שימוש בChironomidae (כפולי כנף) גלמי Exuviae כמהיר Bioassessment פרוטוקול לגופי מים צפים-שטח

Summary

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

Abstract

פרוטוקולי bioassessment מהירים באמצעות מכלולי macroinvertebrate benthic שימשו בהצלחה על מנת להעריך את השפעות אדם על איכות מים. למרבה הצער, שיטות מסורתיות benthic זחל דגימה, כגון הטבילה-נטו, יכולות להיות זמן רב ויקר. פרוטוקול חלופי כרוך אוסף של exuviae Chironomidae צפה משטח גלמים (SFPE). Chironomidae היא משפחה עשיר במינים של זבובים (כפולי כנף) שלבים שבשלה מתרחשים בדרך כלל בבתי גידול מימיים. chironomids המבוגר לצאת מהמים, משאיר את עורות גלמים, או exuviae, צף על פני המים. Exuviae לעתים קרובות מצטבר לאורך גדות או מאחורי חסימות על ידי פעולה של זרם הרוח או מים, שבו הם יכולים להיות שנאספו כדי להעריך גיוון ועושר chironomid. Chironomids יכול לשמש כמדדים ביולוגיים חשובים, שכן כמה מינים הם יותר סובלניים לזיהום יותר מאחרים. לכן, הרכב השפע ומינים היחסי של SFPE נאסף לשקףשינויים באיכות מים. כאן, שיטות הקשורות לאוסף שדה, עיבוד מעבדה, שקופיות הרכבה, וזיהוי של SFPE chironomid מתוארות בפירוט. יתרונות של שיטת SFPE כוללים הפרעה מינימאלית באזור דגימה, איסוף דגימה יעיל וחסכוני ועיבוד מעבדה, קלות זיהוי, תחולה כמעט בכל סביבות מימיות, ומידת פוטנציאל ליותר רגישה ללחץ מערכת אקולוגית. מגבלות כוללות חוסר היכולת לקבוע שימוש microhabitat זחל וחוסר יכולת לזהות exuviae גלמים למינים אם הם לא היו קשורים עם זכרים בוגרים.

Introduction

תוכניות ניטור ביולוגיות, המשתמשות באורגניזמים חיים כדי להעריך את בריאות סביבתית, משמשות לעתים קרובות כדי להעריך את איכות מים או לפקח הצלחה של תוכניות שיקום מערכת אקולוגית. פרוטוקולי bioassessment מהירים (RBP) באמצעות מכלולי macroinvertebrate benthic היו פופולריים בקרב סוכנויות משאבי מים של מדינה מאז 1989 ^1. שיטות מסורתיות של דגימת macroinvertebrates benthic לRBPs, כגון טבילה-נטו, סמפלר Surber, והס סמפלר ^2, יכול להיות גוזלים זמן רב, יקר, ואולי רק למדוד מכלולים מmicrohabitat בפרט ^3. RBP יעילה, חלופית להפקת מידע ביולוגי על גוף מים מיוחד כרוכה אוסף של exuviae Chironomidae צפה משטח גלמים (SFPE) ^3.

Chironomidae (Insecta: כפולי הכנף), הידוע בכינוי ברחשים שאינם נושכים, זבובים holometabolous שמתרחשים בדרך כלל בסביבות מימיות לפני מתעורר כמו מבוגרים 60; על פני המים. משפחת chironomid היא מינים-עשירים, עם כ -5,000 מינים המתוארים ברחבי העולם; עם זאת, כ -20,000 מינים מוערכים להתקיים ^4. Chironomids שימושי בתיעוד מים ואיכות סביבה במערכות אקולוגיות ימיות רבות בגלל הגיוון שלהם הגבוה ורמות סובלנות הזיהום משתנים ^5. יתר על כן, הם לעתים קרובות macroinvertebrates benthic השפע והנפוץ ביותר במערכות מים, בדרך כלל היוו 50% או יותר מהמינים בקהילה ^5,6. בעקבות הופעתה של המבוגרים היבשתיים, exuviae גלמים (יצוק עור גלמים) נשאר צף על פני המים (איור 1). exuviae גלמים לצבור לאורך גדות או מאחורי חסימות דרך הפעולה של זרם רוח או מים ויכול להיות שנאסף בקלות ובמהירות לתת מדגם מקיף של מיני chironomid שהתפתחו במהלך 24-48 שעות הקודמות ^7.

