Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l'étude des interactions ARN-protéine: L'IRE / IRP Exemple

Résumé

Nous présentons ici un protocole d'analyser les interactions ARN / protéines. L'essai de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) est basé sur la migration différentielle des complexes ARN / ARN et de protéine libre pendant l'électrophorèse sur gel natif. En utilisant une sonde d'ARN radiomarqué, complexes / protéine ARN peuvent être visualisés par autoradiographie.

Résumé

Interactions ARN / protéines sont essentielles pour voies de régulation post-transcriptionnel. Parmi les protéines liant l'ARN cytosoliques les mieux caractérisés sont des protéines régulatrices du fer, et IRP1 IRP2. Ils se lient à repasser éléments sensibles (IRES) dans les régions non traduites (UTR) de plusieurs ARNm cibles, contrôlant ainsi la traduction ou la stabilité des ARNm. Interactions IRE / IRP ont été largement étudiés par l'EMSA. Ici, nous décrivons le protocole EMSA pour analyser l'activité IRE contraignant de IRP1 et IRP2, qui peut être généralisée à évaluer l'activité d'autres protéines liant l'ARN ainsi. Un lysat de protéine brute contenant une protéine de liaison à l'ARN, ou une préparation purifiée de cette protéine, est incubé avec un excès de ³² sonde d'ARN marquée au P, ce qui permet la formation du complexe. L'héparine est ajoutée à empêcher protéine non spécifique de liaison à la sonde. Ensuite, le mélange est analysé par électrophorèse non dénaturante sur un gel de Polyacrylamide. La sonde libremigre rapide, tandis que l'ARN / protéines expositions complexes de mobilité retardée; par conséquent, la procédure est aussi appelé «retard de gel" ou le dosage "de bandshift". Après achèvement de l'électrophorèse, le gel est séché et complexes ARN / protéine, ainsi que la sonde libre, sont détectés par autoradiographie. L'objectif global du protocole est de détecter et de quantifier IRE / IRP et d'autres interactions ARN / protéines. En outre, l'EMSA peut également être utilisé pour déterminer la spécificité, l'affinité de liaison, et la stoechiométrie de l'interaction ARN / protéine à l'étude.

Introduction

L'EMSA a été initialement développé pour étudier l'association de protéines de liaison à l'ADN avec des séquences d'ADN cible ^1,2. Le principe est similaire pour les interactions ARN / protéine ^3, qui est l'objet de cet article. En bref, l'ARN est chargé négativement et migrer vers l'anode pendant l'électrophorèse non dénaturant dans polyacrylamide (ou gels agarose). La migration dans le gel dépend de la taille de l'ARN, qui est proportionnelle à la charge. La liaison d'une protéine spécifique à l'ARN modifie sa mobilité, et les complexes migre plus lentement par rapport à l'ARN libre. Ceci est principalement dû à une augmentation de la masse moléculaire, mais aussi à des altérations de la charge et éventuellement conformation. Utilisant un ARN marqué comme sonde permet un contrôle facile de la «retard de gel" ou "bandshift". L'utilisation de ³² sondes d'ARN P marqué est très répandue et offre une sensibilité élevée. La migration des ARN / complexes de protéines et d'ARN libre sont détectéspar autoradiographie. Inconvénients sont la demi-vie courte de ³² P (14,29 jours), la détérioration progressive de la qualité de la sonde due à la radiolyse, l'exigence d'une licence de la radioactivité et de l'infrastructure pour les travaux de la radioactivité, et de biosécurité préoccupations potentielles. Par conséquent, les méthodes non isotopiques alternatives pour marquage de la sonde d'ARN ont été développés, par exemple avec de la biotine ou des fluorophores, qui permettent une détection par imagerie de fluorescence ou de chimioluminescence ^4,5. Les limitations de ces procédés sont le coût plus élevé et souvent une sensibilité réduite par rapport à marquage isotopique et le potentiel de marqueurs non isotopiques pour interférer avec l'interaction ARN / protéine. Les non-dénaturantes des gels de Polyacrylamide sont appropriés pour la plupart des applications EMSA et sont couramment utilisés. À l'occasion, des gels d'agarose peuvent représenter une alternative pour l'analyse de grands complexes.

