Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational

Resumen

El tráfico del receptor modula la señalización celular y la capacidad de respuesta a ligandos y es, en sí, que responda a las condiciones celulares, incluyendo la señalización inducida por ligando. A continuación, describimos una técnica poderosa y flexible para evaluar cuantitativamente el tráfico del receptor inducida por fármacos usando immunolabeling y análisis colocalizational.

Resumen

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Introducción

Los receptores, en particular receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), son objeto de tráfico rutinaria intracelularmente, hacia y desde la superficie de la célula ^1. Estos procesos complejamente orquestadas y estrechamente controlados dictan complementos del receptor de células disponibles 'y regulan la actividad del receptor temporal, la desensibilización y resensibilización ^2-4. Es importante destacar que estos procesos son sensibles a ambientes celulares, incluyendo la actividad del receptor inducida por fármacos o inactividad. Es decir, las acciones de los ligandos en los receptores pueden alterar el tráfico intracelular de estos receptores, alterando así la capacidad de respuesta celular. De esta manera, los ligandos externos ejercen aún más efectos sobre la función celular, incluso más allá clásicos cascadas-mensajero-efector a ^5,6.

Examinar los cambios en el tráfico del receptor inducida es difícil. Todas las técnicas disponibles implican limitaciones. Ensayos de protección de biotina se han utilizado para monitor receptores superficiales poblaciones. Estos receptores están biotinilados y un timecourse de inmunoprecipitaciones se realiza para cuantificar la reducción en los receptores de biotina en el tiempo. Esta técnica esencialmente supervisa la degradación gradual de una inicial, marcado, la población de los receptores ^7, y es muy útil en la construcción de cursos de tiempo de este proceso. Por desgracia, este ensayo no es capaz de controlar cualquier procedimiento distinto de la degradación de la piscina original de receptores, tales como la internalización, reciclado o nuevos receptores. También, la adición de un anticuerpo en el rango de 150 kDa a un receptor en la gama de 50 kDa puede alterar el tráfico del receptor de ^8,9, y esta técnica puede ser difícil de usar con receptores de baja a nivel de expresión.

Otros procedimientos utilizan diversos métodos para identificar los compartimentos intracelulares de trata (por ejemplo, endosomas, etc.) y evaluar su colocalización con los receptores de interés. Esto incluye los EE.UU.e de los sistemas heterólogos que expresan la proteína fluorescente etiquetada-construcciones quiméricas de los receptores y los marcadores de compartimentos (GTPasas por ejemplo, Rab-familiares). Potencialmente, esto permite el uso de imágenes de células vivas, la eliminación de los problemas relacionados con la fijación y permeabilización. Mientras potente, una estrategia de este tipo adolece de las mismas limitaciones de los sistemas heterólogos en general: efectos de la etiqueta y el nivel de expresión en el tráfico de comportamiento y la incompatibilidad con los tipos de células fisiológicamente más representativos. Más popularmente, colorantes se utilizan para etiquetar fácilmente compartimentos intracelulares (por ejemplo, lisosomas, ostensiblemente) ^10. Tintes, sin embargo, pueden carecer de especificidad (todos los organelos ácidos en el caso de los tintes para lisosomas) y no evaluar el tráfico a través de otros compartimentos. Sin embargo, estas técnicas permiten un control considerable sobre el sistema y las condiciones experimentales y pueden beneficiarse de los métodos de análisis de colocalización presentados aquí, a continuación.

El método we aquí presentes refina el seguimiento del tráfico de receptores por colocalización. Utilizando inmunocitoquímica (CPI) para etiquetar marcadores apropiados, es posible identificar múltiples compartimentos intracelulares distintas. Esto también permite el uso de cultivos celulares primarios fisiológicamente relevantes en lugar de sistemas heterólogos. Este protocolo CPI implica la fijación de las células de interés antes de etiquetado; esto permite que el etiquetado en una punto de tiempo específico después del tratamiento (s) de drogas. Esto produce una "instantánea" de las asociaciones mundiales receptor de compartimentos en ese punto de tiempo. Con múltiples puntos de tiempo, un timecourse de los cambios de tráfico también puede ser construido.

Brevemente, las células se etiquetan para el receptor y el compartimento intracelular de interés tratados con fármaco,, confocal fotografiado, y las fotomicrografías se analizan para cuantificar matemáticamente colocalización del receptor y el compartimiento ^11. En nuestro uso, hemos examinado la colocalización de un receptor con Rab5, Rab11 y lisosomal-asociado proteína de membrana 1 (LAMP1). Estos marcadores identifican endosomas tempranos, endosomas de reciclaje, y lisosomas, respectivamente. Estas medidas colocalización actúan como sustitutos de los procesos generales de la internalización, el reciclaje y la degradación ^12.

