Отслеживание наркотиков изменений, вызванных в рецептора после интернализации торговле от анализа Colocalizational

Резюме

Торговля рецепторов модулирует сигнализации и клеток реагировать с лигандами и, непосредственно, в ответ на условиях клеток, включая лиганд-индуцированной сигнализации. Здесь мы описываем мощный и гибкий метод для количественного оценки оборота рецептора медикаментозного используя иммунноокрашивания и colocalizational анализ.

Аннотация

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Введение

Рецепторы, особенно G-белком рецепторов (GPCR,), которые обычно продают внутриклеточно, и из клеточной поверхности ^1. Эти сложно оркестровые и плотно контролируемые процессы диктуют доступные дополнения рецепторов клеток и регулировать рецептор временную активность, десенсибилизация и сенсибилизация ^{2 - 4.} Важно отметить, что эти процессы реагируют на клеточных средах, включая активность рецепторов медикаментозного или бездействия. То есть, действия лигандов рецепторов в можете изменить внутриклеточный оборотом этих рецепторов, тем самым изменяя клеток реагировать. Таким образом, внешние лиганды оказывают еще больше эффектов на функции клеток, даже за пределами классической посланник-к-эффектора каскадов ^5,6.

Рассматривая такие изменения в индуцированной торговли рецептора трудно. Все доступные методы включают ограничения. Анализы защиты Биотин были использованы для mõniTor поверхностных рецепторов населения. Эти рецепторы биотинилированный и timecourse из иммунопреципитации выполняется для количественного определения снижения биотинилированных рецепторов с течением времени. Эта методика по существу контролирует постепенной деградации начального, снабжены населения рецепторов ^7, и это очень полезно при построении временное изменение этого процесса. К сожалению, этот анализ не может контролировать любой процесс, кроме деградации исходного пула рецепторов, таких как интернализации, рециркуляции или новых рецепторов. Кроме того, добавление антител в диапазоне 150kDa с рецептором в диапазоне 50kDa может изменить оборота рецептора ^8,9, и этот метод может быть трудно использовать с низкими рецепторов уровня выражений.

Другие процедуры используют различные методы, чтобы определить внутриклеточные отсеки с торговлей людьми (например, Эндосомы, и т.д.) и оценить их колокализацию с рецепторами интерес. Это включает в себя СШАе гетерологичных системах, выражающих флуоресцентный белок-меченых химерных конструктов рецепторов и купейных маркеров (например, Раб-семейные GTPases). Это потенциально позволяет использовать визуализации живых клеток, удаляя вопросы, связанные с фиксацией и проницаемости. В то время как мощный, такая стратегия страдает от тех же ограничений гетерологичных систем в целом: TAG и уровень экспрессии эффектов на поведение и торговлей несовместимость с более физиологически представительных типов клеток. Более широко, красители используются для обозначения легко внутриклеточные отсеки (например, лизосомы, якобы) ^10. Красители, однако, может не хватать специфичность (все кислые органелл случае красителей для лизосом) и не оценивают с торговлей через другие отсеки. Тем не менее, эти методы позволяют значительный контроль над системой и экспериментальных условиях и может извлечь выгоду из методов анализа колокализация представленных здесь ниже.

Метод же здесь присутствует уточняет отслеживание оборота рецепторов в колокализации. Использование иммуноцитохимии (МУС), чтобы маркировать соответствующие маркеры, можно определить несколько различных внутриклеточных отсеков. Это также позволяет использовать физиологически соответствующих первичных клеточных культур вместо гетерологичных системах. Этот протокол включает в себя МТП фиксации клеток процентов до маркировки; это позволяет маркировку на определенной временной точке после лечения (ов) лекарственного средства. Это производит «снимок» глобальной ассоциации рецептор-купе в то временной точке. С несколькими моменты времени, timecourse изменений с торговлей людьми также может быть построен.

Вкратце, клетки, обработанных лекарством, помечены для рецептора и внутриклеточное пространство интерес, конфокально отображаемого, и микрофотографии проанализированы математически количественно колокализацию рецептора и отсека ^11. В нашем использования, мы рассмотрели колокализацию рецептора с Раb5, Rab11 и Лизосомные связанный мембранный белок 1 (LAMP1). Эти маркеры выявления ранних эндосом, эндосомы переработка и лизосом, соответственно. Эти меры колокализационные действовать в качестве прокси для всеобъемлющих процессов интернационализации, утилизации и деградации ^12.

