Chironomidae (파리목)의 사용 표면 부동 물 기관에 대한 신속한 생물학적 평가 프로토콜로 번데기 Exuviae을

요약

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

초록

저서 대형 무척추 동물 군집을 사용하여 신속한 생물학적 평가 프로토콜이 성공적 수질에 인간의 영향을 평가하기 위해 사용되어왔다. 불행하게도, 그러한 딥 그물 같은 전통적인 저서 유생 샘플링 방법은, 시간 소모적이고 고가 일 수있다. 다른 프로토콜은 Chironomidae 표면 부동 번데기의 exuviae (SFPE)의 컬렉션을 포함한다. Chironomidae은 미성숙 단​​계 일반적으로 수생 서식지에서 발생 파리 (파리목)의 종 풍부한 제품군입니다. 성인 chironomids는, 물에서 나오는 물 표면에 떠있는, 자신의 번데기 스킨, 또는 exuviae를 떠나. Exuviae 종종 제방을 따라하거나이 chironomid 다양성과 풍요 로움을 평가하기 위해 수집 할 수있는 바람이나 물 전류의 작용에 의해 장애물 뒤에 축적된다. 어떤 종은 다른 사람보다 오염에 더 관대하기 때문에 Chironomids는 중요한 생물학적 지표로 사용할 수 있습니다. 따라서, 수집 된 SFPE의 상대 풍부 종 구성 반영수질의 변화. 여기서, 필드의 수집, 처리 실험, 슬라이드 마운팅 및 chironomid SFPE의 식별과 관련된 방법이 상세히 설명된다. SFPE 방법의 장점은 샘플링 영역에서 최소한의 방해, 효율적이고 경제적 인 시료 채취 및 실험실 처리, 식별의 용이성, 적용 거의 모든 수중 환경 및 생태계 스트레스를 잠재적으로 더 민감한 측정을 포함한다. 제한들이 성인 남성과 연관되지 않은 경우에 종 exuviae 번데기를 식별 유생 microhabitat 사용과 무능력을 판별 할 수없는 점 등이있다.

서문

환경 상태를 평가하는 생물체를 사용하여 생물학적 모니터링 프로그램은 종종 수질을 평가 또는 생태계를 복원 프로그램의 성공을 모니터링하는 데 사용된다. 저서 성 대형 무척추 동물 군집을 사용하여 빠른 생물학적 평가 프로토콜 (RBP)은 1989 ^{1 일부터} 국가 수자원 기관 사이에 인기가있다. 예를 들면 딥-NET, Surber 샘플러, 헤스 샘플러 ^2와 RBPs에 대한 저서 성 대형 무척추 동물을 샘플링의 전통적인 방법, 시간 - 일 수있다 고가의 소비, 단지 특정 microhabitat ^3에서 군집을 측정 할 수있다. 특정 수역에 대한 생물학적 정보를 생성하는 효율적인 대안 RBP는 Chironomidae 표면 부동 번데기 exuviae (SFPE) ^3의 컬렉션을 포함한다.

Chironomidae : 일반적으로 비 무는 작은 벌레로 알려진 (곤충강 파리목)는, 일반적으로 성인으로 부상하기 전에 수생 환경에서 발생 holometabolous 파리 있습니다 60, 물 표면에. chironomid 제품군은 전 세계적으로 기술 된 약 5,000 종, 종 풍부하다; 그러나, 많은 20,000 종 ⁴ 존재하는 것으로 추정된다. Chironomids 때문에 높은 다양성과 변수 오염 허용 레벨 ^5의 많은 수중 생태계에 물과 서식지의 질을 문서화에 유용하다. 또한, 그들은 일반적으로 사회 ^{5, 6에서} 50 % 종 이상을 차지 자주 수생 시스템에서 가장 풍부하고 광범위한 저서 성 대형 무척추 동물이다. 지상파 성인의 출현에 따라, 번데기 exuviae (번데기 피부 캐스트) 물 표면에 떠 남아있다 (그림 1). 번데기 exuviae 바람 또는 물 전류의 작용을 통해 함께 은행이나 장애물 뒤에 축적 쉽고 빠르게 이전 24-48 시간 동안 ⁷ 등장 chironomid 종의 광범위한 샘플을 제공하기 위해 수집 될 수있다.

