Использование хирономид (Diptera), поверхностно-Плавающие куколки экзувии как Bioassessment протокола Rapid для водоемов

Резюме

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

Аннотация

Быстрые протоколы, использующие донные bioassessment макробеспозвоночных комплексы были успешно использованы для оценки воздействия человека на качество воды. К сожалению, традиционные донные личинки методы отбора проб, такие как погружной сети, может быть трудоемким и дорогостоящим. Альтернативный протокол включает в себя коллекцию Chironomidae поверхности плавающего куколки экзувия (SFPE). Chironomidae является видовой богатая семья мух (Diptera), чьи незрелые стадии, как правило, происходят в водной среде обитания. Взрослые хирономид выйти из воды, оставляя их куколки кожи или экзувии, плавающие на поверхности воды. Экзувии часто накапливаются вдоль банков или за препятствий со стороны действия ветра или воды тока, где они могут быть собраны для оценки хирономид разнообразие и богатство. Хирономиды может быть использован в качестве важных биологических показателей, так как некоторые виды более терпимы к загрязнению, чем другие. Таким образом, относительное обилие и видовой состав собранной SFPE отражаютизменения качества воды. Здесь методы, связанные со сбором поля, лабораторной обработки, слайд монтажа и идентификации звонцов SFPE подробно описаны. Преимущества метода SFPE включают минимальное волнение в области отбора проб, эффективное и экономичное сбор образцов и лабораторной обработки, легкость идентификации, применимость в почти всех водных средах, и потенциально более чувствительное измерение напряжения экосистем. Ограничения включают неспособность определить личинок использование микросреду и неспособность определить куколки экзувии для видов, если они не были связаны с взрослыми мужчинами.

Введение

Программы биологического мониторинга, которые используют живые организмы, чтобы оценить состояние окружающей среды, часто используются для оценки качества воды или контролировать успех программы восстановления экосистем. Быстрые протоколы bioassessment (РСП), использующие донные макробеспозвоночных комплексы были популярны среди государственных органов водных ресурсов с 1989 года ^1. Традиционные методы отбора проб донных макробеспозвоночные для ОДП, такие как рыболовный сачок, Surber сэмплер, и Hess сэмплер ^2, может быть по времени , дорого, и может измерить только комплексы с определенной микросреде ^3. Эффективность, альтернативные ОДП для генерации биологической информации о конкретном водоеме включает сбор Chironomidae поверхности плавающего куколки экзувия (SFPE) ^3.

Chironomidae (Insecta: Diptera), широко известный как не кусаться мошек, мух являются holometabolous, что, как правило, происходят в водной среде до выхода, как взрослые 60; на поверхности воды. Семья хирономид является видовое разнообразие, с примерно 5000 видов, описанных во всем мире; Однако, как многие, как 20000 видов, по оценкам, существует ^4. Хирономид полезны в документировании воды и качество среды обитания во многих водных экосистем из-за их большого разнообразия и переменных допустимых уровней загрязнения ^5. Кроме того, они часто являются наиболее распространенными и широко распространенные донные макробеспозвоночные в водных системах, как правило, составляет 50% или более видов в сообществе ^5,6. После появления земного взрослых, куколки экзувии (бросить куколки кожи) остается плавающие на поверхности воды (рис 1). Куколочные экзувии накапливаются вдоль банков или за препятствий под действием ветра или воды тока и может быть легко и быстро собраны, чтобы дать всеобъемлющий образец видов хирономид, которые возникли во время предыдущего 24-48 ч ^7.