Le principal avantage de l'EMSA est qu'il combine la simplicité, la sensibilité et la robustesse ^{4 <}/ Sup>. Le test peut être réalisé en quelques heures et ne nécessite pas une instrumentation sophistiquée. Les interactions ARN / protéine peut être détectée par l'EMSA à des concentrations aussi faibles que 0,1 nm ou moins, et dans une large gamme de conditions de liaison (pH 4,0 à 9,5, monovalent concentration en sel de 1 à 300 mM, et la température de 0 à 60 ° C).

ARN / protéines formation du complexe peut également être étudié par le test de filtre contraignant. Ce est une procédure simple, rapide et peu coûteux basé sur la conservation de complexes ARN / protéines dans un filtre de nitrocellulose, tandis qu'une sonde d'ARN libre passe par ^six. Par rapport à l'EMSA, elle est limitée dans les cas où la sonde d'ARN contient de multiples sites de liaison, ou l'extrait brut contient plus d'une des protéines liant l'ARN qui se lient à la sonde sur le même site. Alors que de multiples interactions ARN / protéines seront échapper à la détection par le test de filtre contraignantes, elles peuvent être facilement visualisés par l'EMSA. Dans certains cas, la visualisation est veillen possible lorsque deux complexes ARN / protéines co-émigrer (par exemple, IRP1 humaine / IRE et IRP2 / complexes IRE), en ajoutant un anticorps dirigé contre l'une des protéines liant l'ARN à la réaction EMSA, ce qui donne encore un retard sur le gel ( "supershift") ^7.

L'EMSA a été largement utilisé pour étudier IRP1 et IRP2, qui sont des régulateurs post-transcriptionnel du métabolisme du fer ^8-10. Ils fonctionnent en se liant à IRE, structures en épingle à cheveux phylogénétiquement conservés dans les UTR de plusieurs ARNm ^11. IRE ont été découverts dans les ARNm codant la ferritine ¹² et récepteur de la transferrine 1 (TfR1) ^13, les protéines de stockage du fer et de l'absorption, respectivement. Plus tard, IRE ont été trouvés dans érythroïde spécifique aminolévulinate synthase (ALAS2) ^14, aconitase mitochondriale ^{15, 16} ferroportine, divalent transporteur de métaux 1 (DMT1) ^17, l'hypoxie inducible factor 2 α (HIF2α) ^18, et d'autres ARNm ^19-21. Le H- prototype et ARNm L-ferritine contiennent une IRE dans leur 5 'UTR, tandis que TfR1 ARNm contient plusieurs IRE à son extrémité 3' UTR. Interactions IRE / IRP spécifiquement inhiber la traduction de l'ARNm de la ferritine en bloquant stériquement son association des sous-unités 43S ribosomique; en outre, ils stabilisent TfR1 ARNm contre clivage endonucléolytique. IRP1 et la part de IRP2 vaste similarité de séquence et de présenter une activité élevée de IRE-contraignant dans les cellules de fer-affamés. Dans les cellules de fer-remplie, IRP1 assemble un cluster Fe-S cubane qu'il convertit en aconitase cytosolique au détriment de son activité IRE contraignant, tandis que IRP2 subit une dégradation par le protéasome. Ainsi, les interactions IRE / IRP dépendent du statut en fer cellulaire, mais sont également régies par d'autres signaux, tels que H ₂ O _2, l'oxyde nitrique (NO) ou hypoxie. Ici, nous décrivons le protocole pour évaluer l'activité IRE liaison à partir d'extraits cellulaires bruts et de tissus par EMSA. Nous avons utilisé une sonde IRE marqué au ^32P H-ferritine qui a été généré par transcription in vitro à partir d'une matrice d'ADN plasmidique (de I-12.CAT), où la séquence IRE a été initialement introduit dans l'orientation sens en aval du site de l'ARN polymerase T7 par clonage des oligonucleotides synthétiques annelés ^22.

Protocole

Les procédures expérimentales sur des souris ont été approuvés par le Comité de l'Université McGill (protocole 4966) de protection des animaux.

