Suivi des modifications induites par la drogue dans des récepteurs post-internalisation traite par Analyse Colocalizational

Résumé

le trafic de signalisation et module récepteur cellulaire réactivité aux ligands et est, elle-même, répondant à des conditions cellulaires, y compris la signalisation induite par le ligand. Ici, nous décrivons une technique puissante et flexible pour évaluer quantitativement le trafic des récepteurs induite par le médicament en utilisant immunomarquage et analyse colocalizational.

Résumé

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Introduction

Les récepteurs, en particulier des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), sont couramment un trafic intracellulaire, et à partir de la surface de la cellule ^1. Ces processus de façon complexe orchestrées et étroitement contrôlées dictent disponibles compléments de récepteurs de cellules et régulent l'activité du récepteur temporelle, la désensibilisation, et resensibilisation ^2-4. Fait important, ces processus sont sensibles à des environnements cellulaires, y compris l'activité ou de l'inactivité récepteur induite par le médicament. Autrement dit, l'action des ligands au niveau des récepteurs peuvent modifier trafic intracellulaire de ces récepteurs, en modifiant ainsi la sensibilité des cellules. De cette manière, les ligands externes exercent encore plus d'effets sur la fonction de la cellule, au-delà même messager à effecteur cascades classiques ^5,6.

Examen de tels changements dans le trafic des récepteurs induite est difficile. Toutes les techniques disponibles comportent des limitations. des essais de protection de la biotine ont été utilisés pour moniTor récepteurs de surface populations. Ces récepteurs sont biotinylés et un timecourse des immunoprécipitations sont effectuées afin de quantifier la réduction des récepteurs biotinylés au fil du temps. Cette technique surveille essentiellement la dégradation progressive d'une première, étiqueté, population de récepteurs ^7, et est très utile dans la construction des cours à temps de ce processus. Malheureusement, cet essai est incapable de surveiller tout autre procédé que la dégradation de la piscine d'origine de récepteurs, tels que l'internalisation, le recyclage ou de nouveaux récepteurs. En outre, l'addition d'un anticorps dans la plage de 150 kDa à un récepteur dans la plage de 50 kDa peut modifier le trafic du récepteur ^8,9, et cette technique peut être difficile à utiliser avec des récepteurs de faible niveau de l'expression.

D'autres procédures utilisent diverses méthodes pour identifier les compartiments de trafic intracellulaire (par exemple, les endosomes, etc.) et d'évaluer leur colocalisation avec les récepteurs d'intérêt. Cela inclut la nouse des systèmes hétérologues exprimant la protéine fluorescente-étiqueté constructions chimériques des récepteurs et des marqueurs du compartiment (GTPases par exemple, Rab-famille). Cela permet potentiellement l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes, en supprimant les questions relatives à la fixation et perméabilisation. Bien que puissant, une telle stratégie souffre des mêmes limitations des systèmes hétérologues en général: tag et le niveau d'expression des effets sur la traite des comportements et incompatibilité avec les types de cellules physiologiquement plus représentatifs. Plus populairement, les colorants sont utilisés pour étiqueter facilement compartiments intracellulaires (par exemple, les lysosomes, ostensiblement) ^10. Colorants, cependant, peuvent manquer de spécificité (tous les organites acides dans le cas de colorants pour les lysosomes) et ne pas évaluer le trafic par d'autres compartiments. Pourtant, ces techniques permettent un contrôle considérable sur le système et les conditions expérimentales et peuvent bénéficier des méthodes d'analyse de colocalisation présentés ici, ci-dessous.

Procédé we présente ici affine le suivi du trafic des récepteurs par colocalisation. Utilisation immunocytochimie (ICC) pour étiqueter les marqueurs appropriés, il est possible d'identifier plusieurs compartiments intracellulaires distinctes. Ceci permet également l'utilisation de cultures de cellules primaires physiologiquement pertinentes en place des systèmes hétérologues. Ce protocole de la CPI consiste à fixer les cellules d'intérêt avant l'étiquetage; ce qui permet à un étiquetage spécifique timepoint après le traitement (s) de drogue. Cela produit un «instantané» des associations mondiales récepteur compartiments à ce point de temps. Avec de multiples points dans le temps, un timecourse des changements de trafic peut également être construit.

Brièvement, les cellules sont traités avec le médicament, pour le récepteur marqué et le compartiment intracellulaire d'intérêt, confocale imagé, et les microphotographies sont analysés pour quantifier mathématiquement colocalisation du récepteur ¹¹ et le compartiment. Dans notre utilisation, nous avons examiné la colocalisation d'un récepteur avec Rab5, Rab11 et lysosomales-associated membrane protein 1 (LAMP1). Ces marqueurs identifient les endosomes précoces, les endosomes de recyclage, et les lysosomes, respectivement. Ces mesures de colocalisation agissent comme des procurations pour les processus généraux de l'internalisation, le recyclage, et la dégradation ^12.

