JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы приводим протокол для анализа РНК / белковые взаимодействия. Сдвиг анализа электрофоретической подвижности (EMSA) основан на дифференциальной миграции РНК / белковые комплексы и свободной РНК в процессе электрофореза нативного гель. При использовании радиоактивно помеченных РНК-зонда, РНК / белковые комплексы могут быть визуализированы с помощью авторадиографии.

Аннотация

РНК / белковые взаимодействия являются критическими для посттранскрипционных регуляторных путей. Среди наиболее изученных цитозольными РНК-связывающих белков железные регуляторные белки, IRP1 и IRP2. Они связывают гладить реактивные элементы (IRES) в нетранслируемых регионов (НТО) нескольких целевых мРНК, тем самым управляя перевод или стабильность мРНК. IRE / ПИВТ взаимодействия были широко изучены EMSA. Здесь мы опишем протокол EMSA для анализа ИРЭ-связывающую активность в IRP1 и IRP2, которые могут быть обобщены для оценки активности других РНК-связывающих белков, а также. Неочищенный лизат белков, содержащих РНК-связывающий белок, или очищенный препарат этого белка, инкубируют с избытком 32 P-меченного зонда РНК, что позволило для образования комплекса. Гепарин добавляется исключает неспецифическое белок, чтобы исследовать связывание. Затем смесь анализируют без денатурации электрофорезом на полиакриламидном геле. Бесплатно зондмигрирует быстро, в то время как РНК / белковый комплекс экспонатов отсталых мобильности; Таким образом, процедура также называется "гель задержка" или "bandshift" анализа. После завершения электрофореза гель сушат и РНК / белковые комплексы, а также свободный зонда, обнаруживаются с помощью авторадиографии. Общая цель протокола заключается в выявлении и количественной IRE / IRP и другие РНК / белковые взаимодействия. Кроме того, EMSA также может быть использован для определения специфичности, аффинности связывания и стехиометрию взаимодействия РНК / белок изучаемого.

Введение

EMSA был первоначально разработан для изучения связи ДНК-связывающих белков с последовательностями ДНК-мишени 1,2. Принцип одинаков для РНК / белковые взаимодействия 3, которая является предметом данной статьи. Вкратце, РНК отрицательно заряженные и будет мигрировать к аноду при не-денатурирующих электрофореза в полиакриламидном (или агарозных гелей). Миграция в геле зависит от размера РНК, которая пропорциональна его заряда. Специфическое связывание белка с РНК изменяет свою подвижность, и комплекс мигрирует медленнее по сравнению со свободной РНК. Это, главным образом, за счет увеличения молекулярной массы, но также к изменениям в ведении и, возможно, конформации. Используя меченой РНК в качестве зонда позволяет легко мониторинг "задержки в геле" или "bandshift". Использование 32 P-меченой РНК зондов является очень распространенным явлением и обладает высокой чувствительностью. Миграция РНК / белковые комплексы и свободной РНК обнаруженыавторадиографией. Недостатки являются короткий период полувыведения из 32 P (14,29 дней), постепенное ухудшение качества зонда из-за радиолиза, требование лицензии радиоактивности и инфраструктуры на предмет радиоактивности работы, и потенциальных проблем биобезопасности. Таким образом, альтернативные-изотопные методы мечения РНК-зонда были разработаны, например, с флуорофорами или биотин, которые позволяют обнаружение флуоресцентной или хемилюминесцентной изображений 4,5. Ограничения этих методов более высокую стоимость и часто пониженная чувствительность по сравнению с изотопной метки, и потенциал неизотопных этикеток вмешиваться взаимодействия РНК / белок. Неденатурирующем гели полиакриламида подходят для большинства применений EMSA и обычно используются. В отдельных случаях, гели агарозы могут представлять собой альтернативу для анализа больших комплексов.