1. Préparation d'extraits de protéine à partir de cellules cultivées

1. Laver les cellules en culture à deux reprises avec 10 ml de phosphate refroidie à la glace une solution saline tamponnée (PBS).
2. Grattez cellules adhérentes soit avec une spatule en caoutchouc ou d'un grattoir à cellules en plastique dans 1 ml de PBS, le transfert suspension glacée dans un tube de 1,5 ml.
3. Centrifugeuse à 5 min à 700 xg, à 4 ° C. Aspirer PBS.
4. Ajouter 100 pi de tampon de lyse cytoplasmique glacée (Tableau 1) par 10 ⁷ cellules, et la pipette de haut en bas.
5. Incuber sur de la glace pendant 20 min.
6. Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à 4 ° C.
7. Jeter culot. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et garder sur la glace.
8. Determine concentration de protéine (généralement de 1 à 10 ug / ul) en utilisant le ²³ dosage de Bradford.
9. Aliquoter et cellulaires magasin extraits à -80 ° C jusqu'à utilisation.

2. Préparation d'extraits de protéine à partir de foie et la rate de souris

1. Euthanasier une souris avec inhalation de CO _2.
2. Placez l'animal euthanasié sur un tapis propre sur une planche de dissection. Ouvrez l'abdomen avec des ciseaux.
3. Disséquer le foie et la rate à l'aide des ciseaux et des pinces, et rincer chaque tissu dans du PBS environ 50 ml de glace-froid.
4. Tissus en petits morceaux immédiatement couper avec un scalpel (par exemple: environ 1-2 mm ^3).
5. Sans délai, mettre des morceaux de tissus dans une nouvelle cryotube puis enclenchez les congeler dans l'azote liquide. Magasin enfichable aliquotes congelées de tissus à -80 ° C jusqu'à utilisation.
6. Homogénéiser une seule pièce de tissu congelé (environ 1-2 mm ³⁾ 0,25 au 0,5 ml deglacé tampon de lyse cytoplasmique (tableau 1) avec un homogénéisateur de tissu pendant 10 sec.
7. Transfert homogénat à 1,5 ml microtube et le froid sur la glace pendant 20 min.
8. Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à 4 ° C.
9. Jeter culot et le transfert surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Garder sur la glace.
10. Déterminer la concentration en protéine (généralement de 1 à 10 ug / ul) en utilisant le ²³ dosage de Bradford.
11. Aliquoter et cellulaires magasin extraits à -80 ° C jusqu'à utilisation.

3. Préparation de Radiolabeled IRE-sonde

1. Linéariser le plasmide contenant IRE I-12.CAT ²² par incubation à 37 ° C pendant 1 heure avec l'endonucléase de restriction XbaI (1 U par pg de plasmide), qui clive en aval de la séquence IRE. Le plasmide linéarisé est utilisé comme matrice pour la transcription in vitro.
2. Mettre en place unn in vitro réaction de transcription dans un volume total de 20 ul. Utiliser les solutions mères indiqués dans le tableau 2 et ajouter: 1 ul de modèles de plasmide linéarisé, un tampon de transcription 4 pi; 1 pl de mélange ATP / CTP / GTP mélange, 10 ul de [α- ³² P] -UTP, 2 pl de dithiothréitol, un inhibiteur de RNase et 1 pi 1 pi d'ARN polymerase de T7. Mélanger en pipetant.
3. Incuber à 40 ° C pendant 1 h ^24.

4. Purification de Radiolabeled IRE-sonde

1. Mettre fin à la réaction de transcription in vitro par addition de 1 pi d'EDTA 0,5 M, pH 8. Mélanger en pipetant de haut en bas.
2. Ajouter 10 ul de 10 mg / ml d'ARNt, en tant que support pour une meilleure précipitation. Mélanger en pipetant.
3. Ajouter 82,5 ul de 3 M d'acétate d'ammonium. Mélanger au vortex.
4. Ajouter 273 ul d'éthanol. Mélanger au vortex.
5. Laisser reposer à température ambiante pendant 5 min.
6. Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à température ambiante. Surnageant défausse.
7. Laver culot avec 100 pi d'éthanol à 70%.
8. Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à température ambiante. Surnageant défausse.
9. Air culot sec pendant 10 min.
10. Resuspendre le culot dans 100 pi de double distillée, préalablement autoclave H ₂ O.
11. Quantifier la radioactivité dans un compteur à scintillation liquide, sonde IRE aliquote de radiomarqué et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Aliquots congelés peuvent être utilisés pour 3 semaines.