Comme avec toutes les techniques, certaines limites doivent être considérées. En raison de la nécessité d'image à chaque neurone individuel analysé, cette technique peut devenir assez de main-d'œuvre en fonction du nombre de conditions et de timepoints impliqués. Tous immunomarquage doit aussi composer avec les effets sur ultrastructure cellulaire, la localisation des protéines, et épitope accessibilité causés par la fixation et perméabilisation ^13.

Bien que l'origine optimisé pour une utilisation avec des cultures primaires de neurones sensoriels primaires, cette méthode est largement compatible avec d'autres modèles de culture monocouche plaqué.

L'utilisation d'un mesur mathématiquement quantifiése de la colocalisation est, notamment, beaucoup plus rigoureuse au plan méthodologique que les techniques utilisées précédemment pour évaluer les changements de trafic de récepteurs, qui ont souvent compté sur des mesures subjectives vagues tels que visuellement inspectés superpositions multi-canal ^14.

Cette technique est particulièrement utile pour sa large compatibilité avec les interventions in vivo (avant la génération de la culture primaire), interventions in vitro (pendant la croissance de la culture), et divers systèmes de marquage cible les ^15. En tant que tel, il peut être adapté à de nombreux sujets de recherche différents.

Protocole

Remarque: Ce protocole est largement compatible avec différents modèles monocouches plaqué cellules / tissus culture, les schémas de traitement de la toxicomanie, et les objectifs en matière d'étiquetage. Ainsi, en utilisation réelle, de nombreux paramètres spécifiques varient en fonction de la conception expérimentale. Ici, les références à ces paramètres définis par l'utilisateur sont génériques. conditions d'exemple, tel qu'il est utilisé pour obtenir les résultats représentatifs, sont inclus en italique.

1. Solutions

1. Préparer du tampon de lavage en mélangeant du tampon Tris 0,1 M hypertonique (300 mM) de solution saline et 0,05% de polysorbate 20; pH 7,4 à température ambiante.
2. Préparer un tampon de blocage. À 0,05 M Tris-Buffered hypertonique (300 mM) Saline ajouter 0,05% polysorbate 20, 3% de sérum albumine bovine (BSA) et 0,1% de gélatine de poisson froid de la peau et ajuster le pH à 7,4 à température ambiante.
3. Préparer le diluant d'anticorps en ajoutant 0,05% polysorbate 20, 1% de BSA, 0,1% poisson froid gélatine de peau à 0,05 M Tris-Buffered hypertonique (300 mM) Saline et ajuster le pH à 7,4 à 4 ^o C.
   Remarque: le pH du tampon Tris est dépendant de la température. Autrement dit, un changement de température va changer le pH de la solution. Par souci de cohérence, ces tampons doivent toujours être pH ajusté à la température à laquelle ils seront utilisés.

2. Culture cellulaire

Remarque: les protocoles de culture de cellules appropriées seront varier en fonction du type de cellule (s) utilisé. Ces procédures doivent être optimisés séparément. Détaillées des méthodes de culture cellulaire sont disponibles, y compris ^16. Une procédure similaire a été utilisée pour obtenir les résultats représentatifs, avec des différences notables:

1. Culture dorsales neurones des ganglions de la racine à partir d'animaux adultes comme décrit ^12. Utilisation du milieu de croissance des neurones adultes pour cultiver les cellules. Réduire la densité des cellules gliales par prédépôt, au lieu de glutamate. Il en résulte une culture de neurones-glie mixte cultivées sur des lamelles de verre rondes de 12 à au moins 30 à 60 par plaque neurones et les cellules gliales qui accompagnent passé à approximatEly 40% de confluence. Il convient de noter que les neurones dans une culture primaire ne reproduire et seront poussés hors de la plaque de cellules gliales par co-cultivées si la glie sont autorisés à croître de façon excessive. Afin d'éviter d'affecter les neurones, la réduction physique de nombres gliales est préférable de méthodes pharmacologiques chimiques /.
   Remarque: Pour les fins de ce protocole, nous supposons que les cellules d'intérêt sont cultivées à leur expérimentalement état souhaité et monocouche plaqué. Nous constatons que le placage sur des lamelles de verre de 12 rondes dans 24 plaques à puits pour être plus pratique. Tous les volumes et les procédures décrites sont appropriées pour une lamelle dans un puits d'une plaque à 24 puits.

3. traitement de la toxicomanie de cellules cultivées

Note: séquentielle multiple, ou se chevauchent, les traitements médicamenteux sont possibles. Les médicaments, les doses / concentrations et des durées d'exposition utilisée dépendra de l'expérience spécifique.