Основным преимуществом EMSA является то, что он сочетает в себе простоту, чувствительность и надежность 4 </ SUP>. Анализ может быть завершена в течение нескольких часов и не требует сложного инструментария. РНК / белковые взаимодействия могут быть обнаружены с помощью EMSA в таких низких концентрациях, как 0,1 нМ или менее, и в широком диапазоне условий связывания (рН 4,0 - 9,5, концентрация соли одновалентного 1 - 300 мм, а температура 0 - 60 ° С).

РНК / белок образование комплекса также может быть изучена с фильтром анализа связывания. Это просто, быстро и недорого процедура, основанная на сохранении РНК / белковых комплексов в нитроцеллюлозный фильтр, в то время как свободной РНК зонд проходит через 6. По сравнению с EMSA, оно ограничено в случаях, когда РНК-зонда содержит несколько сайтов связывания, или неочищенный экстракт содержит более одного РНК-связывающие белки, которые связываются с зондом в том же месте. В то время как несколько РНК / белковые взаимодействия будет избежать обнаружения фильтра-анализе связывания, они могут быть легко визуализированы с помощью EMSA. В некоторых случаях, визуализация наканунеп возможно, когда два РНК / белковые комплексы со мигрируют (например, человек IRP1 / IRE и IRP2 / IRE комплексы), добавляя антитела против одного из РНК-связывающих белков в реакции EMSA, уступая дальнейшее замедление на геле ( "supershift") 7.

EMSA широко используется для изучения IRP1 и IRP2, которые являются пост-транскрипционные регуляторы метаболизма железа 8-10. Они работают путем связывания с ИРЭС филогенетически консервативных шпилька структур в UTRs нескольких мРНК 11. Ires были впервые обнаружены в мРНК, кодирующих ферритина 12 и рецептора трансферрина 1 (TfR1) 13, белки хранения железа и поглощения, соответственно. Позже, Ires были найдены в эритроидных конкретных аминолевулинат синтазы (ALAS2) 14, митохондриальная аконитазы 15, Ferroportin 16, двухвалентный металл транспортера 1 (DMT1) 17, индуцируемого гипоксией фактора 2 α (HIF2α) 18, и других генов 19-21. Н прототип и L-ферритина мРНК содержат один IRE в их 5 'UTR, а TfR1 мРНК содержит несколько Ires в своей 3' UTR. IRE / ПИВТ взаимодействия специфически ингибируют ферритина перевод мРНК пространственно блокируя его ассоциацию 43S субъединицы рибосомы; Кроме того, они стабилизируют TfR1 мРНК против эндонуклеолитическим расщепления. IRP1 и IRP2 доля сходство обширная последовательности и обладают высокой ИРЭ-связывающей активности железосодержащих голодали клеток. В железо-изобилует клеток, IRP1 собирает кубан Fe-S кластер, который преобразует его в цитозоле аконитазы за счет его ИРЭ-связывающей активности, в то время как IRP2 деградирует протеасомной. Таким образом, IRE / ПИВТ взаимодействия зависит от состояния клеточного железа, но также регулируются другими сигналами, такими как H 2 O 2, окись азота (NO) или гипоксии. Здесь мы опишем протокол для оценки ИРЭ-связывающей активности от неочищенных клеточных и тканевых экстрактов EMSA. Мы использовали 32 P-меченого Н-ферритина IRE зонд, который был создан путем транскрипции в пробирке из шаблона плазмидной ДНК (I-12.CAT), где последовательность ИРЭ был первоначально введенного в смысле ориентации ниже по потоку от полимеразы Т7 РНК-сайта путем Клонирование отожженных синтетических олигонуклеотидов 22.

протокол

Экспериментальные процедуры с мышами были утверждены Care комитета животных Университета МакГилл (протокол 4966) мимо.