다른 사람이 ⁵ 매우 민감한 반면 ntent "> 상대 풍부하고 수집 된 SFPE의 분류 학적 조성물은 어떤 종은 허용 매우 오염되어 있음을 고려하여, 수질을 반영 SFPE 방법을 포함하여 기존의 애벌레 chironomid 샘플링 기술에 비해 많은 장점이 있습니다. (1) 최소 (2) 시료는 생물 수집에 초점을 맞출 것이 아니라 살아 있지 않은 피부, 그래서 지역 사회 역학의 궤도는 영향을받지 않는다; 속으로 (3) 식별 및있는 경우, 서식지 교란 샘플링 영역에서 발생 종종 종은, 상대적으로 쉽게 해당 키 및 설명 ⁽³⁾ 주어진 (4) 수집, 처리 및 샘플을 식별하는 기존의 샘플링 방법 ^3,8,9에 비해 효율적이고 경제적이다 (5) 축적 exuviae 유래 한 분류군을 나타냅니다 microhabitats ^(10)의 넓은 범위는 (6)에있어서 스트림 및 하천 하구, 락 비롯한 거의 모든 수중 환경에 적용 할 수있다ES, 연못, 바위 웅덩이, 습지, 그들은 모두 미성숙 단계를 완료하고 성공적으로 성인 ^(11)으로 부상 한 개인을 대표하기 때문에과 (7) SFPE 어쩌면 생태계 건강의 더 민감한 지표.

SFPE 방법은 chironomid 지역 사회에 대한 정보를 수집하기위한 새로운 접근 방식이 아니다. SFPE의 사용은 먼저 1900 년대 초 Thienemann ^(12)에 의해 제안되었다. 연구의 다양한 (예 : ^7,16-19) 분류 학적 조사 (예를 들어, ^{13 ~ 15),} 생물 다양성 및 생태 학적 연구에 SFPE를 사용하고, 한 생물학적 평가 (예를 들어, ^{20 ~ 22).} 또한, 일부 연구들은 표본 설계, 샘플 크기 및 종 또는 장군 (예, ^8,9,23)의 다양한 검출 레벨을 달성하기 위해 필요한 샘플 이벤트 수의 다양한 측면을 다루었 다. 이러한 연구들은 종 또는 속의 비교적 높은 비율이 적당한 effor 검출 할 수 있음을 나타내t 또는 비용은 시료 처리와 연관된. 예를 들어, 앤더슨과 Ferrington ^8은 100 카운트 표본을 기준으로 1/3 ^번째 적은 시간이 샘플 그물을 찍어 비교 SFPE 샘플을 선택하는 데 필요한 것을 결정했다. 또 다른 연구는 3-4 SFPE 샘플 분류 모든 DIP-NET 샘플 및 종 풍부가 ^{3 증가로} SFPE 샘플 검출 종에서 딥-NET 샘플보다 더 효율적이라고 식별 할 수 있다고 결정했다. SFPE 샘플은 97.8 % ⁽³⁾ 효율적인 동안 예를 들어, 종 사이트에서 15 ~ 16 종의 값을 풍요 로움 평균 딥-NET 효율은 45.7 %이었다.

중요한 SFPE 방법은 유럽 연합 (EU) ^(24)에 규격화 된 생태 평가 북아메리카 ²⁵ (chironomid의 번데기의 exuviae 기법 (CPET)라고도 함), 그러나 본 방법은 상세하게 설명되지 않았다. SFPE 방법 중 하나는 응용 프로그램 등 Ferrington에 의해 설명되었다. 3을; 그러나, 연구의 주요 초점은 SFPE 방법의 효율성, 효과 및 경제를 평가하는 것이다. 이 연구의 목적은 샘플 수집, 처리 실험, 슬라이드 마운팅 및 속 식별 포함한 상세 SFPE 방법의 모든 단계를 설명하기위한 것이다. 대상은 자신의 연구로 기존의 수질 감시 활동을 확대에 관심있는 대학원생, 연구자 및 전문가를 포함한다.