Al igual que con todas las técnicas, algunas limitaciones deben ser considerados. Debido a la necesidad de imagen cada neurona individual analizada, esta técnica puede llegar a ser bastante mano de obra en función del número de condiciones y puntos de tiempo implicados. Todo immunolabeling también debe lidiar con los efectos sobre la ultraestructura celular, localización de la proteína, y la accesibilidad epítopo causados ​​por la fijación y permeabilización ^13.

Aunque originalmente optimizada para su uso con cultivos primarios de neuronas sensoriales primarias, este método es ampliamente compatible con otros modelos de cultivo en monocapa-plateado.

El uso de un measur matemáticamente cuantificadoe de colocalización es, sobre todo, mucho más metodológicamente rigurosa que las técnicas anteriores utilizadas para evaluar los cambios de tráfico de los receptores, que a menudo se han basado en medidas subjetivas, vagas tales como superposiciones de varios canales visualmente ^{inspeccionadas-14.}

Esta técnica es particularmente útil para su amplia compatibilidad con intervenciones in vivo (antes de la generación de cultivo primario), intervenciones in vitro (durante el crecimiento del cultivo), y varios etiquetado objetivos ^15. Como tal, se puede adaptar a muchas preguntas de investigación diferentes.

Protocolo

Nota: Este protocolo es ampliamente compatible con varios modelos monocapa chapado célula / tejido de cultivo, los regímenes de tratamiento de drogas, y las metas en materia de etiquetado. Así, en el uso real, muchos parámetros específicos variarán según el diseño experimental. Aquí, las referencias a estos parámetros definidos por el usuario son genéricos. Condiciones de ejemplo, tal como se utiliza para obtener los resultados representativos, se incluyen en cursiva.

1. Soluciones

1. Preparar tampón de lavado mediante la mezcla de 0,1 M Tris-Buffered hipertónica (300 mM) solución salina y 0,05% de polisorbato 20; pH 7,4 a TA.
2. Preparar tampón de bloqueo. Para 0,05 M Tris-Buffered hipertónica (300 mM) Saline añadir 0,05% de polisorbato 20, 3% albúmina de suero bovino (BSA) y 0,1% de gelatina de pescado fría piel y ajustar el pH a 7,4 a temperatura ambiente.
3. Preparar diluyente de anticuerpo mediante la adición de 0,05% de polisorbato 20, 1% BSA, 0,1% gelatina de piel de pescado fría a 0,05 M Tris-Buffered hipertónica (300 mM) Saline y ajustar el pH a 7,4 a 4 ^o C.
   Nota: El pH de tampones Tris es dependiente de la temperatura. Es decir, un cambio en la temperatura cambiará el pH de la solución. Por consistencia, estos tampones deben ser siempre pH se ajustó-a la temperatura a la que se van a utilizar.

2. Cultivo Celular

Nota: Los protocolos de cultivo de células apropiadas variarán en función del tipo (s) celular utilizado. Estos procedimientos deben ser optimizados por separado. Metodologías detalladas de cultivo celular son fácilmente disponibles, incluyendo ^16. Un procedimiento similar se utilizó para obtener los resultados representativos, con las notables diferencias:

1. Dorsales Cultura neuronas de los ganglios de la raíz de los animales adultos como se describe ^12. Utilice un medio de crecimiento de adultos-neurona para cultivar las células. Reducir la densidad celular glial por preplating, en lugar de glutamato. Esto se traduce en una cultura neuronal glial mixto crecido en cubreobjetos de vidrio de 12 asaltos con por lo menos 30 a 60 neuronas por placa y acompañan células gliales crecido hasta approximatEly 40% de confluencia. Cabe señalar que las neuronas en un cultivo primario no se replicarán y será empujado fuera de la placa por co-cultivadas glia si la glia se les permite crecer en exceso. Con el fin de evitar afectar las neuronas, la reducción física de números gliales es preferible a los métodos farmacológicos químicos /.
   Nota: Para los fines de este protocolo, se supone que las células de interés se cultivan a su experimentalmente deseada por el estado y monocapa chapado. Encontramos que chapado en cubreobjetos de vidrio de 12 asaltos en placas de 24 pocillos sea más conveniente. Todos los volúmenes y los procedimientos descritos son apropiados para un cubreobjetos en un pocillo de una placa de 24 pocillos.

3. Tratamiento de Drogas de las células cultivadas

Nota: secuencial múltiple o de solapamiento, los tratamientos farmacológicos son posibles. Los fármacos, dosis / concentraciones y duraciones de exposición utilizado dependerá del experimento específico.