1. Supprimer le milieu de croissance d'origine ¹⁶ et de le remplacer par un milieu contenant le médicament (s) d'intérêt à la concentration choisie (s). Dans ce cas, utilisez 10 uM de morphine en solution dans une solution saline ou utiliser une solution saline comme témoin.
   Remarque: Il est important que chaque répétition indépendante (généralement un seul de culture de plaque de 24 puits) contient les mêmes conditions de contrôle commun. Cela permettra à la normalisation des données à travers les répétitions, qui corrige la variabilité inter-procès.
2. Incuber les cellules dans des conditions de croissance d'origine ¹⁶ pendant 48 heures.
3. Pour les traitements médicamenteux ultérieurs, répétez les étapes 3.1 et 3.2 avec deltorphine 1 uM, SNC80 1 uM, ou d'un véhicule et incuber pendant 60 min ^12. Deltorphine II solubiliser dans l'eau et solubiliser SNC80 à 10 mM dans du HCl à 40 uM et de traitement par ultrasons, on le dilue à 1 mM dans de l'eau.
   Remarque: Ce protocole prend le médicament (s) ont été solubilisés de telle sorte qu'ils peuvent être dissous à la concentration (s) souhaitée dans le milieu de culture choisi. Des procédures appropriées pourtel solubilisation varie en fonction de la drogue en question et doit être optimisé séparément.
4. Laver les cellules doucement, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage. Effectuez chaque lavage en aspirant doucement le liquide du puits, puis rapidement, et doucement, le remplissage du puits avec une solution fraîche, comme vous le souhaitez (dans ce cas avec un tampon de lavage).

4. Fixation et Immunocytochemistry

Remarque: Les objectifs en matière d'étiquetage spécifiques varieront par l'expérience. Dans notre utilisation, nous avons appelé les récepteurs opioïdes delta (DOR) et Rab5, Rab 11, et LAMP1, comme nous le verrons. Les anticorps spécifiques utilisés dépendront de l'expérience spécifique. Conditions d'étiquetage optimales dépendent de l'anticorps spécifique (s) utilisés. Une discussion beaucoup plus complète de ce thème est ci-dessous.

1. Fixer les cellules par immersion dans 300 ul ~ 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de solution saline tamponnée au phosphate pendant 10 min à 37 ° C.
   Remarque: il est important que le para 4%formaldéhyde être préparée en raison de l'auto-fluorescence résultant de l'utilisation de paraformaldéhyde préalablement congelé.
2. Laver les cellules avec douceur, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage, comme décrit dans 3.3.
3. Incuber les cellules dans 300 ul de tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante.
4. Incuber les cellules avec des anticorps primaires dans 300 ul de diluant d'anticorps pour 48 heures à 4 ºC. Dans notre utilisation, les anticorps primaires contre DOR (lapin anti-DOR) et l'un des: Rab5 (souris anti-Rab5), Rab 11 (souris anti-Rab11), et LAMP1 (chèvre anti-LAMP1).
5. Laver les cellules avec douceur, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage, comme décrit dans 3.3.
6. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires conjugués à des fluorophores différents (voir la discussion ci-dessous) dans 300 ul de diluant d'anticorps pendant 1 heure à température ambiante. En cela, et toutes les étapes ultérieures, protéger les cellules de la lumière. Pour obtenir les résultats représentatifs, utiliser émettant dans le vert fluorophore conjugué anti-lapin et either un fluorophore conjugué anti-souris émettant dans le rouge ou anti-chèvre conjugué à un fluorophore émettant dans le rouge.
7. Laver les cellules avec douceur, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage, comme décrit dans 3.3.
8. Retirez les lamelles de 12 rondes de plaques à 24 puits en laissant ~ 1 ml de tampon de lavage dans chaque puits, maintenant la plaque à ~ 45 °, et le levier de la lamelle hors du sol et à l'aide de pinces fines. La lamelle viendra en appui contre la paroi du puits, d'où il peut être facilement éliminé en utilisant la pince.
9. Montez le lamelles, cellulaire à l'envers, sur des lames de microscope avec anti-décoloration milieu de montage.

5. Paramètres de microscope

1. L'utilisation d'un objectif à fort grossissement (100X), d'abord localiser une cellule représentant à imager utilisant épifluorescence.
2. Configurez les paramètres de capture d'image pour enregistrer 8 bits non compressés images TIFF de chaque canal marqué (pour la détection de chaque fluorophore utilisé par exemple, 488 nm et 594 nm), à l'image de chaque séquence de canal (soit par ligne ou cadre), et de 4 à 6 scans moyenne pour l'image finale. Résolution d'image optimale sera spécifique au microscope, mais 1024 x 1024 donne généralement de bons résultats.
3. Basculer sur la voie d'imagerie confocale et de se concentrer à un plan z à travers le centre de la cellule.
4. Optimiser sténopé (typiquement 1 unité Airy), la puissance du laser, et la tension de tube photomultiplicateur (gain) et le décalage pour chaque canal. Enregistrer / enregistrer ces paramètres. Utilisez les mêmes réglages du microscope pour l'imagerie de toutes les cellules marquées pour toute paire de cible donnée dans le même répliquée.
   Remarque: Ce processus se traduira généralement en photoblanchiment suffisante que cette cellule ne doit pas être reproduite pour analyse.

