Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

Resumo

Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.

Resumo

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Introdução

Receptores, especialmente receptores acoplados a proteína G (GPCRs), são rotineiramente tráfico intracelularmente, de e para a superfície da célula ^1. Estes processos complexamente orquestradas e rigidamente controlados ditar complementos de receptores disponíveis das células e regulam a atividade do receptor temporais, a dessensibilização, e ressensibilização ^2-4. Mais importante, estes processos são sensíveis a ambientes celulares, incluindo a actividade do receptor induzida por drogas ou inactividade. Isto é, as acções de ligandos nos receptores podem alterar o tráfico intracelular desses receptores, alterando desse modo a capacidade de resposta celular. Desta forma, ligantes externos exercer ainda mais efeitos sobre a função das células, mesmo para além clássicos mensageiro-a-efetoras cascatas ^5,6.

Examinando tais mudanças no tráfico receptor induzida é difícil. Todas as técnicas disponíveis envolvem limitações. Ensaios de protecção de Biotina foram usadas para monitor receptores de superfície populações. Estes receptores são biotinilados e um curso temporal de imunoprecipi tacões é realizada para quantificar a redução em receptores biotinilados ao longo do tempo. Esta técnica essencialmente monitora a degradação progressiva de um inicial, marcado, a população de receptores ^7, e é muito útil na construção de campos de tempo deste processo. Infelizmente, este ensaio não é capaz de monitorar qualquer outro processo de degradação do conjunto inicial de receptores, tais como a internalização, reciclagem, ou novos receptores. Além disso, a adição de um anticorpo na gama de 150kDa para um receptor na gama de 50 kDa pode alterar o tráfico do receptor de ^8,9, e esta técnica podem ser difíceis de usar com receptores de baixa nível de expressão.

Outros procedimentos usar vários métodos para identificar compartimentos de tráfego intracelular (por exemplo, endosomes, etc.) e avaliar a sua co-localização com os receptores de interesse. Isto inclui os EUAe de sistemas heterólogos que expressam a proteína fluorescente-etiquetados construções quiméricas dos receptores e marcadores compartimento (GTPases por exemplo, Rab-familiares). Isso potencialmente permite o uso de imagens ao vivo de células, removendo questões relacionadas com a fixação e permeabilização. Enquanto poderosa, tal estratégia sofre das mesmas limitações dos sistemas heterólogos em geral: tag e nível de expressão de efeitos no tráfico de comportamento e incompatibilidade com tipos de células mais fisiologicamente representativos. Mais popularmente, corantes são utilizados para marcar facilmente compartimentos intracelulares (por exemplo, lisossomos, ostensivamente) ^10. Corantes, no entanto, pode faltar especificidade (todos os organelos acidicos, no caso de corantes para lisossomas) e não avaliam o tráfico através de outros compartimentos. Ainda assim, estas técnicas permitem um controle considerável sobre o sistema e as condições experimentais e podem beneficiar os métodos de análise de co-localização aqui apresentados, abaixo.

O método we presentes aqui refina o rastreamento do tráfico receptor por co-localização. Usando imunocitoquímica (ICC) para rotular os marcadores apropriados, é possível identificar os múltiplos compartimentos intracelulares distintos. Isto também permite a utilização de culturas de células primárias fisiologicamente relevantes no lugar de sistemas heterólogos. Este protocolo envolve ICC, que fixa as células de interesse antes da marcação; isso permite rotulagem em um ponto de tempo específico após o tratamento (s) droga. Isso produz um "instantâneo" das associações compartimentos receptor globais naquele ponto no tempo. Com vários momentos, um timecourse de alterações de tráfego também podem ser construídos.

Resumidamente, as células são tratadas com droga, marcado para o receptor e o compartimento intracelular de interesse, confocally fotografada, e as fotomicrografias são analisados ​​matematicamente para quantificar a co-localização do receptor e do compartimento ^11. No nosso uso, examinámos a co-localização de um receptor com Rab5, Rab11, e lisossomais-associado proteína de membrana 1 (LAMP1). Estes marcadores identificar endosomes cedo, endosomes reciclagem, e os lisossomos, respectivamente. Estas medidas co-localização atuar como proxies para os processos abrangentes de internalização, reciclagem e degradação ^12.

