El uso de Chironomidae (Diptera) en superficie flotante pupal Exuviae como Protocolo Bioassessment rápida para las Masas de Agua

Resumen

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

Resumen

Protocolos Bioevaluación rápidos utilizando ensambles de macroinvertebrados bentónicos se han utilizado con éxito para evaluar los impactos humanos sobre la calidad del agua. Desafortunadamente, los métodos de muestreo tradicionales bentónicos larvales, como el dip-red, puede llevar mucho tiempo y es caro. Un protocolo alternativo implica colección de Chironomidae exuviae pupa-flotante de superficie (SFPE). Chironomidae es una familia rica en especies de moscas (Diptera) cuyas etapas inmaduras suelen ocurrir en los hábitats acuáticos. Quironómidos adultas emergen del agua, dejando su piel pupa o exuviae, flotando en la superficie del agua. Exuviae menudo se acumulan a lo largo de los bancos o detrás de obstrucciones por la acción de la corriente de viento o el agua, donde pueden ser recogidos para evaluar la diversidad y riqueza de quironómidos. Quironómidos pueden ser utilizados como indicadores biológicos importantes, ya que algunas especies son más tolerantes a la contaminación que otros. Por lo tanto, la abundancia y composición de especies relativa de recogida SFPE reflejanlos cambios en la calidad del agua. Aquí, los métodos asociados con la recolección de campo, procesamiento de laboratorio, el montaje de diapositivas, y la identificación de quironómidos SFPE se describen en detalle. Ventajas del método SFPE incluyen perturbación mínima en un área de muestreo, recogida de muestras eficaz y económica y el procesamiento de laboratorio, la facilidad de identificación, aplicabilidad en casi todos los ambientes acuáticos, y una medida potencialmente más sensible de estrés ecosistema. Las limitaciones incluyen la incapacidad para determinar el uso microhabitat larval y la incapacidad para identificar exuviae pupal a las especies si no se han asociado con los hombres adultos.

Introducción

Programas de monitoreo biológico, que utilizan organismos vivos para evaluar la salud del medio ambiente, a menudo se utilizan para evaluar la calidad del agua o monitorear el éxito de los programas de restauración de los ecosistemas. Protocolos Bioevaluación rápidos (RBP) utilizando ensambles de macroinvertebrados bentónicos han sido populares entre los organismos de los recursos hídricos del estado desde 1989 ^1. Los métodos tradicionales de muestreo de macroinvertebrados bentónicos de las prácticas comerciales restrictivas, como el dip-net, Surber sampler, y Hess sampler ^2, puede ser tiempo- lento, caro, y sólo podrán medir los conjuntos de un particular, microhábitat ^3. Un RBP eficiente, alternativa para la generación de información biológica sobre un cuerpo de agua en particular implica colección de Chironomidae exuviae pupa-flotante de superficie (SFPE) ^3.

El Chironomidae (Insecta: Diptera), conocido comúnmente como mosquitos no pican, son moscas holometabolous que ocurren típicamente en ambientes acuáticos antes de emerger como adultos 60; en la superficie del agua. La familia de quironómidos es rico en especies, con aproximadamente 5.000 especies descritas en el mundo; Sin embargo, se estima que hasta 20.000 especies de existir ^4. Quironómidos son útiles en la documentación de agua y la calidad del hábitat en muchos ecosistemas acuáticos debido a su alta diversidad y los niveles de tolerancia de contaminación variables ^5. Además, a menudo son los macroinvertebrados bentónicos más abundantes y generalizadas en los sistemas acuáticos, por lo general representan el 50% o más de las especies en la comunidad ^5,6. A raíz de la emergencia del adulto terrestre, la exuviae pupa (fundido de la piel de pupa) permanece flotando en la superficie del agua (Figura 1). Exuviae pupa se acumulan a lo largo de los bancos o detrás de las obstrucciones a través de la acción de la corriente de viento o agua y se pueden recoger con facilidad y rapidez para dar una muestra completa de especies quironómidos que han surgido durante el 24-48 hr anterior ^7.

