Uso di Chironomidae (Ditteri) pupa esuvie come Rapid Bioassessment protocollo per i corpi idrici-galleggiante Surface

Riepilogo

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

Abstract

Protocolli bioassessment veloce con assemblaggi di macroinvertebrati bentonici sono stati utilizzati con successo per valutare l'impatto umano sulla qualità dell'acqua. Purtroppo, i metodi di campionamento tradizionali bentonici larvale, come il dip-net, possono essere in termini di tempo e costosa. Un protocollo alternativo prevede la raccolta di Chironomidae pupa esuvie fluttuante superficie (SFPE). Chironomidae è una famiglia ricca di specie di mosche (Ditteri) le cui fasi immature tipicamente si verificano in habitat acquatici. Chironomidi adulti emergono dall'acqua, lasciando la pelle pupa o esuvie, che galleggia sulla superficie dell'acqua. Esuvie spesso si accumulano lungo le sponde o dietro ostruzioni da parte all'azione del vento o l'acqua corrente, dove possono essere raccolti per valutare la diversità chironomidi e ricchezza. Chironomidi possono essere utilizzati come indicatori biologici importanti, poiché alcune specie sono più tolleranti all'inquinamento di altri. Pertanto, l'abbondanza relativa e la composizione delle raccolte SFPE rifletterecambiamenti nella qualità dell'acqua. Qui, metodi associati raccolta sul campo, l'elaborazione in laboratorio, il montaggio scorrevole, e l'identificazione di chironomid SFPE sono descritte in dettaglio. I vantaggi del metodo SFPE includono minimo disturbo in una zona di prelievo, raccolta del campione efficiente ed economico e relativi laboratori, facilità di identificazione, applicabilità in quasi tutti gli ambienti acquatici, e una misura potenzialmente più sensibile di stress dell'ecosistema. Limitazioni includono l'impossibilità di determinare l'uso microhabitat larvale e l'incapacità di individuare esuvie pupa specie se non sono stati associati con i maschi adulti.

Introduzione

Programmi di monitoraggio biologico, che utilizzano organismi viventi per valutare la salute ambientale, sono spesso utilizzati per valutare la qualità dell'acqua o monitorare il successo dei programmi di risanamento degli ecosistemi. Protocolli bioassessment Rapid (RBP) utilizzano assemblaggi di macroinvertebrati bentonici sono stati popolari tra agenzie statali delle risorse idriche dal 1989 ^1. I metodi tradizionali di campionamento macroinvertebrati bentonici per RBPs, come ad esempio il dip-net, Surber campionatore, e Hess campionatore ^2, può essere tempo- , costoso, e può misurare solo assemblaggi da un particolare microhabitat ^3. Un efficiente, RBP alternativa per la generazione di informazioni biologiche su un determinato corpo idrico prevede la raccolta di Chironomidae esuvie pupa-galleggiante di superficie (SFPE) ^3.

Il Chironomidae (Insecta: Diptera), comunemente noto come moscerini non pungenti, sono le mosche olometaboli che si verificano in genere in ambienti acquatici prima di emergere come adulti 60, sulla superficie dell'acqua. La famiglia chironomidi ricche di specie, con circa 5.000 specie descritte in tutto il mondo; tuttavia, ben 20.000 specie sono stimati a esistere ^4. Chironomidi sono utili per documentare la qualità dell'acqua e degli habitat in molti ecosistemi acquatici a causa della loro elevata diversità e variabili livelli di tolleranza inquinamento ^5. Inoltre, essi sono spesso i più abbondanti e diffusi macroinvertebrati bentonici in sistemi acquatici, in genere pari al 50% o più delle specie nella comunità ^5,6. Dopo emersione dell'adulto terrestre, il esuvie pupa (fuso pelle pupa) rimane che galleggia sulla superficie dell'acqua (Figura 1). Esuvie pupa si accumulano lungo le sponde o dietro gli ostacoli attraverso l'azione della corrente del vento o l'acqua e possono essere facilmente e rapidamente raccolti per dare un campione globale di specie chironomidi che sono emerse durante il precedente 24-48 ore ^7.

