Uso de Chironomidae (Diptera) Pupal Exuviae como um Bioavaliação Protocolo Rápido para massas de água de superfície flutuante

Resumo

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

Resumo

Protocolos Bioavaliação rápidas usando assembléias de macroinvertebrados bentônicos foram utilizados com êxito para avaliar os impactos humanos sobre a qualidade da água. Infelizmente, os métodos de amostragem tradicionais bentônicos larvais, tais como o mergulho-net, pode ser demorado e caro. Um protocolo alternativo envolve a coleta de Chironomidae pupa exuviae flutuante superfície (SFPE). Chironomidae é uma família rica em espécies de moscas (Diptera) cujos estágios imaturos normalmente ocorrem em habitats aquáticos. Quironomídeos adultos emergem da água, deixando a pele pupa, ou exuviae, flutuando na superfície da água. Exuviae muitas vezes se acumulam ao longo das margens ou atrás de obstruções por acção da corrente de vento ou água, onde podem ser recolhidos para avaliar a diversidade e riqueza chironomid. Chironomidae podem ser utilizados como indicadores biológicos importantes, uma vez que algumas espécies são mais tolerantes à poluição do que outros. Portanto, a abundância e composição de espécies coletadas SFPE relativa de refletiralterações na qualidade da água. Aqui, métodos associados com a coleta de campo, processamento laboratorial, montagem slide, e identificação de chironomid SFPE são descritos em detalhes. Vantagens do método SFPE incluem o mínimo de perturbação em uma área de amostragem, coleta de amostra eficiente e econômica e processamento laboratorial, a facilidade de identificação, aplicabilidade em quase todos os ambientes aquáticos, e uma medida potencialmente mais sensível do estresse do ecossistema. As limitações incluem a incapacidade para determinar a utilização do ambiente larval e incapacidade de identificar exuviae pupa para espécies que não tenham sido associadas com machos adultos.

Introdução

Programas de monitorização biológica, que utilizam organismos vivos para avaliar a saúde do meio ambiente, são muitas vezes utilizados para avaliar a qualidade da água ou monitorar o sucesso de programas de restauração do ecossistema. Protocolos Bioavaliação rápidas (RBP) usando assembléias de macroinvertebrados bentônicos têm sido muito populares entre as agências de recursos hídricos do estado desde 1989 ^1. Os métodos tradicionais de amostragem macroinvertebrados bentônicos para RBPs, tais como o mergulho-net, Surber sampler, e Hess amostrador ^2, pode ser tempo- demorado, caro e só pode medir assemblages de um determinado microhabitat ^3. Um eficiente, RBP alternativa para gerar informações biológicas sobre um corpo de água particular envolve coleção de Chironomidae exúvias de pupa flutuante superfície (SFPE) ^3.

O Chironomidae (Insecta: Diptera), vulgarmente conhecida como mosquitos não picam, são moscas holometabolous que normalmente ocorrem em ambientes aquáticos antes de emergir como adultos 60; na superfície da água. A família chironomid é rica em espécies, com cerca de 5.000 espécies descritas em todo o mundo; no entanto, cerca de 20.000 espécies são estimadas a existir ^4. Quironomídeos são úteis para documentar água e qualidade do habitat em muitos ecossistemas aquáticos devido à sua elevada diversidade e os níveis de tolerância poluição variáveis ^​​5. Além disso, são muitas vezes os macroinvertebrados bentônicos mais abundantes e disseminadas em sistemas aquáticos, tipicamente responsável por 50% ou mais das espécies na comunidade ^5,6. Seguindo emergência do adulto terrestre, o exúvias de pupa (cast pele pupa) continua flutuando na superfície da água (Figura 1). Exúvias de pupa se acumulam ao longo das margens ou atrás de obstruções através da ação do vento ou água corrente e pode ser facilmente e rapidamente recolhido para dar uma amostra global de espécies de Chironomidae que surgiram durante o anterior 24-48 h ^7.