1. Получение белковых экстрактов из культивируемых клеток

  1. Промыть культивируемые клетки дважды 10 мл охлажденного на льду забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
  2. Собрать прилипшие клетки или с резиновой полицейского или пластмассовым скребком клеток в 1 мл охлажденного льдом PBS, передачи суспензии в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  3. Спина в микроцентрифужных в течение 5 мин при 700 мкг, при 4 ° С. Отберите PBS.
  4. Добавить 100 мкл ледяной цитоплазматической буфера для лизиса (Таблица 1) в 10 7 клеток, и пипеткой вверх и вниз.
  5. Инкубируют на льду в течение 20 мин.
  6. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при 4 ° С.
  7. Отменить осадок. Трансфер супернатант в новую 1,5 мл трубки микроцентрифужных и держать на льду.
  8. Detгорностай концентрацию белка (обычно 1 - 10 мкг / мкл) с помощью 23 Бредфорда.
  9. Кратные и хранить клеточные экстракты при -80 ° С до использования.

2. Подготовка белковые экстракты из мышиной печени и селезенки

  1. Эвтаназии мышь с CO 2 ингаляции.
  2. Положите эвтаназии животных на чистую площадку над вскрытии борту. Откройте живота с ножницами.
  3. Проанализируйте печени и селезенки с помощью ножниц и щипцов и промойте каждой ткани примерно в 50 мл ледяной PBS.
  4. Сразу сократить ткани на мелкие кусочки скальпелем (например: примерно 1 - 2 мм 3).
  5. Без задержек, положить куски ткани в свежем криоскопической пробирки, а затем оснастки заморозить их в жидком азоте. Магазин оснастки замороженных аликвот ткани при температуре -80 ° С до использования.
  6. Перемешать один кусок замороженной ткани (примерно 1 - 2 мм 3) в 0,25 - 0,5 млледяной цитоплазматический буфера для лизиса (Таблица 1) с тканевом гомогенизаторе в течение 10 сек.
  7. Передача гомогената в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и охладить на льду в течение 20 мин.
  8. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при 4 ° С.
  9. Отменить гранул и передачи супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Держите на льду.
  10. Определить концентрацию белка (обычно 1 - 10 мкг / мкл), используя Бредфорда 23.
  11. Кратные и хранить клеточные экстракты при -80 ° С до использования.

3. Получение радиоактивно меченного зонда ИРЭ-

  1. Линеаризации ИРЭ-содержащей плазмиды I-12.CAT 22 путем инкубации при 37 ° С в течение 1 ч с рестриктазой XbaI (1 U на мкг плазмиды), которая расщепляет ниже последовательности IRE. Линеаризованной плазмидной будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции в пробирке.
  2. Настройкап ин витро транскрипции реакцию в общем объеме 20 мкл. С помощью растворы, приведенные в таблице 2, и добавить: 1 мкл линеаризованной плазмидной шаблона, 4 мкл буфера транскрипции; 1 мкл смеси АТФ / CTP / GTP смеси 10 мкл [α- 32 P] -UTP, 2 мкл дитиотреитола, РНКазы ингибитор 1 мкл и 1 мкл РНК-полимеразы Т7. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз.
  3. Инкубируют при 40 ° С в течение 1 ч 24.

4. Очистка радиоактивной ИРЭ-зонда

  1. Завершить в пробирке реакция транскрипции путем добавления 1 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8. перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
  2. Добавить 10 мкл 10 мг / мл тРНК, в качестве носителя для лучшего осаждения. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз.
  3. Добавить 82,5 мкл 3 М ацетата аммония. Смешайте встряхиванием.
  4. Добавить 273 мкл этанола. Смешайте встряхиванием.
  5. Пусть стоять при комнатной температуре в течение 5 мин.
  6. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при комнатной температуре. Удалите супернатант.
  7. Вымойте гранул с 100 мкл 70% этанола.
  8. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при комнатной температуре. Удалите супернатант.
  9. Воздух сухой осадок в течение 10 мин.
  10. Ресуспендируют осадок в 100 мкл бидистиллированной, ранее в автоклаве H 2 O.
  11. Количественная радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном счетчике, аликвоту радиоактивно меченного зонда IRE и хранят при -80 ° С до использования. Замороженные аликвоты могут быть использованы на срок до 3 недель.