프로토콜

필드 컬렉션 용품 1. 준비

1. 연구 설계에 기초하여 수집하고, 각 샘플에 대한 하나의 샘플 병 (예를 들어, 60 ml)에 취득한다 SFPE 샘플들의 수를 결정한다.
2. 각 샘플 항아리 두 개의 날짜와 지역 레이블을 준비합니다. 내부에 하나 배치하고 병의 외부로의 다른 부착. 샘플을 수집, 국가, 주, 카운티, 도시, 물, 몸, GPS 좌표, 날짜, 사람 (들)의 이름 : 각 날짜와 지역 레이블이 다음과 같은 정보가 포함되어 있는지 확인합니다.
3. 다른 특정 재료 및 장비 (특정 재료 / 장비의 표 참조)를 수집합니다.

2. 필드 컬렉션

1. 한 손으로 애벌레 트레이 및 다른 체를 잡으십시오. SFPE 축적 물에 애벌레 트레이를 찍어 (예를 들면, 거품 축적, 그루터기, 긴급 식물, 다시 파편, 소용돌이, 은행 가장자리를 따라) (그림 2A)는 와트를 허용어, exuviae, 이물질은 애벌레 트레이를 입력하고 체를 통해이 물질을 부어합니다. lotic 시스템의 샘플링, 샘플 범위의 하류 끝에서 시작하고 (그림 2B)를 상류 작업하는 경우. lentic 시스템의 샘플링하면, 바람 부는쪽으로 해안선에 시작합니다.
   1. 반복 각 미리 정의 된 샘플 범위 내에서 10 분 동안 2.1 단계 (또는 달리 특정 샘플링 정권에 대해 정의) (스트림에서 수집 한 샘플에 대한 일반적으로 100~200m,하지만 수중 모니터링 사이트의 전체 지역에 따라 다름); 적절한 SFPE 축적 영역 사이 이동합니다.
2. 샘플 사이트에서 물이 가득 물총 병을 사용하여 체의 한 영역에서 이물질을 집중 조심스럽게 집게의 도움과 물총 병에서 에탄올의 흐름과 함께 SFPE 샘플에 사전 표지 샘플 항아리를 전송합니다. 에탄올 샘플 항아리를 채우십시오.
3. 반복 2.1 모든 시료 2.2 단계를.

3. 샘플 따기

참고 :이 프로토콜의 나머지 300 SFPE의 표본에 관한 다른 표본 크기에 맞게 수정해야 할 수도 있습니다. 연구 별 목표와 자원을 충족 SFPE 방법을 조정하는 보우 차드와 Ferrington의 ⁹ 서브 샘플링과 샘플링 주파수 지침을 참조하십시오.