ntent "> относительное изобилие и таксономический состав собранной SFPE отражает качество воды, учитывая, что некоторые виды очень терпимы загрязнения, в то время как другие являются весьма чувствительными ⁵ метод SFPE имеет много преимуществ по сравнению с традиционными методами отбора проб личинок хирономид в том числе: (1). минимальна , если таковые имеются, нарушение среды обитания происходит в зоне отбора проб; (2) образцы не сосредоточиться на сборе живые организмы, а неживые кожи, так траектория динамики сообщества не влияет; (3) определение в роду, и часто виды, относительно легко даны соответствующие ключи и описания ^3; (4) сбор, обработка и идентификации образцов является эффективным и экономичным по сравнению с традиционными методами отбора проб ^3,8,9; (5), накопленные экзувии представляют таксонов, что произошли от Широкий ассортимент микроместообитаний ^10; (6) метод применим практически во всех водных средах, в том числе потоков и рек, лиманов, ЛакES, пруды, бассейны рок, и водно-болотные угодья; и (7), может быть, SFPE быть более чувствительным индикатором здоровья экосистемы, так как они представляют лиц, которые завершили все этапы незрелые и успешно возникли как взрослые ^11.

Метод SFPE не новый подход для сбора информации о хирономид общин. Использование SFPE было впервые предложено Тинеман ¹² в начале 1900-х годов. Разнообразие исследований использовали SFPE для таксономических исследований (например, ^13-15), биоразнообразия и экологических исследований (например, ^7,16-19), и биологические оценки (например, ^20-22). Кроме того, некоторые исследования затрагивались различные аспекты построения выборки, размер выборки, и количество образцов событий, необходимых для достижения различных уровней обнаружения видов или родов (например, ^8,9,23). Эти исследования показали, что сравнительно высокий процент видов или родов могут быть обнаружены с умеренным efforт или расходы, связанные с обработкой образца. Например, Андерсон и Ferrington ⁸ определено, что на основе 100-счета подвыборки, 1/3 ^й меньше времени требуется, чтобы забрать образцы SFPE по сравнению с DIP-нетто образцов. Еще одно исследование установлено, что образцы 3-4 SFPE может быть отсортирован и определены для каждого погружения в чистой пробы и образцы, которые были SFPE более эффективным, чем DIP-нетто образцов на выявление видов, видовое богатство увеличивается ^3. Например, на участках с видового богатства значений 15-16 видов, в среднем рыболовный сачок эффективность была 45,7%, в то время как образцы были SFPE 97,8% эффективнее ^3.

Существенно, что метод SFPE был стандартизирован в Европейском Союзе ²⁴ (известный в технике хирономид куколки экзувии (CPET)) и Северной Америке ²⁵ для экологической оценки, но способ не описан в деталях. Одно из приложений методологии SFPE был описан Ferrington и др. 3; Однако, основное внимание в этом исследовании было оценить эффективность, эффективность и экономичность метода SFPE. Целью данной работы является описание всех этапов способа SFPE в деталях, в том числе сбора проб, обработки лабораторных, слайд монтажа и идентификации рода. Целевая аудитория включает аспирантов, исследователей и профессионалов, заинтересованных в расширении традиционных усилий по мониторингу качества воды в своих исследованиях.

протокол

1. Подготовка полевого сбора и сад

1. Определить количество образцов SFPE, которые должны быть собраны на основе дизайна исследования и приобрести один образец банку (например, 60 мл) для каждого образца.
2. Подготовьте две метки даты и местности для каждого образца банку. Разместите один на внутренней и прикрепить к другу на внешней части банки. Убедитесь, что каждая метка даты и местонахождение включает следующую информацию: страна, государство, графство, город, водоем, координаты GPS, дату и имя лица (лиц) сбор образца.
3. Соберите других конкретных материалов и оборудования (табл конкретных материалов / оборудования).

2. Поле Коллекция

1. Держите личинок лоток в одной руке и сито в другую. Опустите лоток личинок в воду, где SFPE аккумулировать (например, пена скопления, коряги, возникающих растительность, мусор, обратно вихри, и вдоль краев банковских) (рис 2а), позволяют Ватэ-э, экзувии, и мусор, чтобы войти в личиночной лоток и залить этот материал через сито. Если выборки в проточных системы, начинают на нижнем по потоку конце образца одним и работать вверх (фиг.2В). Если отбор проб в стоячих системы, начать с подветренной береговой линии.
   1. Повторите шаг 2,1 в течение 10 мин (или иным образом определена для конкретного режима выборки) в течение каждого заранее определенного одним образца (как правило, 100-200 м для образцов, взятых из потоков, но зависит от общей площади водной станции мониторинга); перемещаться между SFPE районах накопления соответственно.
2. Концентрат мусора в одном из районов сито, используя шприц бутылку с водой с сайта образца и тщательно передачи образцов SFPE предварительно помечены образец банку с помощью щипцов и поток этанола из бутылки шприца. Заполните образец банку с этанолом.
3. Повторите этапы 2,1 до 2,2 для всех образцов.