Tal como acontece com todas as técnicas, algumas limitações devem ser consideradas. Devido à necessidade de imagem cada neurónio individuais analisados, esta técnica pode tornar-se bastante trabalhoso, dependendo do número de condições e pontos de tempo envolvidos. Todos imunomarcação também devem lidar com os efeitos sobre a ultra-estrutura celular, localização de proteínas, e acessibilidade epitopo causados ​​pela fixação e permeabilização ^13.

Embora originalmente otimizado para uso com culturas primárias de neurônios sensoriais primários, este método é amplamente compatível com outros modelos de cultura banhado a monocamada.

O uso de um MEASUR quantificados matematicamentee de co-localização é, nomeadamente, muito mais metodologicamente rigorosas do que as técnicas anteriores utilizados para avaliar alterações de tráfego receptor, que muitas vezes dependiam de medidas vagos, subjetivos, como visualmente inspecionados sobreposições multi-canal ^14.

Esta técnica é particularmente útil devido à sua grande compatibilidade com in vivo intervenções (antes da geração de cultura primária), in vitro intervenções (durante o crescimento da cultura), e uma variedade de rotulagem como alvo ^15. Como tal, ele pode ser adaptado a muitas perguntas de investigação diferentes.

Protocolo

Nota: Este protocolo é amplamente compatível com vários modelos banhados a monocamada de células / tecidos cultura, os regimes de tratamento de drogas e metas em matéria de rotulagem. Assim, em utilização real, muitos parâmetros específicos variam de acordo com delineamento experimental. Aqui, as referências a esses parâmetros definidos pelo usuário são genéricos. Condições exemplo, como utilizado para obter os resultados representativos, são incluídas em itálico.

1. Soluções

1. Preparar o tampão de lavagem através da mistura de 0,1 M Tris-tamponada hipertónica (300 mM) Salino e 0,05% de polissorbato 20; pH 7,4 à temperatura ambiente.
2. Preparar um tampão de bloqueio. Para a 0,05 M Tris-tamponada hipertónica (300 mM) Salino adicionar 0,05% de Polissorbato 20, 3% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de gelatina de pele de peixe fria e ajustar o pH a 7,4 à temperatura ambiente.
3. Prepare diluente de anticorpo através da adição de 0,05% de Polissorbato 20, 1% de BSA, 0,1% de gelatina de pele de peixe fria a 0,05 M de Tris-tamponada hipertónica (300 mM) de solução salina e ajustar o pH para 7,4 a 4 ^o C.
   Nota: O pH de tampões Tris é dependente da temperatura. Isto é, uma mudança na temperatura irá alterar o pH da solução. Por razões de consistência, estes tampões de pH deve ser sempre ajustada à temperatura à qual eles vão ser utilizados.

2. Cultura celular

Nota: Os protocolos de cultura de células apropriadas irão variar com base no tipo (s) de células utilizado. Estes procedimentos devem ser otimizados separadamente. Metodologias de cultura de células detalhadas estão disponíveis, incluindo ^16. Um procedimento semelhante foi utilizado para obter os resultados representativos, com as diferenças notáveis:

1. Cultura neurônios do gânglio dorsal raiz de animais adultos como descrito ^12. Use meio de crescimento adulto-neurônio a cultura das células. Reduzir a densidade de células da glia por preplating, em vez de glutamato. Isso resulta em uma cultura neurónio-glia mista cultivadas em 12-lamelas de vidro redondas com, pelo menos, 30-60 neurónios por placa e que acompanham as células gliais cultivadas para approximately confluência de 40%. Deve notar-se que os neurónios em cultura primária não irá replicar e será empurrado para fora da placa por glia co-cultivadas se as células gliais são deixadas crescer excessivamente. A fim de evitar afectar os neurónios, redução física do número gliais é preferível a métodos farmacológicos químicas /.
   Nota: Para os fins do presente protocolo, assumimos que as células de interesse são cultivadas para sua experimentalmente desejado estado e banhado a monocamada. Nós achamos que plaqueamento em 12-redondas lamelas de vidro em placas de 24 poços para ser mais conveniente. Todos os volumes e os procedimentos descritos são apropriados para uma lamela em um poço de uma placa de 24 poços.

3. Drogas Tratamento das células em cultura

Nota: seqüencial múltipla, ou sobreposição, tratamentos medicamentosos são possíveis. As drogas, as doses / concentrações, e durações de exposição utilizado dependerá da experiência específica.

