introduzido na orientação com sentido a jusante do local da polimerase de ARN de T7 pela clonagem de oligonucleótidos sintéticos ²² recozidos.

Protocolo

Os procedimentos experimentais com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animal da McGill University (protocolo 4966).

1. Preparação de extratos de proteínas a partir de células cultivadas

1. Lavar as células cultivadas duas vezes com 10 ml de fosfato de gelo-solução salina tamponada (PBS).
2. Raspe células aderentes quer com um polícia de borracha ou um raspador de células de plástico em 1 ml de suspensão de PBS, arrefecido com gelo transferência para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Centrifugação numa microcentrífuga durante 5 min a 700 xg, a 4 ° C. Aspirar PBS.
4. Adicionar 100 ul de tampão de lise arrefecido com gelo citoplasmática (Tabela 1) por 10 ⁷ células, e pipetar para cima e para baixo.
5. Incubar em gelo durante 20 min.
6. Centrifugação durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga a 4 ° C.
7. Pellet Descartar. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e manter em gelo.
8. Detarminho concentração de proteína (normalmente 1-10 mg / mL) utilizando o ²³ ensaio de Bradford.
9. Alíquotas e armazenar extractos celulares a -80 ° C até à sua utilização.

2. Preparação de extratos de proteína de rato fígado e baço

1. Euthanize um rato com inalação de CO _2.
2. Coloque o animal sacrificados em uma almofada limpo sobre uma placa de dissecação. Abra o abdômen com uma tesoura.
3. Dissecar o fígado e o baço, utilizando tesouras e pinças, e lave cada tecido em aproximadamente 50 ml de PBS gelado.
4. Tecidos em pequenos pedaços imediatamente cortada com um bisturi (por exemplo: cerca de 1 - 2 mm ^3).
5. Sem demora, coloque pedaços de tecidos em uma nova cryotube e em seguida, encaixe congelá-los em nitrogênio líquido. Snap-congelados loja alíquotas de tecido a -80 ° C até à sua utilização.
6. Homogeneizar um pedaço de tecido congelado (cerca de 1 - 2 mm ³⁾ em 0,25-0,5 ml degelo-tampão de lise frio citoplasmática (Tabela 1) com um homogeneizador de tecidos de 10 seg.
7. Transferir homogeneizado a 1,5 ml tubo de microcentrífuga e frio em gelo durante 20 min.
8. Centrifugação durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga a 4 ° C.
9. Descarte pellet e transferência sobrenadante para novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenha no gelo.
10. Determinar a concentração de proteína (normalmente 1-10 mg / mL) utilizando o ²³ ensaio de Bradford.
11. Alíquotas e armazenar extractos celulares a -80 ° C até à sua utilização.

3. Preparação de sonda radiomarcada-IRE

1. Linearizar o plasmídeo contendo IRE-I-12.CAT ²² por incubação a 37 ° C durante 1 h com a endonuclease de restrição Xbal (1 U por ug de plasmídeo), que cliva a jusante da sequência IRE. O plasmídeo linearizado vai ser utilizado como molde para a transcrição in vitro.
2. Configurar uman na reacção de transcrição in vitro num volume total de 20 ul. Use as soluções stock mostrados na Tabela 2 e adicionar: 1 ul molde de plasmídeo linearizado, 4 ul de tampão de transcrição; 1 uL de mistura de mistura de ATP / CTP / GTP, 10 ul [α- ³² P] -UTP, 2 ul de ditiotreitol, 1 ul de inibidor de RNase e 1 ul de RNA-polimerase de T7. Misturar por pipetagem cima e para baixo.
3. Incubar a 40 ° C durante 1 h ^24.

4. Purificação de IRE-sonda radiomarcada

1. Terminar em reação de transcrição in vitro, adicionando 1 ml de 0,5 M EDTA, pH 8. Mix pipetando cima e para baixo.
2. Adicionar 10 ul de 10 mg / ml de ARNt, como transportador para uma melhor precipitação. Misturar por pipetagem cima e para baixo.
3. Adicionar 82.5 ul de acetato de amónio 3 M. Misture em vórtice.
4. Adicionar 273 ul de etanol. Misture em vórtice.
5. Deixar repousar à temperatura ambiente durante 5 min.
6. Girar durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga à temperatura ambiente. Sobrenadante Descartar.
7. Lave o peletizado com 100 ul de etanol a 70%.
8. Girar durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga à temperatura ambiente. Sobrenadante Descartar.
9. Ar sedimento seco durante 10 min.
10. Ressuspender o sedimento em 100 ul de duas vezes destilada, previamente autoclavada H ₂ O.
11. Quantificar a radioactividade num contador de cintilação líquida, a sonda radiomarcada IRE alíquota e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. Alíquotas congeladas podem ser utilizadas durante até 3 semanas.