Как и со всеми методами, некоторые ограничения должны быть рассмотрены. В связи с необходимостью к изображению каждый отдельный нейрон анализируемого, эта методика может стать весьма трудоемким в зависимости от ряда условий и временных точках, участвующих. Все иммуномечение также должны бороться с последствиями на клеточном ультраструктуры, локализации белка и эпитопной доступности, вызванных фиксацией и проницаемости ^13.

Хотя первоначально оптимизирован для использования с первичных культурах первичных сенсорных нейронов, этот метод широко совместимы с другими моделями монослойной культуры покрытием.

Использование математически количественно изме колокализации является, в частности,, гораздо более методологически строгими, чем предыдущие методы, используемые для оценки изменений с торговлей людьми рецепторов, которые часто полагались на смутных субъективных мер, таких, как визуально-контролируемых многоканальных наложений ^14.

Этот метод особенно полезен для его широкой совместимостью с естественных вмешательств (до первичного поколения культуры) в интервенции в пробирке (во время роста культуры), а также различные маркировки цели ^15. Как таковой, он может быть адаптирован к различным исследовательских вопросов.

протокол

Примечание: Этот протокол является широко совместимы с различными моделями монослойных покрытием клеток / тканевых культур, схемы лечения наркозависимости, и маркировки целей. Таким образом, в реальных условиях эксплуатации, многие конкретные параметры зависят от экспериментального проектирования. Вот ссылки на эти пользовательских параметров являются общими. Пример условия, а используются для получения репрезентативных результатов, которые выделены курсивом.

1. Решения

1. Приготовьте промывочный буфер путем смешивания 0,1 М Трис-буферном гипертонической (300 мм) физиологического раствора и 0,05% полисорбат 20; рН 7,4 при комнатной температуре.
2. Подготовка блокирующего буфера. Для 0,05 М Трис-буфером гипертонической (300 мм) Солевой добавить 0,05% полисорбат 20, 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% холодной рыбьего желатина кожи и доведения рН до 7,4 при комнатной температуре.
3. Подготовка антител в качестве разбавител добавлением 0,05% полисорбат 20, 1% БСА, 0,1% холодной рыбьего желатина кожи до 0,05 М Трис-буфером гипертонической (300 мм) физиологического раствора и довести рН до 7,4 при 4 ^о С.
   Примечание: рН буфера трис зависит от температуры. То есть, изменение температуры будет изменить рН раствора. Для согласованности, эти буферы всегда должны быть отрегулированным рН при температуре, при которой они будут использоваться.

2. Культура клеток

Примечание: Соответствующие протоколы клеточной культуры будет варьироваться в зависимости от типа (ов), используемого клеток. Эти процедуры должны быть отдельно оптимизирован. Подробные методики культивирования клеток легко доступны, в том числе ^{16 лет.} Аналогичная процедура была использована для получения репрезентативных результатов, с заметные различия:

1. Культура, спинных нейронов из взрослых животных, как описано ^12. Используйте для взрослых нейронов среду роста культуры клеток. Уменьшение плотности клеток глии от перед металлизацией, чем глутамат. Это приводит к смешанной нейрон-глиальных культуры, выращенной на покровные стекла 12-круглых по крайней мере 30-60 нейронов на чашку и сопровождающих глиальных клеток выращивали до approximatЭли 40% слияния. Следует отметить, что нейроны в первичной культуре не будет копировать и будет выталкиваться от пластины с помощью совместно культивировали глии, если глии могут расти слишком. Для того чтобы избежать воздействия на нейроны, физическое уменьшение числа глиальных предпочтительнее химических / фармакологических методов.
   Примечание: Для целей настоящего Протокола, мы предполагаем, что клетки интерес вырос до их экспериментально-желаемое состояние и монослой покрытием. Мы считаем, что покрытие на стеклянных покровных 12-тур в 24-луночных планшетах наиболее удобным. Все объемы и процедуры, описанные являются подходящими для одного покровное в одну лунку 24-луночного планшета.

3. наркологическая культивируемых клеток

Примечание: Несколько последовательный или перекрытие, медикаментозное лечение возможно. Препаратов, дозы / концентрации и продолжительности воздействия используемых будет зависеть от конкретного эксперимента.