ntent "> השפע היחסי וההרכב הטקסונומי של SFPE נאסף משקף איכות מים, בהתחשב בכך שכמה מינים מאוד זיהום סובלני, ואילו אחרים הם די רגישים ⁵ יש שיטת SFPE יתרונות רבים על פני שיטות דגימת chironomid זחל מסורתיות כוללים:. (1) מינימאלי , אם בכלל, הפרעת בית גידול מתרחשת באזור דגימה; (2) דגימות אינן מתמקדות באיסוף יצורים חיים, אלא העור שאינם מהחיים, כל כך את המסלול של דינמיקת קהילה אינו מושפעת; (3) זיהוי לסוג, ו לעתים קרובות מינים, הוא יחסית קלים ניתנו מפתחות ותיאורים ³ מתאימים; (4) איסוף, עיבוד, וזיהוי דגימות הוא יעיל וחסכוני בהשוואה לשיטות דגימה מסורתית ^3,8,9; (5) exuviae נצבר מייצג מינים שמקורם מגוון רחב של מייקרו בתי גידול ^10; (6) השיטה היא ישימה כמעט בכל סביבות מימיות, כולל נחלים ונהרות, שפכי נהרות, Lakes, בריכות, בריכות סלע, ​​וביצות; ו( 7) SFPE אולי להיות אינדיקטור רגיש יותר לבריאות מערכת אקולוגית כיוון שהם מייצגים אנשים שהשלימו את כל שלבים בוגרים ויצאו בהצלחה בבגרות ^11.

שיטת SFPE אינה גישה חדשה לאיסוף מידע על קהילות chironomid. שימוש בSFPE הוצע לראשונה על ידי ¹² Thienemann בתחילת 1900. מגוון מחקרים השתמש SFPE לסקרים הטקסונומית (למשל, ^13-15), מגוון ביולוגי ומחקרים אקולוגיים (למשל ^7,16-19), והערכות ביולוגיות (למשל, ^20-22). בנוסף, חלק מהמחקרים עסקו בהיבטים שונים של עיצוב המדגם, גודל מדגם, ומספר אירועי מדגם הנדרש להשגת רמות זיהוי השונות של מינים או genera (למשל, ^8,9,23). מחקרים אלו מצביעים על כך שאחוזים גבוהים יחסית של מינים או genera יכולים להיות מזוהים עם effor המתוןלא או הוצאה הקשורים לעיבוד מדגם. לדוגמא, אנדרסון וFerrington ⁸ נקבעו כי על הסמך subsample 100-ספירה, נדרש 1/3 ^RD פחות זמן כדי לאסוף דגימות SFPE לעומת לטבול נטו דגימות. מחקר נוסף קבע כי 3-4 דגימות SFPE יכולות להיות מסודרות וזיהו עבור כל מדגם לטבול-רשת וכי דגימות SFPE היו יעילה יותר מדגימות לטבול-נקי במין גילוי כעושר מינים מוגבר ^3. לדוגמא, באתרים עם עושר מיני ערכים של 15-16 מינים, היעילות לטבול-הנקי הממוצעת היו 45.7%, ואילו דגימות SFPE היו 97.8% ³ יעילים.