3. Образец Комплектование

ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные этого протокола относится к 300 SFPE подвыборки и, возможно, потребуется внести изменения для других размеров подвыборки. См Бушар и Ferrington в ⁹ принципов прореживанием и частоты дискретизации для пошива методы SFPE встретиться учебно-определенных целей и ресурсов.

1. Выделите 1-драма флакон для каждого образца SFPE; подготовить метку даты и локальности разместить внутри каждого флакона и заполнить флакон на ¾ с этанолом.
2. Удалить крышку с соответствующего образца банку и проверить прилагается куколки экзувия. Аккуратно промойте содержимое от крышки на чашке Петри с использованием шприц бутылку с этанолом. Найти и удалить метку из внутренней части образца банку с помощью щипцов и аккуратно промойте содержимое выключения этикетке на чашке Петри. Установите метку в сторону.
3. Передача содержимого образца банку в личиночной лоток, промывают этанолом, чтобы обеспечить не SFPE остаются в банке образца. Трансфер часть куколки экзувии, Resiиз-за, и этанол из лотка к чашке Петри. Убедитесь, что образец рассматривается в этаноле.
4. Поместите чашку Петри под стерео микроскопом. Систематически проверять содержимое чашки Петри для куколки экзувия. Выберите все куколки экзувии из чашки с помощью щипцов и место в пробирке. Не берите образцы, которые разбиты (т.е., не имеют, по крайней мере половину головогруди и брюшка), сушат, или сжатый, чтобы избежать проблем идентификации.
   Примечание: Идентификация видам часто требует, чтобы весь образец присутствует, хотя в некоторых случаях, идентификация рода уровня может быть возможным с частичным образцов.
   1. Вихревой блюдо и сканирования для дополнительного куколки экзувия, в том числе любые, которые могут застрять в стороны блюдо, а также, любые малых и полупрозрачных образцов, которые, возможно, не будет обнаружен изначально. Повторяйте, пока два последовательных сканирует не обнаружено никаких дополнительных куколки экзувии.
5. Повторите шаги 3.3 и3.4, пока все или 300 куколок экзувии не были собраны. При 300 куколок экзувии были выбраны, возвращают остаток от чашки Петри с личиночной лоток и промойте чашки Петри с этанолом. Затем, перевести остаток от личиночной лоток на пустой образца банку, добавить метку даты и локальности, и положил крышку на банку. Сохраните или распоряжаться остатком в соответствии с протоколами по конкретным проектам.

4. Образец Сортировка

1. Налейте все выбрал куколки экзувии из маркированную емкость в чашку Петри с достаточным количеством этанола, чтобы только покрыть образцов.
2. Под микроскопом стерео, отдельные образцы в различных морфологических групп (т.е., morphotaxa) и поместить каждый morphotaxon в отдельно меченого флаконы заполнены 3/4 ^й полный этанолом.
   1. Использование внешних морфологических характеристик, чтобы отделить хирономид morphotaxa. Например, из цефалоторакса, использовать различия в присутствии, размер, форма иокраска головных бугров, фронтальные бородавки, лобные волоски, и грудной рога. Из брюшной полости, использовать шипы, hookrows, шагрень, щетинки и отроги брюшных сегментов, в дополнение к анальных долей для разделения morphotaxa (4А). См Ferrington и др. ^5, Saether ²⁶ Пиндер и Рейсс ²⁷ дополнительных описаний и рисунков морфологических характеристик.
   2. Используйте дополнительные этанол, если образцы начинают сохнуть.