1. Remover o meio de crescimento original é ¹⁶ e substituí-la por meio contendo a droga (s) de interesse, na concentração escolhida (s). Neste caso, usar 10 | iM de morfina solubilizado em soro fisiológico ou solução salina como controlo usar.
   Nota: É importante que cada repetição independente (geralmente um único de 24 poços de cultura placa) contêm a mesma condição de controlo comum. Isto irá permitir a normalização dos dados através das repetições, que corrige a variabilidade inter-julgamento.
2. Incubam-se as células nas condições de crescimento original de ¹⁶ para 48 h.
3. Para tratamentos com medicamentos seguintes, repita os passos 3.1 e 3.2 com deltorfina 1 PM, SNC80 1 �, ou veículo e incubar durante 60 min ^12. Solubiliza-deltorfina II em água e solubilizar SNC80 a 10 mM em 40 uM HCl e sonicado, diluiu-se a 1 mM em água.
   Nota: Este protocolo assume a droga (s) foram solubilizados de tal modo que eles podem ser dissolvidos na concentração (ões) desejada no meio de crescimento escolhido. Procedimentos adequados paratais solubilização variará dependendo do fármaco em causa e deve ser optimizado separadamente.
4. Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem. Executar cada lavagem por aspiração suave do líquido a partir do poço, então, prontamente e suavemente, reenchendo o poço com solução fresca, como desejado (neste caso, com tampão de lavagem).

4. Fixação e Immunocytochemistry

Nota: Os objectivos específicos de rotulagem variam de acordo com experiência. Em nosso uso, nós marcado delta receptores opióides (DOR) e Rab5, Rab 11, e LAMP1, como discutido. Os anticorpos específicos utilizados dependerá da experiência específica. Condições óptimas de rotulagem são dependentes do anticorpo específico (s) utilizado. Uma discussão muito mais completa desse tópico é abaixo.

1. Fixar as células por imersão em ~ 300 ul de 4% de paraformaldeído em 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato durante 10 min a 37 ºC.
   Nota: É importante que o parágrafo 4%formaldeído ser preparada devido à autofluorescência causada pelo uso de paraformaldeído previamente congelados.
2. Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem, como descrito em 3.3.
3. Incubar as células em 300 ul de tampão de bloqueio durante 2 horas à TA.
4. Incubar as células com anticorpos primários em 300 ml de diluente de anticorpo para 48 horas a 4 ºC. Em nosso uso, os anticorpos primários contra DOR (coelho anti-dor) e um dos seguintes: Rab5 (mouse anti-Rab5), Rab 11 (mouse anti-Rab11), e LAMP1 (cabra anti-LAMP1).
5. Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem, como descrito em 3.3.
6. Incubam-se as células com anticorpos secundários conjugados com fluoróforos diferentes (ver discussão abaixo) em 300 ul de diluente de anticorpo durante 1 hora à TA. Neste, e todos os passos subsequentes, proteger as células da luz. Para obter os resultados representativos, use verde-emitting anti-coelho e eith fluoróforo conjugadoer um fluoróforo-conjugado anti-ratinho-emissor de vermelho ou vermelho-emitting fluoroforo conjugado de anti-cabra.
7. Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem, como descrito em 3.3.
8. Retirar as lamelas 12-redondas de placas de 24 poços, deixando ~ 1 ml de tampão de lavagem em cada poço, segurando a placa em ~ 45º, e alavancar a lamela do chão bem usando uma pinça fina. A lamela venha a assentar contra a parede do poço, de onde ele pode ser facilmente removido usando os fórceps.
9. Monte o lamelas, célula-side-down, em lâminas de microscópio com anti-desbotamento meio de montagem.

5. Configurações Microscópio

1. Usando um objetivo grande aumento (100X), primeiro localizar uma célula representante para ser fotografada usando epifluorescência.
2. Defina as configurações de captura de imagem para gravar 8 bits imagens TIFF não comprimidos de cada canal marcado (para detecção de cada fluoróforo utilizado, por exemplo, 488 nm e 594 nm), a imagem de cada canal em seqüência (ou por linha ou frame), ea média de 4 a 6 varreduras para a imagem final. Resolução de imagem ideal será específica do microscópio, mas 1024 x 1024 normalmente produz bons resultados.
3. Mudar para o caminho de imagem confocal e concentrar a um plano z através do centro da célula.
4. Otimizar pinhole (tipicamente uma unidade de Airy), potência de laser, e tensão de tubo fotomultiplicador (ganho) e deslocamento para cada canal. Salvar / gravar essas configurações. Use as mesmas configurações de microscópio para imagiologia todas as células marcadas para qualquer par alvo dada na mesma repetição.
   Nota: Este processo geralmente resultam em fotodegradação suficientes de que este celular não deve ser trabalhada para análise.

