Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational

Riepilogo

Traffico Receptor modula la segnalazione e la cellula di risposta ai ligandi ed è, a sua volta, sensibile alle condizioni di cellulari, tra cui la segnalazione ligando-indotta. Qui, descriviamo una tecnica potente e flessibile per la valutazione quantitativa farmaco-indotta traffico recettoriale utilizzando immunomarcatura e analisi colocalizational.

Abstract

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Introduzione

Recettori, soprattutto G recettori accoppiati alle proteine ​​(GPCR), sono regolarmente vittime della tratta intracellulare, da e verso la superficie cellulare ^1. Questi processi complessa orchestrati e strettamente controllate dettano complementi recettori disponibili cellule 'e regolano l'attività del recettore temporali, la desensibilizzazione, e risensibilizzazione ^2-4. È importante sottolineare che questi processi sono sensibili agli ambienti cellulari tra cui l'attività del recettore indotta da farmaci o di inattività. Cioè, le azioni di ligandi dei recettori possono alterare traffico intracellulare di tali recettori, alterando così la risposta delle cellule. In questo modo, leganti esterni esercitano ancora più effetti sulla funzione delle cellule, anche al di là classiche cascate ^5,6 messenger-to-effettori.

Esaminando tali cambiamenti nel traffico recettoriale indotta è difficile. Tutte le tecniche disponibili prevedono limitazioni. Saggi di protezione biotina sono stati utilizzati per monitor recettori superficiali popolazioni. Questi recettori sono biotinilati e timecourse di immunoprecipitazione viene eseguita per quantificare la riduzione recettori biotinilati nel tempo. Questa tecnica controlla essenzialmente la progressiva degradazione di una iniziale, etichettati, popolazione di recettori ^7, ed è molto utile nella costruzione andamenti temporali di questo processo. Purtroppo, questo test è in grado di monitorare qualsiasi processo diverso degradazione del pool originale di recettori quali internalizzazione, il riciclaggio, o nuovi recettori. Inoltre, l'aggiunta di un anticorpo nell'intervallo 150kDa ad un recettore nell'intervallo 50kDa può alterare il traffico del recettore ^8,9, e questa tecnica può essere difficile da usare con recettori basso livello di espressione.

Altre procedure utilizzano vari metodi per identificare intracellulari comparti di traffico (ad esempio, endosomi, etc.) e valutare la loro colocalizzazione con i recettori di interesse. Questo include l'use dei sistemi eterologhi esprimono fluorescente proteina-tagged costrutti chimerici dei recettori e marcatori vano (GTPasi esempio, Rab-familiari). Ciò consente potenzialmente l'uso di live-cell imaging, eliminando le questioni relative alla fissazione e permeabilizzazione. Mentre potente, tale strategia soffre delle stesse limitazioni dei sistemi eterologhi in generale: effetti della modifica e del livello di espressione sul traffico di comportamento e di incompatibilità con tipi di cellule più rappresentativi fisiologicamente. Più comunemente, i coloranti vengono usati per etichettare facilmente compartimenti intracellulari (ad esempio, lisosomi, apparentemente) ^10. Coloranti, tuttavia, possono mancare di specificità (tutti organuli acidi nel caso dei coloranti per lisosomi) e non valutare il traffico attraverso altri comparti. Tuttavia, queste tecniche consentono un notevole controllo sul sistema e le condizioni sperimentali e possono beneficiare di metodi di analisi colocalization presentati qui di seguito.

Il metodo we presente qui raffina il monitoraggio del traffico dei recettori per colocalizzazione. Utilizzando immunocitochimica (ICC) per etichettare marcatori appropriati, è possibile identificare più compartimenti intracellulari distinti. Questo consente anche l'uso di fisiologicamente rilevanti colture cellulari primarie in luogo dei sistemi eterologhi. Questo protocollo ICC prevede che fissa i cellule di interesse prima di etichettatura; questo permette etichettatura a timepoint specifica seguente trattamento farmacologico (s). Questo produce un 'istantanea' di associazioni recettore scomparti globali in quel timepoint. Con diversi momenti, una timecourse di cambiamenti di traffico può essere costruito.