1. Retire el medio de cultivo original de ¹⁶ y reemplazarlo con un medio que contiene el fármaco (s) de interés a la concentración (s) elegido. En este caso, utilice 10 M de morfina solubiliza en solución salina o utiliza solución salina como control.
   Nota: Es importante que cada réplica independiente (generalmente un solo cultivo en placa de 24 pocillos) contiene la misma condición de control común. Esto permitirá la normalización de los datos a través de repeticiones, que corrige la variabilidad inter-ensayo.
2. Se incuban las células en las condiciones de crecimiento originales ¹⁶ para 48 hr.
3. Para los tratamientos farmacológicos posteriores, repita los pasos 3.1 y 3.2 con deltorfina 1 M, SNC 80 1 M, o vehículo y se incuba durante 60 min ^12. Solubilizar deltorfina II en agua y solubilizar SNC 80 a 10 mM en 40 mM HCl y sonicado, diluido a 1 mM en agua.
   Nota: Este protocolo asume el fármaco (s) han sido solubilizado de tal manera que se pueden disolver a la concentración deseada (s) en el medio de crecimiento elegido. Procedimientos adecuados paratales solubilización puede variar dependiendo de la droga en cuestión y debe ser optimizado por separado.
4. Lavar las células suavemente, tres veces, con ~ 1 ml de tampón de lavado por lavado. Realizar cada lavado aspirando suavemente el líquido del pozo, luego rápidamente, y suavemente, rellenar el pozo con solución fresca, según se desee (en este caso con tampón de lavado).

4. Fijación y inmunocitoquímica

Nota: Los objetivos específicos de etiquetado variarán según el experimento. En nuestro uso, etiquetamos receptores opioides delta (DOR) y Rab5, Rab 11, y LAMP1, como se discute. Los anticuerpos específicos utilizados dependerá del experimento específico. Condiciones de etiquetado óptimas dependen de la anticuerpo específico (s) usados. Una discusión mucho más completa de este tema está por debajo.

1. Fijar las células por inmersión en ~ 300 l 4% de paraformaldehído en 0,1 M tampón fosfato salino durante 10 min a 37 ºC.
   Nota: Es importante que el 4% de paraformaldehído estar recién preparado debido a la autofluorescencia causada por el uso de paraformaldehído previamente congelado.
2. Lavar las células suavemente, 3 veces, con ~ 1 ml de tampón de lavado por lavado, como se describe en 3.3.
3. Se incuban las células en 300 l tampón de bloqueo durante 2 horas a RT.
4. Se incuban las células con anticuerpos primarios en 300 l de diluyente de anticuerpo durante 48 horas a 4 ºC. En nuestro uso, anticuerpos primarios contra DOR (de conejo anti-dor) y uno de: Rab5 (ratón anti-Rab5), Rab 11 (ratón anti-Rab11), y LAMP1 (de cabra anti-LAMP1).
5. Lavar las células suavemente, tres veces, con ~ 1 ml de tampón de lavado por lavado, como se describe en 3.3.
6. Se incuban las células con anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluoróforos (véase la discusión más adelante) en 300 l de diluyente de anticuerpo durante 1 hora a RT. En esto, y todos los pasos subsiguientes, proteger a las células de la luz. Para obtener los resultados representativos, utilice verde emisores de anti-conejo y eith-fluoróforo conjugadoer un fluoróforo conjugado anti-ratón-emisor de rojo o-fluoróforo conjugado de cabra anti-rojo-emisor de luz.
7. Lavar las células suavemente, 3 veces, con ~ 1 ml de tampón de lavado por lavado, como se describe en 3.3.
8. Quitar los cubreobjetos de 12 asaltos de placas de 24 pocillos dejando ~ 1 ml de tampón de lavado en cada pocillo, la celebración de la placa a ~ 45º y apalancar el cubreobjetos del piso bien utilizando unas pinzas finas. El cubreobjetos vendrá a descansar contra la pared del pozo, desde donde se puede quitar fácilmente utilizando los fórceps.
9. Monte el cubreobjetos, célula boca abajo, en el microscopio se desliza con anti-fading medio de montaje.

5. Configuración del microscopio

1. El uso de un objetivo de gran aumento (100X), primero busque una célula representante para ser fotografiado usando epifluorescencia.
2. Configure los ajustes de captura de imagen para grabar 8 bits imágenes TIFF sin comprimir de cada canal marcado (para la detección de cada fluoróforo utilizado por ejemplo, 488 nm y 594 nm), a la imagen de cada canal secuencialmente (ya sea por línea o trama), y en un promedio de 4 a 6 exploraciones para la imagen final. Resolución de imagen óptima será microscopio específico, pero 1024 x 1024 produce normalmente buenos resultados.
3. Cambie a la ruta de formación de imágenes confocal y se centran a un plano z a través del centro de la célula.
4. Optimizar estenopeica (típicamente 1 unidad Airy), la potencia del láser, y el voltaje del tubo fotomultiplicador (ganancia) y el desplazamiento para cada canal. Guardar / registrar estos valores. Utilice la misma configuración de microscopio para obtener imágenes de todas las células marcadas para cualquier par objetivo determinado en la misma réplica.
   Nota: Este proceso dará lugar generalmente a photobleaching suficiente que esta célula no debe ser fotografiada para su análisis.