5. Preparação de um gel de poliacrilamida nativa para EMSA

1. Monte o gel (16 x 16 cm), usando 1,5 espaçadores mm e pente.
2. Para preparar um gel de poliacrilamida a 6% nativo, utilizar as soluções de estoque mostrados na Tabela 3 Misturar 7,5 ml de 40% de acrilamida:. Bisacrilamida, 5 ml de 5x TBE e 37,5 mldouble _H2O destilada
3. Adicionar 0,5 ml de 10% de persulfato de amónio preparada recentemente (APS) e 25 ul tetrametiletilenodiamina (TEMED).
4. Derrame imediatamente a solução de acrilamida ao gel e deixá-lo polimerizar. Aguarde cerca de 30 min.
5. Montar o aparelho de eletroforese com gel, encher os tanques com 0,5x TBE e se conectar com a fonte de alimentação.

6. Electrophoretic Mobility Turno Assay

1. Dilui-se 25 ug de extracto de proteína a partir de células ou tecidos com tampão de lise citoplasmática (Quadro 1) num volume total de 10 uL em (concentrações de proteína mais baixas podem também ser usados). Mantenha no gelo. Se necessário, adicionar 1 ml de 1: 4 diluído 2-mercaptoetanol (2-ME) para activar IRP1 dormente (concentração final: 2%) ^25.
2. Dilui-se a sonda IRE radiolabeled em dobro _H2O destilada para 200.000 cpm / mL, desnaturar calor em 95 °C durante 1 min, e arrefecer à temperatura ambiente durante pelo menos 5 min.
3. Configurar uma reação EMSA, adicionando 1 ml de sonda IRE radiolabeled ao extrato de proteína.
4. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente.
5. Adicionar 1 ml de 50 mg / ml de heparina para a reacção (para inibir interacções de proteínas não-específicos com a sonda ⁹⁾ e continuar a incubação durante mais 10 min. Alíquota da solução de reserva de heparina (50 mg / ml) e armazenar a -80 ° C.
6. Quando utilizando sondas radiomarcadas longas (> 60 nucleótidos), adicionar 1 ul de ARNase T1 (1 U / ul) e incubar durante 10 min à temperatura ambiente para reduzir a proteína de ligação não específica com a sonda, e para permitir uma melhor separação do ARN / proteína complexo durante a electroforese.
7. Adicionar 3 ul de tampão de carga (glicerol a 80% + azul de bromofenol), misturar e carga sobre o não-desnaturante em gel de poliacrilamida a 6%.
8. Submeter o gel durante 60 minutos a 130 V (5 V / cm).
9. Transferência o gel para um grande papel de filtro e seco.
10. Expor a um filme e desenvolver auto-radiografia. O tempo de exposição pode variar desde 1 h (ou menos) até S / N.

Resultados

A radiolabeled IRE probe was prepared, as described in sections 3 and 4 of the protocol. The sequence of the probe was 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGCUUCAAC AGUGCUUGGA CGGAUCCU-3'; the bolded nucleotides represent an unpaired C residue and the loop, which are critical IRE features. The specific radioactivity of the probe was 4.5 x 10⁹ cpm/μg of RNA.

To assess the effects of iron perturbations on IRE-binding activity, murine RAW...

Discussão

Herein, we describe a protocol that has been developed to study the IRE-binding activities of IRP1 and IRP2, and we show representative data. By using different probes, this protocol can also be adjusted for the study of other RNA-binding proteins. A critical step is the size of the probe. Usage of long probes, which is common when the exact binding site is unknown, can result in RNA/protein complexes that do not migrate differently than the free RNA. In this case, it is advisable to remove unbound RNA by treatment with ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
leupeptin	SIGMA	L2884
PMSF	SIGMA	78830
BioRad Protein Assay	BIORAD	500-0006
T7 RNA polymerase	Thermoscientific	EPO111
RNase Inhibitor	Invitrogen	15518-012
UTP [alpha-32P]	Perkin-Elmer	NEG507H
Scintillation liquid	Beckman Coulter	141349
heparin	SIGMA	H0777
Rnase T1	Thermoscientific	EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor	Qiagen	9001271
Scintillation counter	Beckman Coulter	LS6500
Protean II xi Cell	BIORAD	165-1834
20 wells combs	BIORAD	165-1868	1.5 mm thick
1.5 mm spacers	BIORAD	165-1849
PowerPac	BIORAD	164-5070