In breve, le cellule sono trattati con farmaci, etichettati per il recettore e compartimento intracellulare di interesse, confocally ripreso, e le fotomicrografie vengono analizzati per quantificare matematicamente colocalizzazione del recettore e vano ^11. Nel nostro uso, abbiamo esaminato la colocalizzazione di un recettore con Rab5, Rab11, e-lisosomiale associata proteine ​​di membrana 1 (LAMP1). Questi marcatori identificano endosomi precoci, endosomi riciclaggio, e lisosomi, rispettivamente. Queste misure colocalizzazione agiscono come proxy per i processi generali della internalizzazione, riciclaggio, e il degrado ^12.

Come con tutte le tecniche, devono essere considerate alcune limitazioni. A causa della necessità di immagine ogni singolo neurone analizzato, questa tecnica può diventare molto laborioso a seconda del numero di condizioni e timepoints coinvolti. Tutti immunomarcatura deve inoltre vedersela con gli effetti sulla ultrastruttura cellulare, la localizzazione delle proteine, e l'accessibilità epitopo causati dalla fissazione e permeabilizzazione ^13.

Anche se inizialmente ottimizzato per l'uso con colture primarie di neuroni sensoriali primarie, questo metodo è ampiamente compatibile con altri modelli di coltura monostrato placcato.

L'uso di un measur matematicamente quantificatoe di colocalizzazione è, in particolare, molto più metodologicamente rigorosa rispetto alle tecniche precedenti utilizzati per valutare i cambiamenti del traffico dei recettori, che hanno spesso invocato, misure soggettive vaghi come visivamente ispezionati sovrapposizioni multicanale ^14.

Questa tecnica è particolarmente utile per la sua ampia compatibilità con interventi in vivo (prima generazione coltura primaria), interventi in vitro (durante la crescita coltura), e vari etichettatura obiettivi ^15. Come tale, può essere adattata a molte domande di ricerca differenti.

Protocollo

Nota: Questo protocollo è ampiamente compatibile con vari modelli monostrato placcato cellule / tessuti cultura, i regimi di trattamento di droga, e gli obiettivi in ​​materia di etichettatura. Così in uso, molti parametri specifici variano in base al design sperimentale. Qui, i riferimenti a questi parametri definiti dall'utente sono generici. Esempio condizioni, usati per ottenere i risultati rappresentativi, sono riportate in corsivo.

1. Soluzioni

1. Preparare tampone di lavaggio mescolando 0.1M Tris-Buffered ipertonica (300 mm) Saline e 0,05% polisorbato 20; pH 7.4 a RT.
2. Preparare tampone di bloccaggio. Per 0,05 M Tris-Buffered ipertonica (300 mm) Saline aggiungere 0,05% polisorbato 20, 3% albumina sierica bovina (BSA) e 0,1% pesce freddo pelle gelatina e regolare il pH a 7,4 a temperatura ambiente.
3. Preparare diluente aggiungendo 0,05% polisorbato 20, 1% di BSA, 0,1% pesce freddo pelle gelatina di 0,05 M Tris-Buffered ipertonica (300 mm) Saline e regolare il pH a 7,4 a ^{4 °} C.
   Nota: Il pH del buffer Tris è dipendente dalla temperatura. Cioè, un cambiamento di temperatura cambierà il pH della soluzione. Per coerenza, questi buffer devono essere sempre pH regolato alla temperatura alla quale saranno utilizzati.