6. Imaging

1. El uso de un objetivo de gran aumento (por ejemplo, 100X), primero busque una célula para ser fotografiado usando epifluorescencia.
2. Cambie a la ruta de formación de imágenes confocal y se centran a un plano z a través del centro de la célula. YOf disponibles, el uso de software de zoom / cultivo para restringir el área de exploración de la célula de interés.
3. Captura de imágenes para cada canal marcado utilizando la configuración previamente establecidos. Repita los pasos 6.1 a 6.3 a la imagen 15 o más células por condición por réplica para garantizar una muestra suficiente.

7. Análisis Colocalización

1. Abra el par de imágenes (por ejemplo, "verde" y "rojo") de una célula en ImageJ. Usar las Imágenes> Color> Combinar Canales ... comando para generar una imagen RGB.
2. Dibuja una selección alrededor de la célula de interés. Utilice el ImageJ plugin "PSC Colocalización" ^(11; disponible en https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) para cuantificar colocalización de los objetivos en la celda seleccionada.
3. Registre la medida colocalización deseada (típicamente r de Pearson ^17). Repita los pasos 07.01 a 07.03 para cada celda fotografiado.

8. Normalización de datos

1. Calcular la media de los valores registrados de colocalización de las condiciones de control comunes de cada repetición de cada condición de etiquetado.
   Nota: Por ejemplo, la media de los valores de colocalización de las neuronas en el "vehículo de 48-hr, 60-min vehículo" condición de drogas en cada uno de 3 repeticiones independientes en cada uno de 3 condiciones de etiquetado (receptor y cada uno de los compartimentos 3).
2. Multiplicar los medios por (-1) para producir el desplazamiento de cada repetición en cada condición de etiquetado. Agregar el desplazamiento para cada replicar en cada condición de etiquetado para cada valor de colocalización en esa réplica.
   Nota: Esto normalizar los datos de tal manera que la medida colocalización media para la condición de control común es 0 en cada repetición de cada condición de etiquetado.
3. Agrupar los datos de todas las repeticiones de cada condición de etiquetado.
   Nota: Los cambios en la colocalización ahora se pueden analizar a través de repeticiones. Anal estadísticoanalysis dependerá del diseño experimental, pero se suelen implicar el análisis de varianza (ANOVA) seguido de pruebas apropiadas post-hoc (por ejemplo, Tukey). Para los recursos estadísticos, véase, por ejemplo, ^18.

Resultados

Usando esta técnica, es posible cuantificar los cambios en el tráfico de receptor post-internalización siguientes ambos tratamientos crónicos / prolongada y agudas de drogas. Después de los tratamientos farmacológicos, la fijación y el etiquetado, de alta resolución microfotografías de dos canales son capturados de cada célula de interés. Imágenes representativas pueden combinarse con colocalización de color falso para generar figuras ilustrativas (Figura 1). Colocalizational análisis subs...

Discusión

Hemos optimizado el protocolo para el análisis de cultivos primarios de neuronas adultas ganglionares de la raíz dorsal (neuronas sensoriales primarias). También se puede utilizar, con poca o ninguna modificación, para células cultivadas en monocapa chapado ampliamente. El análisis colocalizational también es posible en cortes de tejido y otros tales preparaciones ^11, sin embargo los componentes de tratamiento de drogas y la fijación del tejido / de preparación no sería apropiado.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503-500G
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888-500G
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	258148
Albumin from Bovine Serum	Sigma Aldrich	A7906-100G
Gelatin from cold water fish skin	Sigma Aldrich	G7041-100G
Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well	Fisher Scientific	720084
12 circle Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount	Polysciences	18606-20
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	S9638-500G
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	S9763-500G
Paraformaldehyde	Polysciences	00380-1
Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30
Rabbit anti-DOR antibody	MyBioSource	MBS316175	Used at 1:1,500
Mouse anti-Rab5 antibody	Sigma Aldrich	R7904	Used at 1:750
Mouse anti-Rab11 antibody	Millipore	05-853	Used at 1:500
Goat anti-LAMP1 antibody	Santa Cruz	SC8098	Used at 1:750
Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody	Life Technologies	A-21206	Used at 1:200 to 1:2,000
Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11005	Used at 1:200 to 1:2,000
Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11058	Used at 1:200 to 1:2,000