1. Удалить оригинальный среду роста ¹⁶ и заменить его среде, содержащей препарат (ы) интерес при выбранной концентрации (ов). В этом случае используют 10 мкМ морфина растворяют в физиологическом растворе или физиологическом растворе используют в качестве контроля.
   Примечание: Важно, чтобы каждый независимый повторной (как правило, одна культура 24-луночный планшет) содержат одинаковое общее условие управления. Это позволит нормализации данных через повторов, которая исправляет для взаимного суда изменчивости.
2. Инкубируйте клетки в первоначально условиях роста ¹⁶ в течение 48 часов.
3. Для последующих процедур наркотиков, повторите шаги 3.1 и 3.2 с дельторфина 1 мкМ, SNC80 1 мкм, или транспортное средство и инкубировать в течение 60 мин ^12. Солюбилизации дельторфина II в воде и солюбилизации SNC80 в 10 мМ в 40 мкм HCl и разрушать ультразвуком, разбавленного до 1 мМ в воде.
   Примечание: Этот протокол предполагает препарат (ы) были солюбилизированного таким образом, что они могут быть растворены в нужной концентрации (ы) в выбранной среде роста. Соответствующие процедуры длянапример солюбилизации может изменяться в зависимости от препарата в вопросе и должен быть отдельно оптимизирован.
4. Промыть клетки осторожно, три раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку. Выполнение каждой промывки осторожно аспирации жидкости из скважины, затем быстро и аккуратно, заправки и свежим раствором, по желанию (в данном случае с промывочным буфером).

4. Фиксация и Иммуноцитохимия

Примечание: Конкретные цели маркировки будет зависеть от эксперимента. В нашем использования, мы пометили дельта опиоидные рецепторы (DOR) и Rab5, Раб 11, и LAMP1, как описано. Специфические антитела использовали будет зависеть от конкретного эксперимента. Оптимальные условия маркировки зависит от конкретного антитела (страны), используемые. Гораздо полнее обсуждение этой темы находится ниже.

1. Фиксации клеток путем погружения в ~ 300 мкл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатно-буферном солевом растворе в течение 10 мин при 37 ° С.
   Примечание: Важно, чтобы 4% параформальдегида быть свежеприготовленным из-за флуоресценции, вызванного использованием ранее замороженных параформальдегида.
2. Промыть клетки осторожно, 3 раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку, как описано в разделе 3.3.
3. Инкубируйте клетки в 300 мкл блокирующего буфера в течение 2 ч при комнатной температуре.
4. Инкубируйте клетки с первичными антителами в 300 мкл антител разбавителем в течение 48 ч при температуре 4 ° С. В нашем использования, первичные антитела против ДОР (кролик анти-Дор) и один из: Rab5 (мышиное анти-Rab5), Раб 11 (мышь анти-Rab11), и ЛАМПА1 (козий анти-ЛАМПА1).
5. Промыть клетки осторожно, три раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку, как описано в разделе 3.3.
6. Инкубируйте клетки с вторичными антителами, конъюгированными с различными флуорофоров (см обсуждение ниже) в 300 мкл антител разбавителем в течение 1 часа при комнатной температуре. В этом и всех последующих шагов, защищают клетки от действия света. Для получения репрезентативных результатов, используйте зеленый излучающих флуорофора-сопряженных анти-кролик и eithэр красно-излучающих флуорофора-сопряженных анти-мыши или красно-излучающих флуорофора-сопряженных анти-козел.
7. Промыть клетки осторожно, 3 раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку, как описано в разделе 3.3.
8. Удалить 12-раундовом покровные из 24-луночных планшетах, оставив ~ 1 мл промывочного буфера в каждую лунку, планшет на ~ 45º, а рычаг покровное прочь также полу с помощью тонких щипцов. Покровное будет упираться в стену скважины, откуда легко можно удалить с помощью пинцета.
9. Установите покровные, сотовый стороной вниз, на микроскопа слайды с анти-выцветания монтажную среду.