Culture 2. Cella

Nota: i protocolli di colture cellulari adeguate variano in base al tipo di cellule (s) utilizzato. Tali procedure devono essere ottimizzate separatamente. Dettagliate metodologie di coltura cellulare sono facilmente disponibili, di cui ^16. Una procedura simile è stato utilizzato per ottenere i risultati rappresentativi, con le notevoli differenze:

1. Cultura gangli spinali neuroni di animali adulti come descritto ^12. Utilizzare crescita media degli adulti-neurone a coltura le cellule. Ridurre la densità delle cellule gliali da preplating, piuttosto che il glutammato. Ciò si traduce in una cultura neurone gliali mista coltivate su 12-rotonde coprioggetto di vetro con almeno 30-60 per piastra neuroni e cellule gliali accompagnamento diventato approximately 40% di confluenza. Va osservato che i neuroni in coltura primaria non replicare e sarà spinto fuori della piastra da glia co-coltura se la glia possono crescere eccessivamente. Per evitare di compromettere i neuroni, la riduzione fisica dei numeri gliali è preferibile metodi farmacologici chimici /.
   Nota: Ai fini del presente protocollo, si assume che le cellule di interesse sono coltivate a loro sperimentalmente desiderato Stato e monostrato placcato. Troviamo che placcatura su 12 per tutto l'coprioggetto di vetro in 24 pozzetti per essere più conveniente. Tutti i volumi e le procedure descritte sono adatte per un vetrino in un pozzetto di una piastra ben 24.

3. Il trattamento con farmaci delle cellule in coltura

Nota: Multiple sequenziale, o sovrapposte, trattamenti farmacologici sono possibili. I farmaci, le dosi / concentrazioni e durate di esposizione utilizzata dipenderà l'esperimento specifica.

1. Rimuovere il mezzo di crescita originale ¹⁶ e sostituirlo con medium contenente il farmaco (s) di interesse alla concentrazione (s) prescelto. In questo caso, utilizzare 10 pM di Morphine solubilizzati in soluzione fisiologica salina oppure usa come controllo.
   Nota: È importante che ciascun replicato indipendente (generalmente una singola coltura in piastra a 24 pozzetti) contengono la stessa condizione di controllo comune. Questo permetterà la normalizzazione dei dati attraverso repliche, che corregge la variabilità inter-trial.
2. Incubare le cellule in condizioni di crescita originarie ¹⁶ per 48 ore.
3. Per trattamenti farmacologici successivi, ripetere i punti 3.1 e 3.2 con deltorfina 1 micron, SNC80 1 micron, o il veicolo e incubare per 60 minuti ^12. Solubilizzare deltorfina II in acqua e solubilizzare SNC80 a 10 mM in 40 mM HCl e ultrasuoni, diluito a 1 mM in acqua.
   Nota: Questo protocollo assume il farmaco (s) sono stati solubilizzati in modo che essi possono essere sciolti alla concentrazione (s) desiderata nel mezzo di crescita prescelto. Procedure appropriate pertale solubilizzazione varierà a seconda del farmaco in questione e deve essere ottimizzato separatamente.
4. Lavare le cellule delicatamente, tre volte, con ~ 1 ml di tampone di lavaggio per lavaggio. Eseguire ogni lavaggio aspirando delicatamente il liquido dal pozzetto, poi prontamente e dolcemente, riempimento pozzo con soluzione fresca, come desiderato (in questo caso con tampone di lavaggio).

4. Fissazione e Immunocitochimica

Nota: Gli obiettivi specifici in materia di etichettatura variano da esperimento. Nel nostro uso, abbiamo etichettato recettori oppioidi delta (DOR) e Rab5, Rab 11, e LAMP1, come discusso. Gli anticorpi specifici utilizzati dipenderà l'esperimento specifico. Condizioni ottimali di etichettatura dipendono l'anticorpo specifico (i) utilizzati. Una discussione molto più ampia di questo argomento è al di sotto.