6. Criação de Imagens

1. Utilizando uma objectiva de ampliação elevada (por exemplo, 100x), primeiro localizar uma célula a ser trabalhada utilizando epifluorescência.
2. Mudar para o caminho de imagem confocal e concentrar a um plano z através do centro da célula. EUf disponível, zoom software uso / safra para restringir a área de digitalização para a célula de interesse.
3. Capturar imagens para cada canal marcado usando as configurações previamente estabelecido. Repita os passos 6.1 a 6.3 para a imagem 15 ou mais células por condição por repetição para assegurar uma amostra suficiente.

7. Análise de co-localização

1. Abra o par de imagens (por exemplo, 'verde' e 'vermelho') de uma célula em ImageJ. Use a Imagem> Cor> Mesclar Canais ... comando para gerar uma imagem RGB.
2. Desenhe uma seleção em torno da célula de interesse. Use o ImageJ plugin "PSC co-localização" ^(11; disponível a partir de https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) para quantificar as metas de co-localização na célula selecionada.
3. Grave a medida co-localização desejada (tipicamente r de Pearson ^17). Repita os passos de 7,1-7,3 para cada célula fotografada.

8. Normalização de dados

1. Calcula-se a média dos valores registados de colocalização as condições de controlo comuns de cada réplica de cada condição de rotulagem.
   Nota: Por exemplo, a média dos valores de co-localização de neurónios no "veículo de 48 horas, veículo de 60 min" condição da droga em cada uma das três repetições independentes em cada uma das três condições de rotulagem (receptor e cada um dos compartimentos 3).
2. Multiplicar os meios por (-1), para se obter o deslocamento para cada replicado em cada condição de rotulagem. Adicione o deslocamento para cada replicar em cada condição de rotulagem para cada valor de co-localização em que replicar.
   Nota: Isto irá normalizar os dados de tal forma que a medida co-localização média para a condição de controlo comum é 0 em cada repetição de cada condição de rotulagem.
3. Reúnem-se os dados de todas as repetições de cada condição de rotulagem.
   Nota: Alterações na co-localização podem agora ser analisado em repetições. Anal estatísticaysis dependerá de concepção experimental, mas tipicamente envolverá a análise de variância (ANOVA) seguido por testes post-hoc apropriados (por exemplo, teste de Tukey). Para obter recursos estatísticos, ver, por exemplo, ^18.

Resultados

Usando esta técnica, é possível quantificar mudanças no receptor tráfico de pós-interiorização seguintes ambos os tratamentos com drogas crônicas / prolongada e agudas. Após os tratamentos de drogas, fixação e rotulagem, de alta resolução microfotografias de dois canais são capturados de cada célula de interesse. Imagens representativas podem ser combinadas com co-localização de cores falsas para gerar figuras ilustrativas (Figura 1). Colocalizational análise subsequente, conforme des...

Discussão

Nós otimizamos este protocolo para a análise de culturas primárias de adultos neurônios do gânglio da raiz dorsal (neurônios sensoriais primários). Ele também pode ser usado, com pouca ou nenhuma modificação, para células de cultura em monocamada banhado a amplamente. A análise colocalizational também é possível em fatias de tecido e outras preparações ^11, no entanto os componentes de tratamento de droga e a fixação do tecido / de preparação não seria adequado.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503-500G
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888-500G
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	258148
Albumin from Bovine Serum	Sigma Aldrich	A7906-100G
Gelatin from cold water fish skin	Sigma Aldrich	G7041-100G
Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well	Fisher Scientific	720084
12 circle Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount	Polysciences	18606-20
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	S9638-500G
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	S9763-500G
Paraformaldehyde	Polysciences	00380-1
Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30
Rabbit anti-DOR antibody	MyBioSource	MBS316175	Used at 1:1,500
Mouse anti-Rab5 antibody	Sigma Aldrich	R7904	Used at 1:750
Mouse anti-Rab11 antibody	Millipore	05-853	Used at 1:500
Goat anti-LAMP1 antibody	Santa Cruz	SC8098	Used at 1:750
Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody	Life Technologies	A-21206	Used at 1:200 to 1:2,000
Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11005	Used at 1:200 to 1:2,000
Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11058	Used at 1:200 to 1:2,000