5. Презентация Монтаж

1. Заполните одну лунку нескольких луночный планшет для каждого morphotaxon с 95% этанола.
   1. Поместите несколько представлений (например, 25% от общего числа) каждого morphotaxon быть установлен в слайд отдельных скважин пластины. Разрешить образцы сидеть в хорошо, по крайней мере 10 мин для обезвоживания достаточно.
2. Этикетка слайды с соответствующей сайта, сбора, идентификации и informatiна (рис 3).
3. Место слайд на стерео микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: шаблон слайда, приклеенный к стадии полезно для последовательного размещения.
4. Поместите каплю эупарал на слайде; распространить эупарал так, что он приблизительно соответствует по размерам покровным. Используйте надлежащую вентиляцию при работе с эупарал.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте надлежащую вентиляцию при работе с эупарал.
5. Вставить представителя от первого morphotaxon в эупарал с помощью щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для аннулированию избыток этанола из образца, используя щипцы, мягко нажмите образца на лаборатории салфетки до внедрения его в эупарал.
6. Отделите головогрудь с живота с помощью остроконечного пинцета и / или рассечение зондов (рис 4а).
   1. Сплит головогрудь вдоль шва ecdysial (рис 4В) и откройте головогрудь, так что шовный края находятся на противоположных сторонах (рис 4в).
   2. Расположите Cephalothorax так, что брюшная сторона обращена вверх (рис 4C).
   3. Расположите живота спинной стороне до; разместить непосредственно под головогрудь (рис 4C).
7. Поместите покровное на образце. Держите покровное под углом, с одного края касаясь слайд, а затем медленно опустите и падение покровное, чтобы уменьшить образование пузырьков воздуха. Слегка нажмите на покровное, чтобы сгладить образца.
8. Повторите шаги 5.3 через 5,7 для всех образцов обезвоженных.

6. Род Идентификация

1. Определите род слайд-монтажа образцов с использованием сложного микроскопа. Определить образцы к роду помощью клавиш и диагнозы в Wiederholm 28 и Ferrington и др. ^5. При необходимости, подтвердить идентификацию на уровне семьи с использованием Ferrington и др. ^5. ПРИМЕЧАНИЕ: Там были многочисленные общие описания и изменения начиная с Wiederholm ²⁸ и Ferrington,и др. ^5, следовательно, эти ключи и диагнозы неполны и должны быть дополнены с первичной литературы.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует жизненный цикл хирономид; незрелые стадии (яйца, личинки, куколки), как правило, происходят в, или близко связаны, в водной среде. После завершения личиночной стадии жизни, личинка строит трубчатую приют и присоединяется с шелковыми секрета в окружающую п?...

Обсуждение

Наиболее важные шаги для успешного сбора SFPE образца, Комплектация, сортировка, монтаж слайд, и идентификации являются: (1) поиск областей высокого накопления SFPE в области исследования во время сбора поля (2А); (2) медленно сканирования содержимое чашки Петри для обнаружения всех S...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	70-95%
Plastic wash bottles	Fisher Scientific	0340923B
Sample jar	Fisher Scientific	0333510B	Glass or plastic, 60-mL recommended
Testing sieve	Advantech	120SS12F	125-micron mesh size
Larval tray	BioQuip	5524	White
Stereo microscope
Glass shell vials	Fisher Scientific	0333926B	1-dram size
Plastic dropper	Thermo Scientific	1371110	30 to 35 drops/mL
Fine forceps	BioQuip	4524	#5
Petri dish	Carolina	741158	Glass or plastic
Multi-well plate	Thermo Scientific	144530	Glass or plastic
Glass microslides	Thermo Scientific	3010002	3 x 1 in.
Glass cover slips	Thermo Scientific	12-519-21G	Circular or square
Euparal mounting medium	BioQuip	6372B
Pigma pen	BioQuip	1154F	Black
Probe	BioQuip	4751
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional™	34120