5. Получение нативного полиакриламидном геле в EMSA

  1. Соберите гель (16 х 16 см) с помощью 1,5 мм проставки и гребень.
  2. Чтобы приготовить 6% полиакриламидном геле родным, использовать растворы, приведенные в таблице 3 Смешайте 7,5 мл 40% акриламид:. Бис-акриламида, 5 мл 5-кратным КЭ и 37,5 млдвойную дистилляцию H 2 O.
  3. Добавить 0,5 мл 10% свежеприготовленного персульфата аммония (APS) и 25 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED).
  4. Сразу залить раствор акриламида в геле и пусть он полимеризации. Подождите примерно 30 минут.
  5. Соберите электрофореза с гелем, заполните танки с 0,5 × КЭ и соединиться с источником питания.

6. электрофоретической подвижности сдвига Анализ

  1. Развести 25 мкг белкового экстракта из клеток или тканей с цитоплазматической буфере для лизиса (таблица 1) в общем объеме 10 мкл (более низкие концентрации белка также могут быть использованы). Держите на льду. При необходимости добавить 1 мкл 1: 4 разбавляют 2-меркаптоэтанола (2-Me), чтобы активировать спящий IRP1 (конечная концентрация: 2%) 25.
  2. Развести меченых IRE зонд в дважды дистиллированной H 2 O в 200 000 копий в минуту / мкл, тепло денатурация при 95 °С в течение 1 мин, и остыть при комнатной температуре в течение по меньшей мере 5 мин.
  3. Настройка реакции EMSA, добавив 1 мкл меченого ИРЭ зонда выписке белка.
  4. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
  5. Добавить 1 мкл 50 мг / мл гепарина в реакции (ингибировать неспецифические белковые взаимодействия с зондом 9) и продолжают инкубацию в течение еще ​​10 мин. Алиготе исходного раствора гепарина (50 мг / мл) и хранят при -80 ° С.
  6. При использовании длинных радиоактивными зондами (> 60 нуклеотидов), добавляют 1 мкл РНКазы Т1 (1 ед / мкл) и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы уменьшить неспецифическую белок связывания с зондом, и чтобы лучшее разделение РНК / белок Комплекс во время электрофореза.
  7. Добавить 3 мкл загрузочного буфера (80% глицерин + бромфенола синего), перемешать и нагрузка на 6% неденатурирующем полиакриламидном геле.
  8. Запустите гель в течение 60 мин при 130 V (5 В / см).
  9. Transfer гель на большой фильтровальной бумаги и сухим.
  10. Expose в пленку и развивать радиоавтографии. Время экспозиции может находиться в диапазоне от 1 часа (или меньше) до O / N.

Результаты

Радиоактивно IRE проба была приготовлена, как описано в разделах 3 и 4 протокола. Последовательность зонда 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC СГГ C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; в выделенные жирным шрифтом нуклеотиды представляют собой непарный C остаток и цикл, которые являются критическими...

Обсуждение

Здесь мы опишем протокол, который был разработан для изучения IRE-связывающих деятельности IRP1 и IRP2, и мы показываем репрезентативные данные. С помощью различных зондов, этот протокол также может быть скорректирована для изучения других РНК-связывающих белков. Важным шагом является разм...

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
leupeptinSIGMAL2884
PMSFSIGMA78830
BioRad Protein AssayBIORAD500-0006
T7 RNA polymeraseThermoscientificEPO111
RNase InhibitorInvitrogen15518-012
UTP [alpha-32P]Perkin-ElmerNEG507H
Scintillation liquidBeckman Coulter141349
heparinSIGMAH0777
Rnase T1ThermoscientificEN0541
Name of the Equipment
Tissue RuptorQiagen9001271
Scintillation counterBeckman CoulterLS6500
Protean II xi CellBIORAD165-1834
20 wells combsBIORAD165-18681.5 mm thick
1.5 mm spacersBIORAD165-1849
PowerPacBIORAD164-5070

Ссылки

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. . Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

94IREIRP1IRP2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены