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요약

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

초록

RNA / 단백질 상호 작용은 전사 후 조절 경로에 대한 중요합니다. 가장 특징 세포질 RNA 결합 단백질 중 철 조절 단백질, IRP1과 IRP2입니다. 그들은하여 mRNA를 번역 또는 안정성을 제어하는​​ 여러 대상의 mRNA의 번역되지 않은 지역 (UTRs) 내에서 반응 요소 (IRES)을 다림질 결합한다. IRE / IRP 상호 작용은 널리 EMSA에 의해 연구되고있다. 여기서, 우리는 다른 RNA 결합 단백질의 활성을 평가하기 위해 일반화 될 수 IRP1과 IRP2 IRE의 결합 활성을 EMSA 분석 프로토콜을 설명한다. RNA 결합 단백질, 또는이 단백질의 정제 된 제제를 함유하는 조단백질 해물, 복합체 형성을 가능하게 표지 된 32 P-RNA 프로브의 과량과 함께 배양된다. 헤파린 결합 프로브 비 특정 단백질을 배제하기 위해 추가됩니다. 이어서, 혼합물을 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 비 변성 전기 영동에 의해 분석된다. 무료 프로브, 빠른 마이그레이션하는 동안 RNA / 단백질 복합체 전시 지체 이동; 그러므로, 절차는 또한 "겔 위상차"또는 "bandshift"분석 불린다. 전기 영동 완료 후, 겔을 건조 및 RNA / 단백질 복합체,뿐만 아니라 자유 프로브는, 오토 래디오 그래피에 의해 검출된다. 프로토콜의 전반적인 목적은 감지 IRE / IRP 및 기타 RNA / 단백질 상호 작용을 정량화하는 것이다. 또한, EMSA는 조사중인 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 결합 친화력 및 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다.

서문

EMSA는 원래 타겟 DNA 서열과 1,2- DNA 결합 단백질의 관계를 연구하기 위해 개발되었다. 원리는이 문서의 초점이다 RNA / 단백질 상호 작용 3, 비슷합니다. 간단히, RNA는 음전하 폴리 아크릴 아미드 (또는 아가로 오스) 겔에서 전기 영동 비 변성 중에 애노드쪽으로 이동한다. 겔 내에서 마이그레이션 충전량에 비례하는 RNA의 크기에 따라 달라집니다. 특정 RNA에 단백질의 결합은 무료 RNA에 비해 복잡한 마이그레이션하는 느린 이동성을 변경합니다. 이는 분자량의 증가뿐만 아니라, 충전 및 가능한 입체 구조의 변화에​​ 주로 기인한다. 프로브로 표지 된 RNA를 활용하여 "젤 지연"또는 "bandshift"쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 32 P - 라벨 RNA 프로브의 사용은 매우 일반적이며 높은 감도를 제공합니다. RNA / 단백질 복합체 무료 RNA의 이동이 감지된다오토 라디오로. 단점 32 P (14.29 일), 방사선 분해로 인해 프로브의 품질의 점진적인 열화의 짧은 반감기이다 방사능 라이센스 방사능 작업 인프라 및 잠재적 생물 안전성 문제의 요구. 따라서, RNA 프로브 레이블을 대체 비 동위 원소 방법은 형광 또는 화학 발광 영상 4,5의 검출을 가능하게 형광 물질이나 바이오틴,와 예를 들어, 개발되었다. 이러한 방법의 제한은 높은 비용과 동위 원소 라벨에 비해 자주 감소 감도 및 RNA / 단백질 상호 작용을 방해하는 비 동위 원소 라벨의 가능성이 있습니다. 비 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔은 가장 EMSA 애플리케이션에 적합하며 일반적으로 사용된다. 경우에 따라, 아가 로스 젤 큰 단지의 분석을위한 대안을 제기 할 수 있습니다.

EMSA의 주요 장점은 단순성, 감도 및 안정성을 겸비한 4 점이다 </ SUP>. 분석은 몇 시간 내에 완료 될 수 있고, 정교한 장비를 필요로하지 않는다. RNA / 단백질 상호 작용은 0.1 nm 이하의 낮은 농도에서 EMSA에 의해 검출 될 수 있고, 광범위한 결합 조건의 범위 내에서 (pH가 4.0-9.5, 가의 염 농도 1-300 ㎜, 온도 0-60 ℃).

RNA / 단백질 복합체 형성은 필터 결합 분석에 의해 연구 할 수있다. 자유 RNA 프로브가 6을 통과하면서는 니트로 셀룰로오스 필터 RNA / 단백질 복합체의 유지에 기초하여, 간단하고, 빠르고, 저렴한 절차이다. EMSA에 비해, 그것은 RNA 프로브가 다중 결합 부위를 포함하거나 조 추출물이 동일한 사이트에서 프로브에 결합하는 하나 이상의 RNA 결합 단백질이 들어 가지 경우에 한정된다. 여러 RNA / 단백질 상호 작용은 필터 결합 분석에 의해 탐지되지 것이지만, 그들은 용이 EMSA에 의해 시각화 될 수있다. 어떤 경우에는, 시각화 이브이다N 가능한 경우, 겔에 더 지체를 산출, EMSA 반응에 RNA 결합 단백질 중 하나에 대한 항체를 추가하여 공동 마이그레이션 (예를 들어, 인간의 IRP1 / IRE 및 IRP2 / IRE 단지) 두 RNA / 단백질 복합체 ( "supershift") 7.

EMSA 널리 철 대사 8-10의 전사 후 레귤레이터이다 IRP1과 IRP2을 연구하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지의 mRNA (11)의 UTRs 내에서 IRES, 계통 발생 학적으로 보존 헤어핀 구조에 결합함으로써 작동합니다. IRES 먼저 페리틴 (12)와 트랜스페린 수용체 1 (TfR1) (13), 각각 철 저장 및 흡수의 단백질을 암호화하는 mRNA를 발견했다. 나중에, IRES는 적혈구 특정 aminolevulinate 신타 (ALAS2) 14 미토콘드리아 aconitase 15 ferroportin 16, 2가 금속 수송 체 1 (DMT1) 17, 저산소증 유도 성 인자 (2)에서 발견 된 α (HIF2α) (18), 및 기타의 mRNA 19-21. UTR 'TfR1의 mRNA는 3에서 여러 IRES를 포함하는 동안, UTR'프로토 타입 H-와 L-페리틴의 mRNA는 5 일 IRE가 포함되어 있습니다. IRE / IRP의 상호 작용은 특히 입체 43S 리보솜 서브 유닛의의 연결을 차단하여 페리틴 mRNA의 번역을 억제; 또한, 그들은 endonucleolytic 분열에 대한 TfR1 mRNA의 안정화. IRP1과 IRP2 공유 광범위한 서열의 유사성과 철에 굶주린 세포에서 높은 IRE 결합 활성을 나타낸다. IRP2은 프로 테오 열화를 겪는 동안 철 구비 세포에서, IRP1는 그것 IRE 결합능 희생 aconitase 세포질로 변환 쿠반의 Fe-S 클러스터를 조립한다. 따라서, IRE / IRP 상호 작용은 세포 철 상태에 의존 할뿐만 아니라, H 2 O 2, 산화 질소 (NO) 또는 저산소증과 같은 다른 신호들에 의해 조절된다. 여기서는 E에 의해 조 세포 및 조직 추출물에서 IRE - 결합 활성을 평가하기위한 프로토콜을 묘사MSA. 우리는 IRE 서열은 원래 의해 하류 T7 RNA 중합 효소 사이트의 센스 방향에 도입 된 플라스미드 DNA 템플릿 (I-12.CAT)로부터 시험 관내 전사에 의해 생성 된 32 P - 표지 H-페리틴 IRE 프로브를 사용 어닐링 합성 올리고 뉴클레오티드 (22)의 복제.

프로토콜

쥐 실험 절차는 맥길 대학 (프로토콜 4966)의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.

배양 된 세포에서 단백질 추출물 1. 준비

  1. 얼음처럼 차가운 인산 완충 생리 식염수 10 ㎖ (PBS)로 두 번 배양 세포를 씻으십시오.
  2. 고무 경찰관 또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 얼음처럼 차가운 PBS, 전송 현탁액 1 ㎖의 플라스틱 셀 스크레이퍼 중 하나에 부착 된 세포를 다 쳤어요.
  3. 4 ° C에서 700 XG에 5 분의 microcentrifuge에 스핀. 대기음 PBS.
  4. 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 세포질 용해 버퍼 100 ㎕ (표 1)를 추가하고 아래로 피펫.
  5. 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션.
  6. 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀.
  7. 취소 펠렛. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 얼음에 보관하십시오.
  8. DET브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 순백의 단백질 농도.
  9. 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다.

마우스 간 및 비장에서 단백질 추출물 2. 준비

  1. CO 2 흡입으로 마우스를 안락사.
  2. 해부 보드 위에 깨끗한 패드의 안락사 동물을 놓습니다. 가위로 복부를 엽니 다.
  3. 가위 집게를 사용하여 간 및 비장을 해부하고, 약 50 ml의 빙냉 PBS에서 각 조직을 헹군다.
  4. 즉시 메스 작은 조각으로 조직을 절단 (예 : 약 1-2mm 3).
  5. 지체없이 신선한 cryotube에 조직의 조각을 넣고 액체 질소를 고정 스냅. 스토어 스냅인 냉동 조직 씩을 사용할 때까지 -80 ° C에서.
  6. 0.5 ㎖의 - 0.25 - (2 내지 3mm 정도 1) 동결 조직의 한 조각 균질화세포질 빙냉 용해 완충액 (표 1) 10 초 동안 조직 균질화.
  7. 20 분 동안 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관과 진정으로 균질을 전송합니다.
  8. 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀.
  9. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 펠렛 및 전송 상층 액을 제거한다. 얼음에 보관하십시오.
  10. 브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 단백질 농도를 결정합니다.
  11. 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다.

방사성 표지 IRE 프로브 3. 준비

  1. 제한 효소 XbaI으로 (플라스미드 당 1 μg의 U), IRE 서열의 하류로 절단하여, 1 시간 동안 37 ° C에서 배양하여 IRE 함유 플라스미드 I-12.CAT 22 선형화. 선형화 된 플라스미드는 시험 관내 전사를위한 템플릿으로 사용됩니다.
  2. 설정N 체외 20㎕의 전체 부피에서 전사 반응. 표 2에 나타낸 스톡 솔루션을 사용하고 추가 1 μL 선형화 된 플라스미드 주형 4 μL 전사 버퍼; ATP / CTP / GTP 믹스 1 ㎕를 혼합, 10 ㎕의 [α- 32 P] -UTP, 2 μL 디티 오 트레이 톨, 1 ㎕의 RNA 분해 효소 억제제 및 1 μL의 T7 RNA 폴리머 라제. 로 pipetting 아래로 섞는다.
  3. 1 시간 24 40 ° C에서 품어.

방사성 표지 IRE 프로브 4. 정제

  1. 피펫 팅 아래로 0.5 M EDTA, pH가 8 믹스 1 μl를 추가하여 시험 관내 전사 반응을 종료합니다.
  2. 더 나은 침전 캐리어로, 10 ㎎ / ㎖의 tRNA의 10 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다.
  3. 3 M 암모늄 아세테이트 82.5 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다.
  4. 에탄올 273 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다.
  5. 5 분 동안 RT에 서 보자.
  6. RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액.
  7. 워시는 70 % 에탄올 100 ㎕로 펠렛.
  8. RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액.
  9. 10 분 동안 공기 건조 펠렛.
  10. 이중 증류수 100 ㎕에 재현 탁 펠릿은, 이전에 H 2 O를 멸균
  11. 사용할 때까지 -80 ° C에서 액체 섬광 계수기의 방사능, 나누어지는 방사성 동위 원소 표지의 IRE 프로브와 저장소를 정량화. 냉동 분취 최대 3 주 동안 사용될 수있다.

EMSA에 대한 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 5. 준비

  1. 1.5 mm 스페이서와 빗을 사용하여 겔 (16 × 16cm)를 조립합니다.
  2. 표 3에 도시 된 원액을 사용하여, 6 % 폴리 아크릴 아미드 겔 네이티브을 제조 7.5 ㎖의 40 % 아크릴 아미드의 혼합 :. 비스 아크릴 아미드, 5X TBE 5 ㎖과 37.5 ml에더블 증류수 H 2 O
  3. 10 % 새롭게 제조 된 황산 암모늄 (APS) 25 μL의 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)의 0.5 ML을 추가합니다.
  4. 즉시 젤에 아크릴 아미드 솔루션을 붓고 중합 할 수 있습니다. 약 30 분 동안 기다립니다.
  5. 상기 겔 전기 영동 장치를 조립하여 0.5X TBE의 탱크를 채우기와 전원 연결.

6. 전기 이동 기동성 교대 분석 실험

  1. 10 μL의 총 부피에서 세포질 또는 세포 용해 완충액 (표 1)과 조직으로부터의 단백질 추출물의 25 μg의 희석 (저급 단백질 농도도 사용될 수있다). 얼음에 보관하십시오. 25 : 4 휴면 IRP1 (2 % 최종 농도)를 활성화 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME)로 희석 : 필요한 경우, 1의 1 μl를 추가합니다.
  2. 95 °에서 두 번 증류수에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브를 희석 2 O 200,000 CPM / μL, 열 변성에1 분 C, 그리고 적어도 5 분 동안 실온에서 냉각.
  3. 단백질 추출물에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브의 1 μl를 추가하여 EMSA 반응을 설정합니다.
  4. 실온에서 20 분 동안 품어.
  5. 반응 50 ㎎ / ㎖ 헤파린의 1 μl를 추가 (프로브 (9)와 비 특정 단백질 상호 작용을 억제하기 위해) 또 다른 10 분 동안 배양을 계속합니다. -80 ° C에서 스톡 헤파린 용액 (50 ㎎ / ml) 및 저장소 나누어지는.
  6. 긴 방사성 표지 된 프로브 (> 60 개 뉴클레오티드)를 사용하는 경우, 1 μL의 RNase T1 (1 U / μL)를 첨가하고, RT에서 10 분 동안 인큐베이션 프로브 비특이적 결합 단백질을 줄이기 위해, 및 RNA / 단백질의 잘 구분할 수 있도록 전기 영동시 복잡한.
  7. 로딩 버퍼 (80 % 글리세롤 + 브로 모 페놀 블루)의 3 μl를 추가, 혼합 6 % 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에로드.
  8. 130 V (5 V / cm)에서 60 분 동안 젤을 실행합니다.
  9. 티를 ransfer 큰 필터 종이 건조 위에 젤.
  10. 필름에 노출 및 오토 라디오를 개발한다. 노출 시간은 1 시간 (이하)에서 O / N까지의 범위 일 수있다.

결과

섹션 3 및 4 프로토콜에 기재된 방사성 표지 된 프로브 IRE 제조 하였다. 프로브의 서열은 5'-CUG GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC UUCAA C C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '이었다; 굵은 뉴클레오티드는 중요한 IRE 기능입니다 짝이없는 C 잔류 루프를 나타냅니다. 프로브의 특정 방사능 4.5 × 109 CPM / μg의 RNA의이었다.

활성 IRE는 결합에 철 교란의 효과를 평가하기 위해, 뮤린 RAW...

토론

여기서, 우리는 IRP1과 IRP2의 IRE 결합 활동을 연구하기 위해 개발 된 프로토콜을 설명하고 우리는 대표적인 데이터를 보여줍니다. 다른 프로브를 사용함으로써,이 프로토콜은 다른 RNA 결합 단백질의 연구를 위해 조정될 수있다. 중요한 단계는 탐침의 크기이다. 정확한 결합 부위를 알 수없는 경우 일반적인 긴 프로브의 사용은 무료 RNA 다르게 마이그레이션되지 않습니다 RNA / 단백질 복합체가 발생...

공개

The authors declare that they have no competing financial interests.

감사의 말

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
leupeptinSIGMAL2884
PMSFSIGMA78830
BioRad Protein AssayBIORAD500-0006
T7 RNA polymeraseThermoscientificEPO111
RNase InhibitorInvitrogen15518-012
UTP [alpha-32P]Perkin-ElmerNEG507H
Scintillation liquidBeckman Coulter141349
heparinSIGMAH0777
Rnase T1ThermoscientificEN0541
Name of the Equipment
Tissue RuptorQiagen9001271
Scintillation counterBeckman CoulterLS6500
Protean II xi CellBIORAD165-1834
20 wells combsBIORAD165-18681.5 mm thick
1.5 mm spacersBIORAD165-1849
PowerPacBIORAD164-5070

참고문헌

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