1. 각 SFPE 샘플에 대한 1-DRAM 용 유리 병을 할당; 각각의 유리 병 내부에 배치하고 에탄올로 가득 찬 유리 병을 ¾ 채우기 위해 날짜와 장소 레이블을 준비합니다.
2. 해당 샘플 항아리 뚜껑을 제거하고 부착 번데기 exuviae 확인합니다. 조심스럽게 에탄올로 가득 물총 병을 사용하여 페트리 접시에 뚜껑 내용을 씻어. 찾아 페트리 접시에 라벨 오프 내용을 씻어 부드럽게 집게를 사용하여 샘​​플 항아리의 내부에서 라벨을 제거하고. 따로 라벨을 설정합니다.
3. 더 SFPE 샘플 항아리에 남아 있도록 에탄올로 세척, 애벌레 트레이에 샘플 항아리의 내용을 전송합니다. 번데기 exuviae, RESI의 일부를 이동페트리 접시에 트레이에서 때문에, 에탄올. 샘플이 에탄올에 포함되어 있는지 확인합니다.
4. 스테레오 현미경 페트리 접시를 놓습니다. 체계적으로 번데기 exuviae의 페트리 접시의 내용을 검사합니다. 유리 병에 핀셋과 장소를 사용하여 요리의 모든 번데기 exuviae을 선택합니다. 부러 표본을 선택하지 마십시오, 건조, 이상 식별 문제를 방지하기 위해 압축 된 (즉, 두흉부와 복부의 절반 이상이 없습니다).
   주 : 종 식별은 종종 어떤 경우에는, 속 레벨 식별 부분 표본으로 가능하다하더라도, 전체 시료가 존재하는 것을 필요로한다.
   1. 소용돌이 요리와 초기에 감지되지 않았을 수 있습니다 접시의 측면에 붙어있을 수있는 어떤 포함한 추가 번데기 exuviae뿐만 아니라, 어떤 작은 반투명 표본 검사. 두 개의 연속 스캔이 추가 번데기 exuviae을 공개하지 않을 때까지 반복합니다.
5. 단계를 반복 3.33.4 전부 또는 300 번데기 exuviae가 포착 될 때까지. 300 번데기 exuviae이 포착되었을 때, 애벌레 트레이에 페트리 접시에서 잔류 물을 반환하고 에탄올로 페트리 접시를 씻어. 그런 다음, 빈 샘플 병에 애벌레 트레이에서 잔류 물을 전송 날짜와 지역 레이블을 추가하고, 항아리에 뚜껑을 넣어. 보관 또는 프로젝트 별 프로토콜에 따라 잔류 폐기하십시오.

정렬 4. 샘플

1. 모든 단지 표본을 커버하기에 충분한 에탄올로 가득 페트리 접시에 표시된 유리 병에서 번데기 exuviae 고른 따르십시오.
2. 스테레오 현미경, 분리 된 별개의 형태 학적 그룹 (즉, morphotaxa)으로 표본과는 별도로 표시 튜브가 에탄올로 ^일 3/4 완전 충전에 각 morphotaxon 놓습니다.
   1. chironomid의 morphotaxa 별도의 외부 형태 학적 특성을 활용합니다. 예를 들어, 두흉부에서, 존재, 크기, 형상의 차이를 이용하고,두부 결핵, 정면 사마귀, 정면의 세타, 흉부 뿔의 착색. 복부에서 morphotaxa 분리 (그림 4A)의 항문 로브뿐만 아니라, 복부 세그먼트의 등뼈, hookrows, 샤 그린, 세타, 그리고 박차를 사용합니다. Ferrington를 참조, 등. ^5, Sæther ²⁶ PINDER 추가 설명 및 형태 학적 특성의 수치에 대한 라이스 ^(27).
   2. 표본은 건조하기 시작하면 추가로 에탄올을 사용합니다.