חשוב לציין, שיטת SFPE כבר טופל באיחוד האירופי ²⁴ (המכונה טכניקת exuviae גלמי chironomid (CPET)) ובצפון אמריקה ²⁵ להערכה אקולוגית, אבל השיטה לא תוארה בפירוט. אחד יישומים של המתודולוגיה SFPE תוארו על ידי Ferrington, et al. 3; עם זאת, ההתמקדות העיקרית של מחקר זה הייתה להעריך את היעילות, יעילות, וכלכלה של שיטת SFPE. מטרת עבודה זו היא לתאר את כל השלבים של שיטת SFPE בפירוט, כולל איסוף דגימה, עיבוד מעבדה, שקופיות הרכבה, וזיהוי סוג. קהל היעד כולל סטודנטים לתואר שני, חוקרים, ואנשי מקצוע המעוניינים בהרחבת מאמצי ניטור איכות מים מסורתיים ללימודיהם.

Protocol

1. הכנת חומרי גלם לאוסף שדה

1. לקבוע את מספר דגימות SFPE שיש לאסוף מבוסס על עיצוב המחקר ולרכוש צנצנת אחת מדגם (למשל, 60 מיליליטר) עבור כל דגימה.
2. הכן שתי תוויות תאריך ויישוב לכל צנצנת מדגם. מקום אחד ובלהדביק בתוך אחר מחוץ לצנצנת. ודא שכל תווית תאריך ויישוב כוללת את הפרטים הבאים: ארץ, מדינה, מחוז, עיר, גוף מים, קואורדינטות GPS, תאריך, ושמו של אדם (ים) איסוף הדגימה.
3. לאסוף חומרים ספציפיים אחרים וציוד (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי).

2. אוסף שדה

1. להחזיק מגש זחל ביד אחת ומסנן באחר. טובלים את מגש הזחל למים שבו לצבור SFPE (למשל, הצטברות קצף, קשיים, צמחייה מתהווה, פסולת, חזרה מערבולות, ולאורך קצות בנק) (איור 2 א), יאפשר ואטאה, exuviae, ופסולת להיכנס למגש הזחל, ויוצקים את החומר הזה דרך המסננת. אם הדגימה במערכת lotic, תתחיל בסוף במורד הזרם מהישג יד המדגם ולעבוד במעלה הזרם (איור 2). אם דגימה במערכת lentic, מתחיל בקו החוף בכיוון הרוח.
   1. חזור על שלב 2.1 במשך 10 דקות (או כהגדרה אחרת למשטר דגימה ספציפי) בתוך כל הישג יד מדגם מוגדר מראש (בדרך כלל 100-200 מ 'לדגימות שנאספו מזרמים, אבל תלוי בשטח הכולל של אתר הניטור הימי); לעבור בין אזורי הצטברות SFPE כמתאים.
2. להתרכז פסולת באזור אחד של המסננת באמצעות בקבוק להשפריץ מלאים במים מאתר המדגם וזהירות להעביר מדגם SFPE צנצנת מדגם מראש שכותרתו בעזרת מלקחיים וזרם של אתנול מבקבוק להשפריץ. מלא צנצנת מדגם עם אתנול.
3. חזור על שלבים 2.1-2.2 לכל הדגימות.

קטיף 3. דוגמא

הערה: שאר פרוטוקול זה נוגע לsubsample SFPE 300 וייתכן שיהיה צורך לשנות עבור גדלי subsample אחרים. ראה ⁹ הנחיות subsampling ותדר דגימה של Bouchard וFerrington להתאמת שיטות SFPE כדי לעמוד ביעדים ומשאבים ללמוד ספציפיים.