ntent "> La abundancia relativa y la composición taxonómica de recogida SFPE refleja la calidad del agua, teniendo en cuenta que algunas especies son muy tolerantes a la contaminación, mientras que otros son muy sensibles ⁵ El método SFPE tiene muchas ventajas sobre las técnicas de muestreo de larvas de quironómidos tradicionales, incluyendo:. (1) mínimo , en su caso, la perturbación del hábitat se produce en un área de muestreo, (2) las muestras no se centran en la recogida de los organismos vivos, sino más bien la piel no vivos, por lo que la trayectoria de la dinámica de la comunidad no se ve afectada; (3) la identificación a nivel de género, y a menudo las especies, es relativamente fácil dado claves y descripciones ³ apropiadas; (4) la recogida, el procesamiento y la identificación de las muestras es eficiente y económica en comparación con los métodos de muestreo tradicionales ^3,8,9; (5) exuviae acumulados representan taxones que se han originado a partir de una amplia gama de microhábitats ^10, (6) el método es aplicable en casi todos los ambientes acuáticos, incluyendo arroyos y ríos, estuarios, lakes, estanques, piscinas de roca, y humedales; y (7) SFPE tal vez sea un indicador más sensible de la salud del ecosistema, ya que representan las personas que han completado todas las etapas inmaduras y surgido con éxito como adultos ^11.

El método SFPE no es un nuevo enfoque para la recopilación de información sobre las comunidades quironómidos. El uso de SFPE fue sugerido por primera vez por Thienemann ¹² en el año 1900. Una variedad de estudios han utilizado SFPE para las encuestas taxonómicos (por ejemplo, ^13-15), la biodiversidad y los estudios ecológicos (por ejemplo, ^7,16-19), y las evaluaciones biológicas (por ejemplo, ^20-22). Además, algunos estudios han abordado diferentes aspectos del diseño de la muestra, tamaño de la muestra, y el número de eventos de muestra requeridos para alcanzar diferentes niveles de detección de especies o géneros (por ejemplo, ^8,9,23). Estos estudios indican que relativamente altos porcentajes de especies o géneros pueden ser detectados con effor moderadat o gastos asociados con el procesamiento de la muestra. Por ejemplo, Anderson y Ferrington ⁸ determinaron que en base a una submuestra de 100 cargos, se requiere ^1/3 menos tiempo para recoger muestras SFPE comparación con sumergir-net muestras. Otro estudio determinó que las muestras 3-4 SFPE podrían ser ordenados e identificados para cada muestra por inmersión en red y que las muestras SFPE fueron más eficientes que las muestras por inmersión en red en especies como la detección de la riqueza de especies aumentó ^3. Por ejemplo, en sitios con riqueza de especies valores de 15 a 16 especies, la eficiencia dip-neto medio fue del 45,7%, mientras que las muestras SFPE eran 97,8% de eficiencia ^3.

Es importante destacar que el método SFPE ha sido estandarizado en la Unión Europea ²⁴ (conocido como técnica de exuviae pupal quironómidos (CPET)) y América del Norte ²⁵ para la evaluación ecológica, pero el método no se ha descrito en detalle. Una aplicación de la metodología SFPE fue descrito por Ferrington, et al. 3; sin embargo, el objetivo principal de este estudio fue evaluar la eficiencia, eficacia y economía del procedimiento de SFPE. El propósito de este trabajo es describir todas las etapas del procedimiento SFPE en detalle, incluyendo la recogida de muestras, procesamiento de laboratorio, el montaje de diapositivas, y la identificación de género. El público objetivo incluye a los estudiantes de postgrado, investigadores y profesionales interesados ​​en la expansión de los esfuerzos tradicionales de monitoreo de calidad del agua en sus estudios.

Protocolo

1. Preparación de Suministros Colección de campo

1. Determinar el número de muestras SFPE que deben ser recogidos en base al diseño del estudio y adquieren un frasco de la muestra (por ejemplo, 60 ml) para cada muestra.
2. Preparar dos etiquetas de fecha y localidad de cada frasco de muestra. Coloque uno en el interior y fijar el otro a la parte exterior del recipiente. Asegúrese de que cada etiqueta la fecha y localidad incluye la siguiente información: país, estado, condado, ciudad, cuerpo de agua, coordenadas GPS, la fecha y nombre de la persona (s) recoger la muestra.
3. Reúna otros materiales y equipos (véase la Tabla de Materiales Específicos / Equipo) específicos.