설치 5. 슬라이드

1. 95 % 에탄올로 각각 morphotaxon 위해 멀티 웰 플레이트의 한 웰을 채운다.
   1. 여러 표현을 배치 (예를 들어, 전체의 25 %) 각 morphotaxon의 슬라이드 플레이트의 각 웰에 장착합니다. 표본이 충분히 탈수 적어도 10 분 동안 잘 앉을 수 있습니다.
2. 해당 사이트, 수집 및 식별 많은 informati 레이블 슬라이드(그림 3)에.
3. 스테레오 현미경에 놓고 슬라이드.
   참고 : 단계로 녹화 슬라이드 템플릿 일관된 배치하는 데 유용합니다.
4. 슬라이드에 Euparal 한 방울을 배치; 그것을 커버 슬립의 크기에 근사하도록 Euparal 확산. Euparal 작업시 적절한 환기를 사용합니다.
   참고 : Euparal 작업시 적절한 환기를 사용합니다.
5. 집게를 사용 Euparal에 첫 번째 morphotaxon의 대표를 포함시킵니다.
   참고 : 실험실 Euparal에서 그것을 포함하기 전에 잎사귀에 부드럽게 표본을 살짝 집게를 사용하여, 표본에서 초과 에탄올을 무효로합니다.
6. 뾰족한 집게 및 / 또는 해부 프로브 (그림 4A)를 사용하여 복부에서 두흉부를 분리합니다.
   1. ecdysial 봉합 (그림 4B)을 따라 두흉부를 분할하고 봉합 가장자리가 반대편 (그림 4C)에 있도록 두흉부를 엽니 다.
   2. C의 방향ephalothorax이되도록 복부 측면 (그림 4C)를 직면하고있다.
   3. 복부 지느러미 측면을 배치; 즉시 두흉부 (그림 4C) 아래에 배치합니다.
7. 시편에 커버 슬립을 놓습니다. 하나의 에지가 천천히 아래 슬라이드를 감동과 함께, 각도로 커버 슬립을 잡고 공기 방울 형성​​을 줄이기 위해 커버 슬립을 놓습니다. 가볍게 커버 슬립에 눌러 시편을 평평하게합니다.
8. 반복 모든 탈수 표본 5.7을 통해 5.3 단계를 반복합니다.

6. 속 식별

1. 복합 현미경을 사용하여 슬라이드에 장착 된 표본의 속을 결정합니다. 등 Wiederholm 28 Ferrington에 키와 진단을 사용하여 속에 표본을 확인합니다. ^5. 필요한 경우 등, Ferrington를 사용 가족 - 레벨 ID를 확인한다. ^(5). 참고 : Wiederholm ²⁸ Ferrington 이후 다수의 일반적인 설명 및 개정이 계속있다,등. ^(5)는, 따라서, 이러한 키 및 진단은 불완전 일차 문헌으로 보충 될 필요가있다.

결과

도 1은 chironomid 기간을 나타낸다 미성숙 단​​계 (계란, 애벌레, 번데기는) 일반적으로 발생하는, 또는 밀접하게 수생 환경과 관련된. 애벌레 삶의 단계가 완료되면, 유충은 튜브 같은 피난처를 구성하고 주변의 기판에 비단 분비물과 붙어서 번데기가 발생합니다. 현상 성인 성숙되면 번데기 자체를 해제하고 성인 번데기 exuviae으로부터 나올 수 물의 표면에 아무것도. exuviae 공기로 ?...

토론

성공적인 SFPE 샘플 수집, 슬라이드 장착, 따기 분류 및 식별을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 (1) 필드 컬렉션 (그림 2A) 동안 연구 지역 내에서 높은 SFPE 축적의 영역을 위치; (2)을 천천히 시료 채취시 모든 SFPE의 검출을위한 배양 접시의 내용을 주사; (3) (그림 4A)를 장착 슬라이드 동안 복부에서 두흉부를 해부하는 데 필요한 손재주를 개발; (4) 제대로 속에 식별 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	70-95%
Plastic wash bottles	Fisher Scientific	0340923B
Sample jar	Fisher Scientific	0333510B	Glass or plastic, 60-mL recommended
Testing sieve	Advantech	120SS12F	125-micron mesh size
Larval tray	BioQuip	5524	White
Stereo microscope
Glass shell vials	Fisher Scientific	0333926B	1-dram size
Plastic dropper	Thermo Scientific	1371110	30 to 35 drops/mL
Fine forceps	BioQuip	4524	#5
Petri dish	Carolina	741158	Glass or plastic
Multi-well plate	Thermo Scientific	144530	Glass or plastic
Glass microslides	Thermo Scientific	3010002	3 x 1 in.
Glass cover slips	Thermo Scientific	12-519-21G	Circular or square
Euparal mounting medium	BioQuip	6372B
Pigma pen	BioQuip	1154F	Black
Probe	BioQuip	4751
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional™	34120