5. Préparation d'un gel de Polyacrylamide natif à EMSA

1. Assemblez le gel (16 x 16 cm) en utilisant 1,5 entretoises mm et peigne.
2. Pour préparer un gel de Polyacrylamide natif à 6%, utiliser les solutions mères indiqués dans le tableau 3 Mélanger 7,5 ml de 40% d'acrylamide. Bisacrylamide, 5 ml de TBE 5x et 37,5 mlDouble H ₂ O. distillée
3. Ajouter 0,5 ml de 10% persulfate fraîchement préparée d'ammonium (APS) et 25 ul tétraméthyléthylènediamine (TEMED).
4. Verser immédiatement la solution d'acrylamide au gel et laissez polymériser. Attendez environ 30 min.
5. Monter l'appareil d'électrophorèse avec le gel, remplir les réservoirs avec 0,5x TBE et se connecter avec l'alimentation.

6. mobilité électrophorétique Maj Assay

1. Diluer 25 pg d'extrait de protéine à partir de cellules ou de tissus avec cytoplasmique tampon de lyse (tableau 1) dans un volume total de 10 ul en (concentrations de protéine plus faibles peuvent également être utilisés). Garder sur la glace. Si nécessaire, ajouter 1 pl de 1: 4 dilué 2-mercaptoéthanol (2-ME) pour activer IRP1 dormance (concentration finale: 2%) ^25.
2. Diluer la sonde IRE radiomarqué en chambre double H ₂ O distillée à 200 000 cpm / ul, dénaturation thermique à 95 °C pendant 1 min, et refroidir à la température ambiante pendant au moins 5 min.
3. Mettre en place une réaction EMSA en ajoutant 1 pl de la sonde IRE radiomarqué à l'extrait de protéine.
4. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
5. Ajouter 1 pi de 50 mg / ml d'héparine à la réaction (à inhiber les interactions protéiques non spécifiques avec la sonde ⁹⁾ et poursuivre l'incubation pendant encore 10 min. Aliquoter la solution mère de l'héparine (50 mg / ml) et conserver à -80 ° C.
6. Lors de l'utilisation de longues sondes radiomarquées (> 60 nucleotides), ajouter 1 pl de RNase T1 (1 U / ul) et incuber pendant 10 min à température ambiante pour réduire la protéine non spécifique à la liaison à la sonde, et pour permettre une meilleure séparation de l'ARN / protéine complexe au cours de l'électrophorèse.
7. Ajouter 3 pi de tampon de chargement (80% de glycérol + bleu bromophénol), mélanger et la charge sur le gel de polyacrylamide non dénaturant 6%.
8. Exécutez le gel pendant 60 min à 130 V (5 V / cm).
9. Transfert du gel sur un grand papier filtre et sèche.
10. Exposer à un film et développer autoradiographie. Temps d'exposition peut varier de 1 h (ou moins) jusqu'à O / N.

Résultats

Une sonde IRE radiomarqué a été préparé, comme décrit dans les sections 3 et 4 du protocole. La séquence de la sonde était 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; les nucléotides gras représentent un résidu C non apparié et la boucle, qui sont caractéristiques IRE critiques. La radioactivité spécifique de la sonde est de 4,5 x 10 ⁹ cpm / ug d'ARN.

Pour évaluer les effets des perturbat...

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole qui a été mis au point pour étudier les activités IRE contraignants de IRP1 et IRP2, et nous montrons des données représentatives. En utilisant différentes sondes, ce protocole peut également être ajustée pour l'étude d'autres protéines liant l'ARN. Une étape critique est la taille de la sonde. L'utilisation de sondes longues, ce qui est fréquent lorsque le site de liaison exacte est inconnue, peut entraîner des complexes ARN / protéine qui ne migrent pas...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
leupeptin	SIGMA	L2884
PMSF	SIGMA	78830
BioRad Protein Assay	BIORAD	500-0006
T7 RNA polymerase	Thermoscientific	EPO111
RNase Inhibitor	Invitrogen	15518-012
UTP [alpha-32P]	Perkin-Elmer	NEG507H
Scintillation liquid	Beckman Coulter	141349
heparin	SIGMA	H0777
Rnase T1	Thermoscientific	EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor	Qiagen	9001271
Scintillation counter	Beckman Coulter	LS6500
Protean II xi Cell	BIORAD	165-1834
20 wells combs	BIORAD	165-1868	1.5 mm thick
1.5 mm spacers	BIORAD	165-1849
PowerPac	BIORAD	164-5070