1. Fissare le cellule mediante immersione in ~ 300 microlitri 4% paraformaldeide in 0,1 M tampone fosfato per 10 min a 37 ° C.
   Nota: E 'importante che il para 4%formaldeide essere preparata a causa della autofluorescenza causati dall'uso di paraformaldeide precedentemente congelati.
2. Lavare le cellule delicatamente, 3 volte, con ~ 1 ml di tampone di lavaggio per lavaggio, come descritto al punto 3.3.
3. Incubare le cellule in 300 microlitri tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente.
4. Incubare le cellule con anticorpi primari in 300 ml di diluente per 48 ore a 4 ° C. Nel nostro uso, anticorpi primari contro DOR (coniglio anti-DOR) e uno di: Rab5 (topo anti-Rab5), Rab 11 (topo anti-Rab11), e LAMP1 (capra anti-LAMP1).
5. Lavare le cellule delicatamente, tre volte, con ~ 1 ml di tampone di lavaggio per lavaggio, come descritto al punto 3.3.
6. Incubare le cellule con anticorpi secondari coniugati con differenti fluorofori (vedere discussione seguente) in 300 ml di diluente per 1 ora a RT. In questo, e tutti i passaggi successivi, proteggere le cellule dalla luce. Per ottenere i risultati rappresentativi, utilizzare verde emettitori anti-coniglio fluoroforo coniugato e either un fluoroforo-coniugato anti-topo rosso luminescente o rosso-emitting fluoroforo coniugato anti-capra.
7. Lavare le cellule delicatamente, 3 volte, con ~ 1 ml di tampone di lavaggio per lavaggio, come descritto al punto 3.3.
8. Togliere i coprioggetti 12-round da 24 pozzetti lasciando ~ 1 ml di tampone di lavaggio in ogni pozzetto, tenendo la piastra a ~ 45 °, e leva il vetrino fuori del pavimento pozzetto utilizzando una pinza sottile. Il coprioggetto arriverà a riposo contro il muro pozzo, da dove può essere facilmente rimosso con le pinze.
9. Montare il coprioggetto, cell-side-down, su vetrini da microscopio con l'anti-fading mezzo di montaggio.

5. Impostazioni microscopio

1. Utilizzando un obiettivo ad alto ingrandimento (100X), prima di individuare una cella rappresentante di essere ripreso con epifluorescenza.
2. Configurare le impostazioni di cattura dell'immagine per registrare le immagini TIFF non compresso a 8-bit di ciascun canale con etichetta (per il rilevamento di ogni fluoroforo utilizzato ad esempio, 488 nm e 594 nm), per ogni immagine sequenzialmente canale (o per riga o telaio), e da 4 a 6 scansioni medi per l'immagine finale. Risoluzione dell'immagine ottimale sarà specifico per microscopio, ma 1024 x 1024 produce in genere buoni risultati.
3. Passare al percorso confocale e concentrarsi ad un piano z attraverso il centro della cella.
4. Ottimizzare pinhole (tipicamente 1 unità Airy), potenza del laser, e tensione del tubo fotomoltiplicatore (guadagno) e offset per ciascun canale. Salvare / registrare queste impostazioni. Utilizzare le stesse impostazioni del microscopio per l'imaging tutte le cellule etichettate per ogni data coppia di destinazione nella stessa replica.
   Nota: Questo processo di solito provoca photobleaching sufficiente che questa cellula non dovrebbe essere ripreso per l'analisi.

6. Imaging

1. Utilizzando un obiettivo alto ingrandimento (es 100X), prima localizzare una cella da acquisire con epifluorescenza.
2. Passare al percorso confocale e concentrarsi ad un piano z attraverso il centro della cella. IOf disponibili, utilizzare software di zoom / coltura per limitare l'area di scansione per la cella di interesse.
3. Catturare immagini per ogni canale con etichetta con le impostazioni stabilite in precedenza. Ripetere i passaggi 6,1-6,3 per immagine 15 o più cellule per condizione per replica per assicurare un campione sufficiente.

