Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

요약

수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.

초록

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

서문

수용체 특히, G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)는, 정기적으로 및 세포 표면 ^{(1)로부터,} 세포 내에서 팔려. 이 복잡하게 조율하고 엄격하게 제어 과정은 세포의 가능한 수용체 보완을 지시하고 수용체 시간 활동, 탈감작 및 resensitization ² 조절 ^{- 4.} 중요한 것은, 이들 방법은 약물 유발 수용체 활성 또는 비활성을 포함한 셀룰러 환경에 응답한다. 즉, 수용체에 리간드의 행동함으로써 세포 응답을 변경, 그 수용체의 세포 내 인신 매매를 변경할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 외부 리간드에도 고전 메신저 투 이펙터 캐스케이드 ^5,6- 넘어 더 효과 세포 기능에 아직 발휘.

유도 수용체 인신 매매에 이러한 변화를 검토하는 것은 어렵다. 사용 가능한 모든 기술은 한계를 포함한다. 비오틴 보호 분석법 모니하는데 사용되어왔다토르 표면 수용체 집단. 이들 수용체는 바이오틴 화되어 면역 침전의 timecourse은 시간이 지남에 따라 바이오틴 수용체의 감소를 정량화하기 위해 수행된다. 이러한 기술은 본질적으로 수용체 ^(7)의 초기 레이블, 인구의 점진적인 열화를 모니터링하고,이 공정의 시간 코스를 구성하는데 매우 유용하다. 불행하게도,이 분석은 내재화, 재활용, 또는 새로운 수용체 등의 수용체, 원래 풀 저하 이외의 프로세스를 모니터링 할 수 없다. 또한, 50kDa 범위 수용체 150kDa 범위의 항체의 첨가는 수용체의 매매 ^{8,9 변경할} 수 있으며,이 기술은 낮은 발현 수준의 수용체로 사용하기 어려울 수있다.

다른 절차는 세포 내 인신 매매 구획 (예를 들면, 엔도 좀 등)을 확인하고 관심있는 수용체와 그들의 colocalization을 평가하기 위해 다양한 방법을 사용합니다. 이것은 우리를 포함표현 이종 시스템의 전자 수용체 및 구획 마커 (예를 들면, 랩 - 가족 GTP 아제)의 키메라 구조를 형광 단백질은 태그가. 이로 인해 고정 및 투과성으로 관련된 문제를 제거하는, 살아있는 세포 이미징의 사용을 가능하게한다. 더 생리 학적으로 대표 세포 유형과 행동과 호환성을 인신 매매에 태그와 발현 정도 효과 : 강력한 있지만, 이러한 전략은 이종 일반적으로 시스템의 동일한 제한을 앓고. 더 널리, 염료가 쉽게 세포 내 구획 레이블을하는 데 사용됩니다 (예를 들어, 리소좀, 표면 상) ^10. 염료는, 그러나, 특이성 (리소좀에 대한 염료의 경우 모든 산성 세포 소기관을)이 부족하고 다른 구획을 통해 인신 매매를 평가하지 않습니다. 또, 이들 기술은 시스템 및 실험 조건 위에 상당한 제어를 허용 이하, 여기에 제시된 colocalization을 분석 방법 이점있다.

방법 승여기에 현재 전자는 colocalization을하여 수용체 인신 매매의 추적을 정제. 적당한 표식 라벨을 면역 세포 화학 (ICC)를 사용하면, 여러 별개의 세포 내 구획을 식별 할 수있다. 이는 또한 이종 시스템 대신에 생리 학적으로 관련 일차 세포 배양의 사용을 허용한다. 이러한 ICC 프로토콜 라벨 이전 관심 세포를 정착시키는 것을 포함한다; 이 약물 치료 (들) 다음과 같은 특정 평가시기에 표시를 허용합니다. 이것은 그 평가시기에 글로벌 수용체 구획 협회의 '스냅 샷'을 생산하고 있습니다. 여러 시점들로, 인신 매매 변경 timecourse도 구성 할 수있다.