2. Colección Campo

1. Mantenga una bandeja larval en una mano y un tamiz en la otra. Sumerja la bandeja de larvas en el agua donde SFPE acumular (por ejemplo, las acumulaciones de espuma, ganchos, vegetación emergente, escombros, de vuelta remolinos, ya lo largo de los bordes de banco) (Figura 2A), permiten water, exuviae, y escombros para entrar en la bandeja larval, y vierta este material a través del tamiz. Si el muestreo en un sistema lótica, comienza en el extremo de aguas abajo del alcance de la muestra y funciona aguas arriba (Figura 2B). Si el muestreo en un sistema lénticos, comience por la costa a sotavento.
   1. Repita el paso 2.1 durante 10 minutos (o según se defina lo contrario para un régimen de muestreo específico) dentro de cada muestra de alcance predefinido (típicamente 100 a 200 m de las muestras obtenidas de los arroyos, pero depende de la superficie total del sitio de monitoreo acuático); moverse entre las áreas de acumulación SFPE según sea apropiado.
2. Concentrar los desechos en un área del tamiz utilizando una jeringa llena de agua desde el sitio de la muestra y transferir cuidadosamente la muestra SFPE para pre-marcado tarro de muestra con la ayuda de unas pinzas y una corriente de etanol a partir de una botella con atomizador. Llene el tarro de la muestra con etanol.
3. Repetir los pasos 2.1 a 2.2 para todas las muestras.

Picking 3. Muestra

NOTA: El resto de este protocolo se refiere a una submuestra SFPE 300 y puede necesitar ser modificado para otros tamaños submuestra. Ver ⁹ directrices submuestreo y frecuencia de muestreo y de Bouchard Ferrington para adaptar métodos SFPE para cumplir con las metas y los recursos específicos de estudiar.

1. Asignar un vial de 1 copita para cada muestra SFPE; preparar una etiqueta de fecha y localidad para colocar dentro de cada vial y llenar el vial ¾ de su capacidad con etanol.
2. Retire la tapa del frasco de la muestra correspondiente y comprobar exuviae pupa adjunto. Enjuague suavemente contenidos fuera de la tapa en una placa de Petri utilizando una jeringa llena de etanol. Localice y retire la etiqueta de la parte interior de la jarra de la muestra utilizando pinzas y suavemente enjuague contenidos fuera de la etiqueta en la placa de Petri. Conjunto de etiquetas de lado.
3. Transferir el contenido de la jarra de muestra en una bandeja larval, aclarando con etanol para asegurar que no SFPE permanecen en el frasco de muestra. Transferir una porción de la exuviae pupa, residebido, y etanol a partir de la bandeja a la placa de Petri. Asegúrese de que la muestra se cubre en etanol.
4. Coloque la placa de Petri con un microscopio estéreo. Explorar sistemáticamente el contenido de la cápsula de Petri para exuviae pupa. Elige las exuviae pupa desde el plato con unas pinzas y el lugar en el vial. No recoger especímenes que se rompen (es decir, no tener por lo menos la mitad del cefalotórax y el abdomen), secos, o comprimido para evitar problemas de identificación posteriores.
   NOTA: Identificación de especies a menudo requiere que la totalidad de la muestra está presente, aunque en algunos casos, la identificación a nivel de género puede ser posible con muestras parciales.
   1. Plato remolino y escanear para exuviae adicional de pupa, incluyendo cualquier que podría ser pegado a los lados del plato, así como, las muestras pequeñas y translúcidas que pueden no haber ser detectado inicialmente. Repita hasta dos exploraciones consecutivas no muestran exuviae pupa adicional.
5. Repita los pasos 3,3 y3,4 hasta que todos o 300 exuviae pupa se han recogido. Cuando 300 exuviae pupal han sido recogidos, devuelva el residuo de la placa de Petri a la bandeja larval y enjuagar la placa de Petri con etanol. A continuación, transferir el residuo de la bandeja de larvas al tarro de la muestra vacía, agregue la etiqueta de fecha y localidad, y poner la tapa en el frasco. Retener o disponer de los residuos de acuerdo con los protocolos específicos del proyecto.

4. Muestra Clasificación

1. Vierta todo recogió exuviae pupal del vial etiquetado en una placa de Petri llena con suficiente etanol para cubrir sólo especímenes.
2. Bajo un microscopio estereoscópico, muestras separadas en grupos morfológicos distintos (es decir, morfotaxa) y colocan cada morfogénero en forma separada unos frascos etiquetados llenan 3/4 ^º completa con etanol.
   1. Utilizar las características morfológicas externas para separar morfotaxa quironómidos. Por ejemplo, desde el cefalotórax, utilizar diferencias en la presencia, tamaño, forma, ycoloración de los tubérculos cefálicos, verrugas frontales, setas frontal y cuerno torácico. Desde el abdomen, utilice espinas, hookrows, piel de zapa, setas y las estribaciones de los segmentos abdominales, además de los lóbulos anales para la separación morfotaxa (Figura 4A). Ver Ferrington, et al. ^5, Sæther ^26, Pinder y Reiss ²⁷ para las descripciones y figuras de características morfológicas adicionales.
   2. Utilice etanol adicional si especímenes comienzan a secarse.