1. להקצות בקבוקון 1-DRAM עבור כל דגימת SFPE; להכין תווית תאריך ויישוב למקום בתוך כל בקבוקון ולמלא את בקבוקון ¾ מלא עם אתנול.
2. הסר את המכסה מצנצנת המדגם המקבילה ולבדוק exuviae גלמים מצורף. לשטוף בעדינות את תוכן את המכסה על צלחת פטרי באמצעות בקבוק להשפריץ מלא באתנול. אתר ולהסיר תווית מהחלק הפנימי של צנצנת המדגם באמצעות מלקחיים ולשטוף בעדינות את תוכן התווית על גבי צלחת פטרי. להגדיר תווית בצד.
3. העבר את התוכן של צנצנת הדגימה לתוך מגש זחל, שטיפה עם אתנול כדי להבטיח שאין SFPE יישאר בצנצנת המדגם. העבר חלק מexuviae, רזה גלמיםבשל, ואתנול מהמגש לצלחת פטרי. ודא שהמדגם מכוסה באתנול.
4. מניחים את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ סטריאו. באופן שיטתי לסרוק את התוכן של צלחת פטרי לexuviae גלמים. בחר כל exuviae גלמים מהצלחת באמצעות מלקחיים ומקום לתוך הבקבוקון. אל תרים דגימות שנשברו (כלומר, אין לי לפחות מחצית cephalothorax והבטן), מיובש, או דחוס, כדי למנוע בעיות זיהוי מאוחר יותר.
   הערה: זיהוי למינים לעתים קרובות דורש שכל הדגימה היא הווה, אם כי במקרים מסוימים, זיהוי ברמת סוג עשוי להיות אפשרי עם דגימות חלקיות.
   1. צלחת מערבולת וסריקה לאיתור exuviae נוספת גלמים, לרבות כל שיכול להיות תקוע לצדדים של המנה, וכן, כל דגימות קטנות ושקופות שאולי לא להיות מזוהה בתחילה. חזור על פעולה עד שתי סריקות ברציפות לחשוף לא exuviae גלמים נוסף.
5. חזור על שלבים 3.3 ו3.4 עד 300 או כל exuviae גלמים כבר הרים. כאשר 300 exuviae גלמים כבר הרים, להחזיר את השאריות מצלחת פטרי למגש הזחל ולשטוף את צלחת פטרי עם אתנול. לאחר מכן, להעביר את השאריות ממגש הזחל לצנצנת המדגם הריקה, להוסיף תווית התאריך ויישוב, ולשים את המכסה על הצנצנת. לשמור או להשליך שאריות על פי פרוטוקולי פרויקט ספציפי.

4. לדוגמא מיון

1. יוצקים את כל הרים exuviae גלמים מהבקבוקון שכותרתו לתוך צלחת פטרי מלאה מספיק אתנול רק כדי לכסות את הדגימות.
2. תחת מיקרוסקופ סטריאו, דגימות נפרדות לקבוצות מורפולוגיים שונות (כלומר, morphotaxa) ולמקם כל morphotaxon לבנפרד בקבוקונים שכותרתו מילאו 3/4 ^ה מלאים עם אתנול.
   1. לנצל מאפיינים מורפולוגיים חיצוניים להפריד morphotaxa chironomid. לדוגמא, מcephalothorax, להשתמש הבדלים בנוכחות, גודל, הצורה, וצבעוניות של גבשושיות כאפאליך, יבלות חזיתיות, setae החזיתי, וקרן בית חזה. מהבטן, להשתמש קוצים, hookrows, shagreen, setae, ושלוחות של מגזרי הבטן, בנוסף לאונות אנאלי להפרדת morphotaxa (איור 4 א). ראה Ferrington, et al. ^5, Sæther ^26, Pinder ו ^-27 רייס לתיאורים ודמויות של מאפיינים מורפולוגיים נוספים.
   2. השתמש אתנול נוסף אם דגימות מתחילות להתייבש.