S copi "> L'abbondanza relativa e la composizione tassonomica di raccolta SFPE riflette la qualità delle acque, considerando che alcune specie sono l'inquinamento molto tolleranti, mentre altri sono molto sensibili ⁵ Il metodo SFPE ha molti vantaggi rispetto alle tecniche di campionamento chironomidi larvale tradizionali, tra cui:. (1) minima , se del caso, habitat anomalia si verifica in una zona di campionamento; (2) i campioni non si concentrano sulla raccolta di organismi viventi, ma piuttosto il non vivente pelle, in modo che la traiettoria di dinamiche comunitarie non sono interessati, (3) l'identificazione di genere, e spesso le specie, è relativamente facile dato le chiavi e le descrizioni ³ appropriati; (4) la raccolta, l'elaborazione e l'identificazione dei campioni è efficiente ed economico rispetto ai metodi di campionamento tradizionali ^3,8,9, (5) esuvie accumulati rappresentano taxa che abbia avuto origine da una vasta gamma di microhabitat ^10, (6) il metodo è applicabile in quasi tutti gli ambienti acquatici, compresi i torrenti e fiumi, estuari, lakes, stagni, piscine naturali e delle zone umide; e (7) SFPE forse essere un indicatore più sensibile della salute degli ecosistemi in quanto rappresentano gli individui che hanno completato tutte le fasi immature e emerse con successo da adulti ^11.

Il metodo SFPE non è un nuovo approccio per la raccolta di informazioni sulle comunità chironomidi. L'uso di SFPE fu suggerita da Thienemann ¹² nei primi anni del 1900. Una serie di studi hanno usato SFPE per le indagini tassonomiche (ad esempio, ^13-15), la biodiversità e studi ecologici (ad esempio ^7,16-19), e le valutazioni biologiche (ad esempio, ^20-22). Inoltre, alcuni studi hanno affrontato diversi aspetti del piano di campionamento, dimensione del campione, e il numero di eventi di campione necessari per il raggiungimento di vari livelli di rilevamento di specie o di generi (ad esempio, ^8,9,23). Questi studi indicano che relativamente alte percentuali di specie o di generi possono essere rilevati con moderata effort o spese connessi con l'elaborazione del campione. Ad esempio, Anderson e Ferrington ⁸ stabilito che sulla base di un sottocampione di 100-conteggio, ^1/3 meno tempo è stato necessario per raccogliere campioni SFPE rispetto a tuffo-net campioni. Un altro studio ha determinato che 3-4 i campioni SFPE possono essere ordinati e identificati per ogni campione dip-net e che i campioni SFPE sono più efficienti rispetto ai campioni dip-net a specie di rivelazione come ricchezza di specie è aumentato ^{di 3.} Per esempio, in luoghi con ricchezza di specie valori di 15-16 specie, l'efficienza dip-medio netto è stato del 45,7%, mentre i campioni SFPE erano 97,8% efficiente ^3.

È importante sottolineare che il metodo SFPE è stato standardizzato nell'Unione europea ²⁴ (conosciuta come tecnica chironomidi pupa esuvie (CPET)) e in Nord America ^{il 25} per valutazione ecologica, ma il metodo non è stato descritto in dettaglio. Una applicazione della metodologia SFPE è stato descritto da Ferrington, et al. ^{3; tuttavia, l'obiettivo primario di questo studio è stato quello di valutare l'efficienza, l'efficacia, e l'economia del metodo di SFPE. Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere tutte le fasi del metodo SFPE in dettaglio, compresa la raccolta di campioni, il trattamento di laboratorio, il montaggio di diapositive, e l'identificazione genere. Il target comprende dottorandi, ricercatori e professionisti interessati ad espandere tradizionali attività di monitoraggio della qualità delle acque nei loro studi.}

Protocollo

1. Preparazione del campo di raccolta Supplies

1. Determinare il numero di campioni SFPE che dovrebbero essere raccolti sulla base del disegno di studio e acquisiscono un vaso campione (ad esempio, 60 ml) per ciascun campione.
2. Preparare due etichette di data e località per ogni barattolo campione. Posizionare uno all'interno e apporre l'altra all'esterno del vaso. Assicurarsi che ogni etichetta data e località contiene le seguenti informazioni: paese, stato, contea, città, corpo acqua, coordinate GPS, data e nome della persona (s) la raccolta del campione.
3. Raccogliere altri materiali e attrezzature (vedi Tabella di materiali specifici / Equipment) specifici.