간단히, 세포가 약물 처리, 수용체와 관심의 세포 내 구획 표지이며, 공 초점 이미징 및 현미경은 수학적 수용체와 실 ^(11)의 colocalization을 정량화 분석된다. 우리의 사용에서, 우리는 류마티스 관절염 수용체의 colocalization을을 조사B5, Rab11 및 막 단백질 1 (램프 1)를 리소좀은 관련. 이 마커는 각각 초기 엔도 좀, 재활용 엔도 좀과 리소좀을 식별합니다. 이 colocalization을 조치 국제화, 재활용, 분해 ^(12)의 무엇보다 중요한 프로세스에 대한 프록시 역할을합니다.

모든 기술에서와 같이, 몇 가지 제한을 고려해야한다. 인해 모든 개별 뉴런 분석 이미지 필요성이 기법 시점들과 관련된 조건의 수에 따라 상당히 노동 집약적이 될 수있다. 모든 immunolabeling는 고정과 투과성으로 ^(13)에 의해 발생하는 세포의 미세 구조, 단백질의 현지화 및 에피토프 접근성에 미치는 영향에 맞설해야합니다.

원래 기본 감각 뉴런의 차 문화와 함께 사용하기에 최적화 있지만,이 방법은 다른 단층 도금 문화 모델과 광범위하게 호환됩니다.

수학적 정량 지표 성과의 사용colocalization을의 전자는 특히, 훨씬 더 많은 방법 론적으로, 종종 시각적으로 검사 멀티 채널 오버레이 ^(14)와 같은 모호한, 주관적 조치에 의존 수용체 인신 매매의 변화를 평가하는 데 사용 이전 기술보다 엄격한입니다.

이 기술은 생체 개입 (이전에 차 문화 세대)과의 폭 넓은 호환성을 위해 특히 유용, 체외 개입 (문화 성장 중), 각종 라벨 ^(15)을 목표로하고있다. 이와 같이, 많은 다른 연구 질문하도록 구성 될 수있다.

프로토콜

참고 :이 프로토콜은 다양한 단층 도금 세포 / 조직 문화 모델, 약물 치료 요법, 및 라벨 대상으로 광범위하게 호환됩니다. 따라서 실제 사용에서, 많은 특정 매개 변수는 실험 설계에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에, 이러한 사용자 정의 매개 변수에 대한 참조는 일반적인 있습니다. 대표적인 결과를 얻기 위해 사용되는 예 조건은, 이탤릭체에 포함되어 있습니다.

1. 솔루션

1. 0.1 M 트리스 버퍼 고장 성 (300 mM)을 식염수와 0.05 % 폴리 솔 베이트 20을 혼합하여 세척 버퍼를 준비; 실온에서 pH가 7.4.
2. 버퍼를 차단 준비합니다. 0.05 M 트리스 버퍼 고장 성까지 (300 mM)을 식염수는 0.05 % 폴리 소르 베이트 20, 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 0.1 % 차가운 물고기 피부 젤라틴을 추가하고 실온에서 7.4로 pH를 조정합니다.
3. 0.05 M 트리스 - 완충 고장 성 (300 mM)을 식염수로 0.05 % 폴리 소르 베이트 20, 1 % BSA, 0.1 % 냉 물고기 껍질 젤라틴을 첨가하여 항체 희석액을 준비하고 4 ^O ℃에서 7.4로 pH를 조정
   참고 : 트리스 버퍼의 pH는 온도에 따라 달라집니다. 즉, 온도 변화는 용액의 pH를 변경되고있다. 일관성을 위해,이 버퍼는 항상이 사용될 때의 온도에서, pH가 조정되어야한다.

2. 세포 배양

주 : 적절한 세포 배양 프로토콜이 사용될 세포 유형 (들)에 따라 달라질 것이다. 이러한 절차는 별도로 최적화되어야한다. 자세한 세포 배양 방법은 ^(16)을 포함하여, 쉽게 사용할 수 있습니다. 유사한 절차는 현저한 차이 대표적인 결과를 수득 하였다 :