ntent "> A abundância relativa e composição taxonômica da recolhido SFPE reflete a qualidade da água, considerando-se que algumas espécies são muito tolerantes a poluição, enquanto outros são bastante sensíveis ⁵ O método SFPE tem muitas vantagens sobre técnicas de amostragem chironomid larval tradicionais, incluindo:. (1) mínima , se houver, perturbação do habitat ocorre em uma área de amostragem; (2) as amostras não se concentrar na coleta de organismos vivos, mas a pele não-vivos, então a trajetória da dinâmica da comunidade não seja afectada; (3) a identificação de gênero, e muitas vezes espécie, é relativamente fácil dado as chaves e descrições ³ adequados; (4) a coleta, processamento e identificação de amostras é eficiente e econômica em comparação com os métodos de amostragem tradicionais ^3,8,9; (5) exuviae acumulados representam táxons que tenham originado uma vasta gama de micro-habitats ^10; (6) o método é aplicável em quase todos os ambientes aquáticos, incluindo córregos e rios, estuários, lakes, lagoas, piscinas naturais e zonas húmidas; e (7) SFPE talvez ser um indicador mais sensível de saúde do ecossistema, uma vez que representam indivíduos que completaram todas as fases imaturas e emergiram com sucesso como adultos ^11.

O método SFPE não é uma nova abordagem para a coleta de informações sobre as comunidades de quironomídeos. Uso de SFPE foi sugerida pela primeira vez por Thienemann ¹² no início de 1900. Uma variedade de estudos têm utilizado SFPE para levantamentos taxonômicos (por exemplo, ^13-15), a biodiversidade e estudos ecológicos (por exemplo, ^7,16-19), e avaliações biológicas (por exemplo, ^20-22). Além disso, alguns estudos têm abordado diferentes aspectos do desenho da amostra, tamanho da amostra e número de eventos de amostra necessários para atingir vários níveis de detecção de espécies ou gêneros (por exemplo, ^8,9,23). Estes estudos indicam que relativamente elevadas percentagens de espécies ou gêneros pode ser detectada com effor moderadat ou despesas associadas com o processamento da amostra. Por exemplo, Anderson e Ferrington ⁸ determinaram que baseado em uma subamostra de 100 contagem, ^1/3 menos tempo foi necessário para pegar amostras SFPE em comparação a mergulhar-net amostras. Outro estudo determinou que 04/03 amostras SFPE poderiam ser classificados e identificados para cada amostra dip-net e que as amostras SFPE foram mais eficientes do que as amostras dip-net em espécies de detecção como riqueza de espécies aumentou ^3. Por exemplo, em locais com valores de riqueza de espécies de 15-16 espécies, a eficiência dip-líquido médio foi de 45,7%, enquanto as amostras SFPE eram 97,8% eficiente ^3.

Mais importante, o método SFPE foi padronizado na União Europeia ²⁴ (conhecida como técnica de pupa exuviae Chironomidae (TCP)) e América do Norte ²⁵ para avaliação ecológica, mas o método não foi descrito em pormenor. Uma aplicação da metodologia SFPE foi descrito por Ferrington, et ai. ^{3; no entanto, o foco principal desse estudo foi avaliar a eficiência, eficácia e economia do processo de SFPE. O objetivo deste trabalho é descrever todos os passos do método SFPE em detalhe, incluindo a coleta de amostras, processamento laboratorial, montagem slide, e identificação gênero. O público-alvo inclui estudantes de pós-graduação, pesquisadores e profissionais interessados ​​em ampliar esforços tradicionais de monitoramento da qualidade da água em seus estudos.}

Protocolo

1. Preparação da coleção de campos Suprimentos

1. Determinar o número de amostras SFPE que devem ser coletados com base no desenho do estudo e adquirir um frasco da amostra (por exemplo, 60 ml) para cada amostra.
2. Prepare duas etiquetas de data e localidade para cada frasco de amostra. Coloque um no interior do outro e apor para o exterior do frasco. Certifique-se que cada etiqueta data e localidade inclui as seguintes informações: país, estado, município, cidade, corpo água, coordenadas GPS, a data eo nome da pessoa (s) de coletar a amostra.
3. Reúna outros materiais e equipamentos (ver Tabela de Específico materiais / equipamentos) específicos.

2. Campo Colecção

1. Segure uma bandeja larval em uma mão e uma peneira na outra. Mergulhe a bandeja larval na água onde SFPE acumulam (por exemplo, acumulação de espuma, senões, vegetação emergente, restos, de volta turbilhões, e ao longo das bordas bancários) (Figura 2A), permitem water, exuviae, e detritos para entrar no tabuleiro larval, e despeje este material através da peneira. Se a amostragem em um sistema lótica, inicia-se na extremidade a jusante do alcance da amostra e trabalhar a montante (Figura 2B). Se a amostragem em um sistema lêntico, começam na linha costeira na direção do vento.
   1. Repita o passo 2,1 para 10 min (ou conforme definido para um regime de amostragem específico) dentro de cada alcance amostra pré-definido (normalmente 100-200 m de amostras coletadas a partir de fluxos, mas depende da área total do local de monitorização da água); mover-se entre SFPE áreas de acumulação, conforme apropriado.
2. Concentra-se os detritos em uma área do crivo usando uma garrafa de esguicho enchido com água a partir do site da amostra e transferir cuidadosamente amostra SFPE frasco de amostra de pré-marcado com o auxílio de uma pinça e um fluxo de etanol a partir de uma garrafa de esguicho. Preencha frasco da amostra com etanol.
3. Repita os passos 2.1 e 2.2 para todas as amostras.