5. שקופיות הרכבה

1. מלא גם אחד של צלחת רב גם לכל morphotaxon עם 95% אתנול.
   1. הנח ייצוגים מרובים (לדוגמא, 25% בסך הכל) של כל morphotaxon להיות מותקן שקופית לתוך בארות בודדות של הצלחת. לאפשר דגימות לשבת היטב לפחות 10 דקות כדי ליבש מספיק.
2. שקופיות תווית עם אתר מתאים, אוסף, וinformati זיהויב( איור 3).
3. שקופיות מקום במיקרוסקופ סטריאו.
   הערה: תבנית של השקופית המודבקת לשלב שימושית למיקום עקבי.
4. מניחים ירידה של Euparal בשקופית; להפיץ את Euparal כך שהוא קרוב לגודל של coverslip. השתמש אוורור נאות בעת עבודה עם Euparal.
   הערה: השתמש אוורור נאות בעת עבודה עם Euparal.
5. להטביע נציג מmorphotaxon הראשון לEuparal באמצעות מלקחיים.
   הערה: כדי לבטל את אתנול עודף מהדגימה, באמצעות מלקחיים, לטפוח בעדינות על דגימת מעבדה מגבונים לפני הטבעתו בEuparal.
6. הפרד את cephalothorax מהבטן באמצעות מלקחיים קנס שקצהו ו / או בדיקות לנתיחה (איור 4 א).
   1. לפצל את cephalothorax לאורך תפר ecdysial (איור 4) ולפתוח את cephalothorax כך שקצות התפר הם משני צדי מתרס (איור 4C).
   2. לכוון גephalothorax כך שצד הגחון הוא פונה כלפי מעלה (איור 4C).
   3. מקם את צד גב הבטן עד; מקום מייד מתחת לcephalothorax (איור 4C).
7. מניחים coverslip על הדגימה. להחזיק coverslip בזווית, עם קצה אחד נוגע בשקופיות, ולאחר מכן נמוך יותר לאט ושחרר את coverslip להפחית היווצרות בועת האוויר. לחץ קל על coverslip כדי לשטח את הדגימה.
8. חזור על שלבים 5.3 דרך 5.7 לכל דגימות המיובשים.

זיהוי 6. סוג

1. לקבוע סוג של דגימות רכוב שקופיות באמצעות מיקרוסקופ מתחם. לזהות דגימות לסוג באמצעות מפתחות ואבחנות בWiederholm 28 וFerrington, et al. ^5. במידת צורך, לאשר זיהוי רמה-משפחה באמצעות Ferrington, et al. ^5. הערה: היו תיאורים רבים גנריות ותיקונים מאז Wiederholm ²⁸ וFerrington,et al. ^5, לכן, מפתחות ואבחנות אלה אינם שלמים וצריכים להשלים עם ספרות ראשונית.

תוצאות

איור 1 מדגים את מחזור החיים chironomid; שלבים בוגרים (ביצה, זחל, גולם) בדרך כלל מתקיימים ב, או קשור קשר הדוק עם, סביבה מימית. עם השלמת שלב החיים הזחל, הזחל בונה מקלט דמוי צינור ומייחס את עצמו עם הפרשות משי למצע שמסביב והתגלמות מתרחשת. ברגע מבוגר הפיתוח התבגר, הגולם משח...

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר לאוסף מוצלח SFPE מדגם, קטיף, מיון, הרכבה שקופיות, והזדהות הם: (1) איתור אזורים של הצטברות SFPE גבוהה בתחום המחקר באוסף שדה (איור 2 א); (2) סריקה באיטיות את התוכן של צלחת פטרי לגילוי של כל SFPE במהלך קטיף מדגם; (3) פיתוח המיומנות הידנית הצורך לנתח את ceph...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	70-95%
Plastic wash bottles	Fisher Scientific	0340923B
Sample jar	Fisher Scientific	0333510B	Glass or plastic, 60-mL recommended
Testing sieve	Advantech	120SS12F	125-micron mesh size
Larval tray	BioQuip	5524	White
Stereo microscope
Glass shell vials	Fisher Scientific	0333926B	1-dram size
Plastic dropper	Thermo Scientific	1371110	30 to 35 drops/mL
Fine forceps	BioQuip	4524	#5
Petri dish	Carolina	741158	Glass or plastic
Multi-well plate	Thermo Scientific	144530	Glass or plastic
Glass microslides	Thermo Scientific	3010002	3 x 1 in.
Glass cover slips	Thermo Scientific	12-519-21G	Circular or square
Euparal mounting medium	BioQuip	6372B
Pigma pen	BioQuip	1154F	Black
Probe	BioQuip	4751
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional™	34120