7. Colocalizzazione Analisi

1. Aprire la coppia di immagini (ad esempio, 'verde' e 'red') di una cella in ImageJ. Utilizzare le Immagini> Colore> Unisci canali ... comando per generare un'immagine RGB.
2. Disegna una selezione attorno alla cella di interesse. Utilizzare il ImageJ plugin "PSC Colocalizzazione" ^(11, disponibile da https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) per quantificare colocalization degli obiettivi nella cella selezionata.
3. Registrare la misura colocalizzazione desiderata (in genere di Pearson r ^17). Ripetere i passaggi 7,1-7,3 per ogni cella ripreso.

8. Normalizzazione dei dati

1. Calcolare la media dei valori rilevati colocalizzazione delle condizioni di controllo comuni di ciascuna replica di ciascuna condizione etichettatura.
   Nota: per esempio, la media dei valori colocalizzazione di neuroni nel "veicolo di 48 ore, 60 minuti veicolo" condizione di droga in ciascuno dei 3 repliche indipendenti in ciascuna delle 3 condizioni di etichettatura (recettore e ciascuno dei 3 scomparti).
2. Moltiplicare i mezzi di (-1) per ottenere l'offset per ogni replica in tutte le condizioni di etichettatura. Aggiungere l'offset per ogni replica in ogni condizione di etichettatura per ogni valore colocalizzazione in quella replica.
   Nota: Questo normalizzare i dati in modo che la misura colocalizzazione media per la condizione di controllo comune è 0 in ogni copia di ogni condizione di etichettatura.
3. Pool i dati di tutte le repliche di ogni condizione di etichettatura.
   Nota: le modifiche in colocalization ora possono essere analizzati attraverso repliche. Anale statisticaYsis dipenderà disegno sperimentale, ma in genere comporta analisi della varianza (ANOVA) seguita da opportune prove post-hoc (ad esempio, Tukey). Per le risorse statistici, si veda ad esempio, ^18.

Risultati

Utilizzando questa tecnica, è possibile quantificare i cambiamenti nel recettore traffico post-internalizzazione seguenti due trattamenti farmacologici cronici / prolungata e acuta. Dopo trattamenti farmacologici, di fissazione, e l'etichettatura, ad alta risoluzione fotomicrografie due canali vengono acquisite di ogni cellula di interesse. Immagini rappresentative possono essere combinati con falsi colori colocalization per generare figure illustrative (Figura 1). Analisi colocalizational successi...

Discussione

Abbiamo ottimizzato questo protocollo per l'analisi delle colture primarie di neuroni adulti gangli delle radici dorsali (neuroni sensoriali primarie). Può anche essere utilizzato, con poche o nessuna modifica, per le cellule in coltura monostrato placcato ampiamente. L'analisi colocalizational è possibile anche in fette di tessuto e di altre tali preparati ^11, tuttavia i componenti di trattamento farmacologico e il fissaggio del tessuto / preparazione non sarebbe appropriato.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503-500G
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888-500G
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	258148
Albumin from Bovine Serum	Sigma Aldrich	A7906-100G
Gelatin from cold water fish skin	Sigma Aldrich	G7041-100G
Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well	Fisher Scientific	720084
12 circle Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount	Polysciences	18606-20
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	S9638-500G
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	S9763-500G
Paraformaldehyde	Polysciences	00380-1
Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30
Rabbit anti-DOR antibody	MyBioSource	MBS316175	Used at 1:1,500
Mouse anti-Rab5 antibody	Sigma Aldrich	R7904	Used at 1:750
Mouse anti-Rab11 antibody	Millipore	05-853	Used at 1:500
Goat anti-LAMP1 antibody	Santa Cruz	SC8098	Used at 1:750
Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody	Life Technologies	A-21206	Used at 1:200 to 1:2,000
Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11005	Used at 1:200 to 1:2,000
Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11058	Used at 1:200 to 1:2,000