3. Amostra Picking

NOTA: O restante deste protocolo se refere a uma subamostra SFPE 300 e pode precisar ser modificado para outros tamanhos subamostra. Ver de Bouchard e Ferrington ⁹ diretrizes subamostragem e frequência de amostragem para adaptar métodos SFPE para cumprir as metas e os recursos específicos do estudo.

1. Alocar um frasco de 1 dram para cada amostra SFPE; preparar um rótulo de data e localidade de colocar dentro de cada frasco e preencher o frasco ¾ cheio com etanol.
2. Retire a tampa do frasco da amostra correspondente e verificar se há exúvias de pupa em anexo. Suavemente lavar conteúdos fora da tampa sobre uma placa de Petri utilizando uma garrafa de esguicho cheio com etanol. Localizar e remover o rótulo a partir do interior do frasco de amostra, utilizando uma pinça e lavar suavemente o conteúdo para fora da etiqueta para a placa de Petri. Definir rótulo de lado.
3. Transferir o conteúdo do frasco de amostra dentro de um tabuleiro de larvas, lavagem com etanol para se garantir que não haja SFPE permanecem no frasco de amostra. Transferir uma parte do exúvias de pupa, residevido, e etanol a partir da bandeja para a placa de Petri. Certifique-se de que a amostra é coberto em etanol.
4. Coloque a placa de Petri sob um microscópio estéreo. Sistematicamente digitalizar o conteúdo da placa de Petri para exúvias de pupa. Pegue tudo exuviae pupa do prato usando uma pinça e coloque dentro do frasco. Não escolher os espécimes que são quebradas (ou seja, não têm, pelo menos, metade do cefalotórax e abdômen), seca, ou comprimido para evitar problemas de identificação posteriores.
   NOTA: Identificação de espécies, muitas vezes requer que a totalidade da amostra está presente, embora em alguns casos, a identificação de nível género pode ser possível com espécimes parciais.
   1. Prato redemoinho e digitalizar para exuviae adicional de pupa, incluindo qualquer que poderia ser preso para os lados do prato, bem como, quaisquer pequenas e translúcidas espécimes que pode não ter ser detectada inicialmente. Repita até que dois exames consecutivos não revelam exúvias de pupa adicional.
5. Repita os passos 3.3 e3.4 ou até que todos os 300 exúvias de pupa foram colhidos. Quando 300 exúvias de pupa foram colhidos, devolver o resíduo da placa de Petri para a bandeja larval e lavar a placa de Petri com etanol. Em seguida, transferir o resíduo da bandeja larval para o frasco de amostra vazio, adicione o rótulo data e localidade, e colocar a tampa do frasco. Conservar ou alienar resíduo de acordo com protocolos específicos do projeto.

4. Amostra Classificando

1. Despeje tudo pegou exúvias de pupa do frasco etiquetado em uma placa de Petri cheia com etanol suficiente para cobrir apenas espécimes.
2. Sob um microscópio estéreo, as amostras separadas em grupos morfológicos distintos (ou seja, morphotaxa) e coloque cada um separadamente morphotaxon em frascos rotulados preenchido 3/4 ^th cheio com etanol.
   1. Utilize características morfológicas externas para separar chironomid morphotaxa. Por exemplo, a partir do cefalotòrax, usar diferenças na presença, tamanho, forma, ecoloração dos tubérculos cefálica, verrugas frontais, sedas frontal e chifre torácica. A partir do abdómen, usar espinhas, hookrows, chagrém, cerdas, e as esporas de segmentos abdominais, para além dos lóbulos anal para a separação morphotaxa (Figura 4A). Veja Ferrington, et al. ^5, Sæther ^26, Pinder e Reiss ²⁷ para obter descrições e figuras de características morfológicas adicionais.
   2. Use etanol adicional se as amostras começam a secar.