5. Deslice montaje

1. Llenar un pocillo de una placa de múltiples pocillos para cada morfogénero con etanol al 95%.
   1. Coloca múltiples representaciones (por ejemplo, 25% del total) de cada morfogénero a diapositiva montada en pocillos individuales de la placa. Permitir que los especímenes se sienten en bien durante al menos 10 minutos para deshidratar suficientemente.
2. Diapositivas de la etiqueta con sitio apropiado, recolección y informati identificaciónen (Figura 3).
3. Lugar de diapositivas en el microscopio estéreo.
   NOTA: Una plantilla de la diapositiva pegada al escenario es útil para la colocación consistente.
4. Coloque una gota de Euparal en la diapositiva; difundir la Euparal de manera que se aproxima el tamaño del cubreobjetos. Utilice una ventilación adecuada cuando se trabaja con Euparal.
   NOTA: Use una ventilación adecuada cuando se trabaja con Euparal.
5. Insertar un representante de la primera morfogénero en el Euparal utilizando fórceps.
   NOTA: Para anular el exceso de etanol a partir de la muestra, usando unas pinzas, golpee suavemente la muestra de laboratorio se limpia antes de incrustarlo en Euparal.
6. Separar la cephalothorax desde el abdomen utilizando pinzas de punta fina y / o sondas de disección (Figura 4A).
   1. Dividir la cephalothorax a lo largo de la sutura ecdisial (Figura 4B) y abra la cephalothorax modo que los bordes de sutura están en lados opuestos (Figura 4C).
   2. Oriente la cephalothorax de manera que la parte ventral es hacia arriba (Figura 4C).
   3. Coloque la parte dorsal del abdomen hasta; colocar inmediatamente debajo del cefalotórax (Figura 4C).
7. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra. Mantenga cubreobjetos en un ángulo, con un borde de tocar la diapositiva, y luego baja lentamente y colocar el cubreobjetos para reducir la formación de burbujas de aire. Presione ligeramente el cubreobjetos para aplanar la muestra.
8. Repita los pasos 5.3 a través de 5.7 para todas las muestras deshidratadas.

6. Género identificación

1. Determinar género de muestras de diapositivas montadas utilizando un microscopio compuesto. Identificar especímenes al género usando las teclas y diagnósticos en Wiederholm 28 y Ferrington, et al. ^5. Si es necesario, confirmar la identificación a nivel de familia usando Ferrington, et al. ^5. NOTA: Se han producido numerosas descripciones genéricas y revisiones desde Wiederholm ²⁸ y Ferrington,et al. ^5, por lo tanto, estas teclas y diagnósticos son incompletos y deben ser complementados con la literatura primaria.

Resultados

La Figura 1 ilustra el ciclo de vida de quironómidos; estados inmaduros (huevo, larva, pupa) normalmente tienen lugar en, o estrechamente relacionados con, un ambiente acuático. Al término de la etapa de la vida de las larvas, la larva construye un refugio en forma de tubo y se une con las secreciones de seda al sustrato circundante y la pupación se produce. Una vez que el adulto en desarrollo ha madurado, la pupa se libera y nada hacia la superficie del agua, donde el adulto puede emerger de la pup...

Discusión

Los pasos más críticos para el éxito de la colección SFPE muestra, selección, clasificación, montaje de diapositivas, y la identificación son: (1) las zonas de alta acumulación SFPE dentro del área de estudio localizar durante la recolección de campo (Figura 2); (2) explorar lentamente el contenido de la placa de Petri para la detección de todos SFPE durante muestra de picking; (3) el desarrollo de la destreza manual necesaria para diseccionar el cephalothorax desde el abdomen durante el mont...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	70-95%
Plastic wash bottles	Fisher Scientific	0340923B
Sample jar	Fisher Scientific	0333510B	Glass or plastic, 60-mL recommended
Testing sieve	Advantech	120SS12F	125-micron mesh size
Larval tray	BioQuip	5524	White
Stereo microscope
Glass shell vials	Fisher Scientific	0333926B	1-dram size
Plastic dropper	Thermo Scientific	1371110	30 to 35 drops/mL
Fine forceps	BioQuip	4524	#5
Petri dish	Carolina	741158	Glass or plastic
Multi-well plate	Thermo Scientific	144530	Glass or plastic
Glass microslides	Thermo Scientific	3010002	3 x 1 in.
Glass cover slips	Thermo Scientific	12-519-21G	Circular or square
Euparal mounting medium	BioQuip	6372B
Pigma pen	BioQuip	1154F	Black
Probe	BioQuip	4751
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional™	34120