6. Imaging

1. L'utilisation d'un objectif à fort grossissement (par exemple, 100X), localiser une première cellule à imager à l'aide épifluorescence.
2. Basculer sur la voie d'imagerie confocale et de se concentrer à un plan z à travers le centre de la cellule. JEf disponibles, zoom utiliser des logiciels / culture de restreindre la zone de numérisation de la cellule d'intérêt.
3. Capture d'images pour chaque canal marqué en utilisant les paramètres précédemment établis. Répétez les étapes 6.1 à 6.3 à l'image 15 ou plusieurs cellules par condition par répétition pour assurer un échantillon suffisant.

7. La colocalisation Analyse

1. Ouvrez la paire d'images (par exemple, «vert» et «rouge») d'une cellule dans ImageJ. Utiliser les images> Couleur> Fusionner les couches ... commande pour générer une image RVB.
2. Tracez une sélection autour de la cellule d'intérêt. Utilisez le ImageJ plugin "CFP colocalisation" ^(11; disponible à partir https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) pour quantifier colocalisation des cibles dans la cellule sélectionnée.
3. Notez la mesure de colocalisation souhaitée (typiquement r de Pearson ^17). Répétez les étapes 7.1 à 7.3 pour chaque cellule imagé.

8. Normalisation des données

1. Calculer la moyenne des valeurs de colocalisation enregistrées des conditions de contrôle communs de chaque répétition de chaque condition d'étiquetage.
   Remarque: Par exemple, la moyenne des valeurs de colocalisation des neurones dans le "véhicule de 48 h, 60 min véhicule" condition de médicament dans chacune des trois répétitions indépendants dans chacune des trois conditions d'étiquetage (récepteur et chacun des trois compartiments).
2. Multiplier les moyens par (-1) pour donner le décalage pour chaque répétition dans chaque état de l'étiquetage. Ajoutez le décalage pour chaque répétition dans chaque état de l'étiquetage à chaque valeur de colocalisation dans cette répétition.
   Note: Ceci normaliser les données telles que la mesure de colocalisation moyen pour la condition de contrôle commun est 0 dans chaque répétition de chaque condition d'étiquetage.
3. Mutualiser les données de toutes les répétitions de chaque condition d'étiquetage.
   Remarque: Les changements dans colocalisation peuvent maintenant être analysées à travers les répétitions. Anal statistiqueana- dépendra conception expérimentale, mais implique généralement une analyse de variance (Anova) suivie par des tests appropriés post-hoc (par exemple, Tukey). Pour les ressources statistiques, voir, par exemple, ^18.

Résultats

En utilisant cette technique, il est possible de quantifier les changements dans le récepteur post-internalisation trafic suivantes deux traitements médicamenteux chroniques / prolongée et aiguës. Après les traitements médicamenteux, la fixation et l'étiquetage, à haute résolution photomicrographies deux canaux sont capturés de chaque cellule d'intérêt. Des images représentatives peuvent être combinés avec fausse couleur colocalisation pour générer des chiffres d'illustration (Figure...

Discussion

Nous avons optimisé ce protocole pour l'analyse des cultures primaires de neurones de ganglions de la racine dorsale adultes (neurones sensoriels primaires). Il peut également être utilisé, avec peu ou pas de modification, par des cellules en culture monocouche plaqué au sens large. L'analyse colocalizational est également possible dans des tranches de tissu et d'autres telles préparations ^11, mais les composants de traitement de la toxicomanie et de la fixation des tissus / préparation ne...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503-500G
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888-500G
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	258148
Albumin from Bovine Serum	Sigma Aldrich	A7906-100G
Gelatin from cold water fish skin	Sigma Aldrich	G7041-100G
Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well	Fisher Scientific	720084
12 circle Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount	Polysciences	18606-20
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	S9638-500G
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	S9763-500G
Paraformaldehyde	Polysciences	00380-1
Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30
Rabbit anti-DOR antibody	MyBioSource	MBS316175	Used at 1:1,500
Mouse anti-Rab5 antibody	Sigma Aldrich	R7904	Used at 1:750
Mouse anti-Rab11 antibody	Millipore	05-853	Used at 1:500
Goat anti-LAMP1 antibody	Santa Cruz	SC8098	Used at 1:750
Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody	Life Technologies	A-21206	Used at 1:200 to 1:2,000
Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11005	Used at 1:200 to 1:2,000
Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11058	Used at 1:200 to 1:2,000