5. Deslize Montagem

1. Encher um poço de uma placa multi-poços para cada morphotaxon com etanol a 95%.
   1. Coloque representações múltiplas (por exemplo, 25% do total) de cada corrediça morphotaxon para ser montado em poços individuais da placa. Permitir espécimes para sentar-se bem por pelo menos 10 min para desidratar suficientemente.
2. Etiqueta desliza com local adequado, coleta e identificação informatina (Figura 3).
3. Colocar a lâmina no microscópio estéreo.
   NOTA: Um modelo do slide colado na etapa é útil para a colocação consistente.
4. Colocar uma gota de Euparal na corrediça; espalhar a Euparal de modo que ele se aproxima do tamanho da lamela. Use ventilação adequada quando se trabalha com Euparal.
   NOTA: Use ventilação adequada quando se trabalha com Euparal.
5. Incorporar um representante do primeiro morphotaxon no Euparal usando uma pinça.
   NOTA: Para anular o excesso de etanol a partir da amostra, usando uma pinça, bata suavemente espécime no laboratório limpa antes de incorporá-lo em Euparal.
6. Separe o cefalotórax do abdômen usando uma pinça de ponta fina e / ou sondas de dissecção (Figura 4A).
   1. Dividir o cefalotòrax ao longo da sutura ecdysial (Figura 4B) e abrir a cefalotòrax de modo que as bordas são de sutura em lados opostos (Figura 4C).
   2. Orientar o cephalothorax de modo que o lado ventral está virada para cima (Figura 4C).
   3. Posicione o lado dorsal do abdômen para cima; colocar imediatamente abaixo da cefalotòrax (Figura 4C).
7. Coloque uma lamela sobre o espécime. Segure lamela em um ângulo, com uma borda de tocar a lâmina, e então lentamente mais baixo e soltar a lamela para reduzir a formação de bolhas de ar. Pressione levemente a lamela para achatar o espécime.
8. Repita os passos 5.3 a 5.7 para todos os espécimes desidratados.

6. Identificação Género

1. Determinar género de espécimes montados em slides usando um microscópio composto. Identificar as amostras utilizando as teclas ao gênero e diagnósticos em Wiederholm 28 e Ferrington, et al. ^5. Se necessário, confirmar a identificação em nível de família usando Ferrington, et al. ^5. NOTA: Houve inúmeras descrições genéricas e revisões desde Wiederholm ²⁸ e Ferrington,et al. ^5, portanto, essas chaves e diagnósticos são incompletos e precisam ser complementadas com a literatura primária.

Resultados

A Figura 1 ilustra o ciclo de vida Chironomidae; estágios imaturos (ovo, larva, pupa) ocorrem tipicamente dentro, ou estreitamente associados, um ambiente aquático. Após a conclusão da fase de vida larvar, as larvas constrói um abrigo de tubo, e atribui-se com secreções de seda para o substrato circundante e pupation ocorre. Uma vez que o adulto desenvolvimento amadureceu, a pupa liberta-se e nada para a superfície da água onde o adulto pode emergir da exúvias de pupa. O exuviae se enche de ar...

Discussão

Os passos mais críticos para a coleção bem-sucedida SFPE amostra, colheita, triagem, montagem slide, e identificação são: (1) a localização de zonas de acumulação SFPE alta na área de estudo durante a coleta de campo (Figura 2A); (2) lentamente digitalizar o conteúdo da placa de Petri para detecção de todas SFPE durante a colheita da amostra; (3) desenvolver a destreza manual necessária para dissecar o cefalotórax do abdômen durante a montagem (Figura 4A) de slides; e (...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	70-95%
Plastic wash bottles	Fisher Scientific	0340923B
Sample jar	Fisher Scientific	0333510B	Glass or plastic, 60-mL recommended
Testing sieve	Advantech	120SS12F	125-micron mesh size
Larval tray	BioQuip	5524	White
Stereo microscope
Glass shell vials	Fisher Scientific	0333926B	1-dram size
Plastic dropper	Thermo Scientific	1371110	30 to 35 drops/mL
Fine forceps	BioQuip	4524	#5
Petri dish	Carolina	741158	Glass or plastic
Multi-well plate	Thermo Scientific	144530	Glass or plastic
Glass microslides	Thermo Scientific	3010002	3 x 1 in.
Glass cover slips	Thermo Scientific	12-519-21G	Circular or square
Euparal mounting medium	BioQuip	6372B
Pigma pen	BioQuip	1154F	Black
Probe	BioQuip	4751
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional™	34120