2. Campo Collection

1. Mantenere un vassoio larvale in una mano e un setaccio nell'altra. Immergere il vassoio larvale in acqua dove SFPE accumulano (ad esempio, accumuli di schiuma, strappi, vegetazione emergente, detriti, indietro vortici, e lungo i bordi delle banche) (Figura 2A), permettono watehm, esuvie, e detriti per accedere al cassetto larvale, e versare questo materiale attraverso il setaccio. Se da un campionamento in un sistema lotico, inizia all'estremità a valle della portata campione e funziona monte (Figura 2B). Se da un campionamento in un sistema lentico, cominciare dalla costa sottovento.
   1. Ripetere il passaggio 2.1 per 10 min (o come altrimenti definito per un regime di campionamento specifico) all'interno di ogni portata campione predefinito (in genere 100-200 m di campioni raccolti dai flussi, ma dipende dalla superficie totale del sito di monitoraggio acquatico); spostarsi tra le aree di accumulo SFPE a seconda dei casi.
2. Concentrare detriti in una zona del vaglio utilizzando uno spruzzatore riempito con l'acqua del sito campione e trasferire accuratamente campione SFPE pre-etichettato vaso campione con l'ausilio di una pinza e un flusso di etanolo da una spruzzetta. Riempire vaso campione con etanolo.
3. Ripetere i passaggi 2,1-2,2 per tutti i campioni.

3. Il campione Picking

NOTA: Il resto di questo protocollo riguarda un SFPE sottocampione di 300 e può essere necessario modificare per altre dimensioni sottocampione. Vedere Bouchard e Ferrington di ⁹ linee guida subsampling e frequenza di campionamento per adattare i metodi SFPE per raggiungere gli obiettivi e le risorse di studio specifici.

1. Assegnare un flaconcino 1-dram per ogni campione SFPE; preparare una etichetta con la data e località di inserire all'interno di ogni flacone e riempire la fiala ¾ con etanolo.
2. Togliere il coperchio dal corrispondente barattolo campione e verificare la presenza di allegato esuvie pupa. Lavare delicatamente il contenuto fuori il coperchio su una piastra di Petri con uno spruzzatore pieno di etanolo. Individuare e rimuovere l'etichetta dalla parte interna del vaso campione utilizzando una pinza e delicatamente lavare contenuti fuori l'etichetta sulla piastra di Petri. Mettere da parte l'etichetta.
3. Trasferire il contenuto del barattolo campione in un vassoio larvale, risciacquo con etanolo per garantire che non SFPE rimangono nel vaso del campione. Trasferire una parte del esuvie pupa, residovuta e etanolo dal vassoio al piatto Petri. Assicurarsi che il campione è coperto in etanolo.
4. Porre la capsula di Petri in un microscopio stereo. Sistematicamente eseguire la scansione del contenuto della capsula di Petri per esuvie pupa. Scegli tutto exuvie pupa dal piatto con pinze e posto nel flaconcino. Non raccogliere i campioni che sono rotti (ad esempio, non hanno almeno la metà del cefalotorace e addome), secchi, o compresso per evitare problemi di identificazione successive.
   NOTA: Identificazione di specie spesso richiede che l'intero campione è presente, anche se in alcuni casi, l'identificazione-livello di genere può essere possibile con campioni parziali.
   1. Piatto Swirl e scansione di ulteriori esuvie pupa, comprese quelle che potrebbero essere attaccato ai lati del piatto, così come, le piccole e traslucide campioni che potrebbero non essere essere rilevato inizialmente. Ripetere l'operazione fino a quando due scansioni consecutive non rivelano ulteriori esuvie pupa.
5. Ripetere i punti 3.3 e3.4 fino a quando sono stati raccolti tutti o 300 esuvie pupa. Quando 300 esuvie pupe sono state raccolte, ritorno il residuo della piastra di Petri al vassoio larvale e risciacquare la piastra di Petri con etanolo. Quindi, trasferire il residuo dal vassoio larvale al barattolo campione vuoto, aggiungere l'etichetta data e località, e mettere il coperchio sul vaso. Conservare o smaltire residui secondo protocolli specifici di progetto.

4. Campione Ordinamento

1. Versare tutto scelto exuviae pupa dal flaconcino etichettato in una capsula di Petri riempite con abbastanza etanolo a coprire solo i campioni.
2. Sotto un microscopio stereo, campioni separati in gruppi morfologici distinti (cioè, morphotaxa) e mettono ogni morphotaxon in separatamente una fiale etichettate riempiti 3/4 ^° pieno con etanolo.
   1. Utilizzare caratteristiche morfologiche esterne per separare chironomidi morphotaxa. Ad esempio, dal cefalotorace, utilizzare differenze nella presenza, dimensione, forma, ecolorazione dei tubercoli cefaliche, verruche frontali, setole frontali e corno toracica. Dalla addome, utilizzare spine, hookrows, shagreen, setole, e contrafforti segmenti addominali, oltre ai lobi anali di separazione morphotaxa (Figura 4A). Vedi Ferrington, et al. ^5, Sæther ^26, Pinder e Reiss ²⁷ per le descrizioni aggiuntive e le figure di caratteristiche morfologiche.
   2. Utilizzare etanolo supplementare se i campioni cominciano ad asciugare.