5. Микроскоп Настройки

1. Использование высокого увеличения объектива (100X), сначала найдите на представительный ячейку быть отображены с помощью эпифлуоресцентной.
2. Настройте параметры съемки изображения для записи 8-разрядных несжатых TIFF изображения каждой надписью канала (для обнаружения каждого флуорофора, используемого, например, 488 нм, и 594 нм), к изображению каждый канал последовательно (либо строки или кадра), и в среднем от 4 до 6 сканов для конечного изображения. Оптимальное разрешение изображения будет микроскоп конкретных, но 1024 x 1024, как правило, дает хорошие результаты.
3. Переключение на пути конфокальной микроскопии и фокус в плоскости г через центр клетки.
4. Оптимизация микроотверстий (обычно 1 блок Эри), мощность лазера, и фотоэлектронный умножитель напряжения (коэффициент усиления) и смещения для каждого канала. Сохранение / запись этих параметров. Используйте те же настройки микроскопа для визуализации всех клеток меченых для любой целевой пары в то же репликации.
   Примечание: Этот процесс, как правило, привести к достаточно фотовыцветания, что эта клетка не должна быть отображены для анализа.

6. изображений

1. Использование высокого увеличения цели (например, 100X), сначала найдите ячейку, чтобы быть отображены с помощью эпифлуоресцентной.
2. Переключение на пути конфокальной микроскопии и фокус в плоскости г через центр клетки. Яе доступно, использование программного обеспечения зум / культура ограничить область сканирования в ячейки интерес.
3. Захват изображения для каждого канала с надписью, используя настройки ранее установленных. Повторите шаги 6.1 до 6.3 до изображения 15 или более клеток в состоянии за репликации для обеспечения достаточного образца.

7. Анализ колокализации

1. Откройте пару изображений (например, "зеленый" и "красный") из ячейки в ImageJ. Используйте изображение> Цвет> Объединить каналы ... Команда для создания RGB изображение.
2. Нарисуйте выделение вокруг клетки интерес. Используйте ImageJ плагин "PSC колокализации" ^(11; доступный от https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) количественно колокализации целей в выбранной ячейке.
3. Запишите нужную колокализации меру (как правило, г Пирсона ^17). Повторите этапы от 7,1 до 7,3 для каждого отображаемого клетки.

8. Нормализация данных

1. Рассчитайте среднее записанных значений колокализации общих условиях управления каждой репликации каждого состояния маркировки.
   Примечание: Например, среднее из значений колокализации нейронов в "48-часовой автомобиля, 60-мин транспортное средство" состояние лекарственного средства в каждой из 3-х независимых повторностей в каждой из 3-х условиях маркировка (рецептор, и каждый из 3-х отсеков).
2. Умножение средства от (-1), чтобы получить смещение для каждого репликации в каждом условии маркировки. Добавить смещение для каждого повторить в каждом маркировки состоянии каждому значению колокализации в этой репликации.
   Примечание: Это нормализовать данные так, чтобы среднее колокализация мерой общего состояния управления равно 0 в каждой повторности каждого условия маркировки.
3. Бассейн данные из всех повторов каждого условия маркировки.
   Примечание: Изменения в колокализации теперь могут быть проанализированы по повторах. Статистические анальныйлиз будет зависеть от экспериментального дизайна, но, как правило, связаны анализ-дисперсионного (ANOVA) с последующим соответствующих испытаний после специальных (например, Тьюки). Для статистических ресурсов, смотри, например, ^18.

Результаты

Используя эту технику, можно количественно изменения в рецептора торговли после интернализации следующие обе хронические / длительная и острых медикаментозное лечение. После медикаментозного лечения, фиксации и маркировки, с высоким разрешением двухканальные микрофотографии захва?...

Обсуждение

Мы оптимизировали этот протокол для анализа первичных культурах взрослых заднекорешковых ганглиев (первичные сенсорные нейроны). Она также может быть использован, практически без изменений, за монослойных покрытием широко культивируемых клеток. Colocalizational анализ можно также в срезах ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503-500G
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888-500G
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	258148
Albumin from Bovine Serum	Sigma Aldrich	A7906-100G
Gelatin from cold water fish skin	Sigma Aldrich	G7041-100G
Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well	Fisher Scientific	720084
12 circle Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount	Polysciences	18606-20
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	S9638-500G
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	S9763-500G
Paraformaldehyde	Polysciences	00380-1
Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30
Rabbit anti-DOR antibody	MyBioSource	MBS316175	Used at 1:1,500
Mouse anti-Rab5 antibody	Sigma Aldrich	R7904	Used at 1:750
Mouse anti-Rab11 antibody	Millipore	05-853	Used at 1:500
Goat anti-LAMP1 antibody	Santa Cruz	SC8098	Used at 1:750
Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody	Life Technologies	A-21206	Used at 1:200 to 1:2,000
Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11005	Used at 1:200 to 1:2,000
Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11058	Used at 1:200 to 1:2,000