5. Far scorrere di montaggio

1. Riempire un pozzetto di una piastra a più pozzetti per ogni morphotaxon con etanolo al 95%.
   1. Inserite molteplici rappresentazioni (ad esempio, il 25% del totale) di ogni morphotaxon da slitta montato in singoli pozzetti della piastra. Lasciare i campioni di sedersi in bene per almeno 10 minuti a disidratarsi a sufficienza.
2. Diapositive Label con sito appropriato, di raccolta e di identificazione information (Figura 3).
3. Porre il vetrino sul microscopio stereo.
   NOTA: Un modello della slitta nastro alla fase è utile per il posizionamento coerente.
4. Mettere una goccia di Euparal sul vetrino; diffondere la Euparal modo che approssima la dimensione del coprioggetto. Usare una ventilazione adeguata quando si lavora con Euparal.
   NOTA: Utilizzare una ventilazione adeguata quando si lavora con Euparal.
5. Incorpora un rappresentante della prima morphotaxon nel Euparal con pinze.
   NOTA: per invalidare l'eccesso di etanolo dal campione, utilizzando una pinza, toccare delicatamente campione sul laboratorio salviette prima di incorporarlo in Euparal.
6. Separare il cefalotorace dall'addome con pinze punta fine e / o sonde dissezione (figura 4a).
   1. Dividere il cefalotorace lungo la sutura ecdysial (Figura 4B) e aprire il cefalotorace modo che i bordi di sutura sono su lati opposti (Figura 4C).
   2. Orientare la cephalothorax modo che il lato ventrale è rivolto verso l'alto (Figura 4C).
   3. Posizionare il lato dorsale addome; posizionare immediatamente sotto il cefalotorace (Figura 4C).
7. Inserire un coprioggetto sul campione. Tenere vetrino in un angolo, con un bordo di toccare la diapositiva e quindi abbassare lentamente e rilasciare il vetrino per ridurre la formazione di bolle d'aria. Premere leggermente sul vetrino per appiattire il campione.
8. Ripetere i passaggi da 5.3 tramite 5.7 per tutti i campioni disidratati.

6. Genus Identificazione

1. Determinare genere di esemplari montati scorrevoli usando un microscopio composto. Identificare i campioni al genere con i tasti e le diagnosi in Wiederholm 28 e Ferrington, et al. ^5. Se necessario, confermare l'identificazione a livello di famiglia utilizzando Ferrington, et al. ^5. NOTA: Ci sono stati numerosi descrizioni generiche e revisioni da Wiederholm ²⁸ e Ferrington,et al. ^5, di conseguenza, questi tasti e diagnosi sono incomplete e devono essere completati con la letteratura primaria.

Risultati

La Figura 1 illustra il ciclo di vita chironomid; stadi immaturi (uovo, larva, pupa) in genere si svolgono in, o strettamente legate, un ambiente acquatico. Al termine della fase di vita larvale, la larva costruisce un riparo tubo-like e si attacca con le secrezioni seta al substrato circostante e verifica impupamento. Una volta che l'adulto in via di sviluppo è maturato, la pupa si libera e nuota alla superficie dell'acqua in cui l'adulto può emergere dalla esuvie pupa. Il esuvie riempie ...

Discussione

Le fasi più critiche per il successo la raccolta SFPE campione, la raccolta, lo smistamento, il montaggio di diapositive, e l'identificazione sono: (1) individuare le aree di elevato accumulo SFPE all'interno dell'area di studio durante la raccolta di campo (Figura 2A); (2) lentamente la scansione del contenuto della capsula di Petri per il rilevamento di tutti SFPE durante campione raccolta; (3) sviluppare la necessaria manualità per sezionare il cefalotorace dall'addome durante il mo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	70-95%
Plastic wash bottles	Fisher Scientific	0340923B
Sample jar	Fisher Scientific	0333510B	Glass or plastic, 60-mL recommended
Testing sieve	Advantech	120SS12F	125-micron mesh size
Larval tray	BioQuip	5524	White
Stereo microscope
Glass shell vials	Fisher Scientific	0333926B	1-dram size
Plastic dropper	Thermo Scientific	1371110	30 to 35 drops/mL
Fine forceps	BioQuip	4524	#5
Petri dish	Carolina	741158	Glass or plastic
Multi-well plate	Thermo Scientific	144530	Glass or plastic
Glass microslides	Thermo Scientific	3010002	3 x 1 in.
Glass cover slips	Thermo Scientific	12-519-21G	Circular or square
Euparal mounting medium	BioQuip	6372B
Pigma pen	BioQuip	1154F	Black
Probe	BioQuip	4751
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional™	34120