1. 성인 동물 문화 등의 루트 신경 뉴런은 ¹² 설명 된대로. 문화에 세포를 성인 신경 세포 성장 매체를 사용합니다. 오히려 글루타민산보다, 예비 도금하여 아교 세포 밀도를 줄일 수 있습니다. 이 approximat에 성장 적어도 30 ~ 60 판마다 신경과 동반 아교 세포와 12 라운드 커버 글라스에 성장 혼합 신경 세포 아교 문화 결과엘리 40 % 포화 상태. 또한 신경교 과도 성장시키고있는 경우 일차 배양 신경 세포에서 복제되지 않으며, 신경교 공 배양하여 플레이트 밀려된다는 것을 주목해야한다. 신경에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해, 신경교 번호 물리적 환원 화학 / 약학 적 방법에 바람직하다.
   주 :이 프로토콜의 목적을 위해, 우리가 관심있는 세포가 성장하고있는 것으로 가정들이 실험적 원하는 상태 및 단층 도금. 우리는 24 웰 플레이트에서 12 라운드 커버 글라스에 도금하는 것이 가장 편리 할 것을 찾을 수 있습니다. 설명 모든 볼륨 및 절차는 24 웰 플레이트 잘 하나에 하나의 coverslip에 적합합니다.

배양 된 세포 3. 약물 치료

참고 : 여러 순차적 또는 중복은, 약물 치료가 가능하다. 특정 실험에 따라 달라집니다 사용하는 노출의 약물, 용량 / 농도 및 지속 시간.

1. 원래의 성장 배지를 제거 ¹⁶ 를 선택한 농도 (들)에 관심있는 약물 (들)을 포함하는 배지로 교체합니다. 이 경우, 모르핀의 10 μm의이 식염수에 용해 또는 대조군으로 생리 식염수를 사용하여 사용합니다.
   참고 : 각각의 독립적 인 복제 (일반적으로 하나의 24 웰 플레이트 문화) 같은 공통 제어 조건을 포함하는 것이 중요합니다. 이 간 재판 변동을 보정 복제에서 데이터의 정상화를 허용합니다.
2. 48 시간 ¹⁶ 원래의 성장 조건에서 세포를 품어.
3. 이후 약물 치료의 경우, 반복 3.1 단계 및 Deltorphin 1 μm의 3.2, SNC80 1 ㎛, 또는 차량을 60 분 ¹² 품어. 물에 deltorphin II를 용해하고 물에 1 mm로 희석하여 40 μm의 HCl 및 초음파 처리, 10mm의에서 SNC80를 용해.
   주 :이 프로토콜들이 선택 성장 배지에서 원하는 농도 (들)에 용해 될 수 있다는 약물 (들)을 가용화 한 가정한다. 에 대한 적절한 절차이러한 가용화 문제의 약물에 따라 달라집니다 개별적으로 최적화해야합니다.
4. 세척 당 세척 버퍼의 1 ~ ㎖로, 부드럽게 세 번 세포를 씻으십시오. (세척 버퍼이 경우) 원하는대로 부드럽게, 신선한 용액을 잘 보충, 우물에서 액체를 흡입 한 후 신속하게, 부드럽게 각 세척을 수행합니다.

4. 고정 및 면역 세포 화학

참고 : 특정 표시 대상이 실험에 의해 달라질 수 있습니다. 논의 된 바와 같이 우리의 사용에서, 우리는, 델타 오피오이드 수용체 (DOR) 및 Rab5, 랩 (11), 및 램프 1 레이블. 특정 항체는 특정 실험에 따라 달라집니다 사용. 최적의 라벨 조건은 특정 항체를 사용 (들)에 따라 달라집니다. 이 주제의 많은 풀러 논의는 다음과 같습니다.

1. 37 ºC에서 10 분 동안 ~ 0.1 M 인산염 완충 생리 식염수 300 μL 4 % 파라 포름 알데히드를 침지하여 세포를 고정합니다.
   참고 :이 중요하다 4 % 파라포름 알데히드 갓 인해 이전에 냉동 파라 포름 알데히드를 사용함으로써 발생되는 형광도에 제조 될 수있다.
2. 3.3에 기술 된 바와 같이, 세척 당 세척 완충액 중 ~ 1 ㎖로, 부드럽게 3 번 세포를 씻어.
3. 실온에서 2 시간 동안 버퍼를 차단 μL (300)에있는 세포를 품어.
4. 4 ºC에서 48 시간 동안 항체 희석액 300 μL에서 일차 항체와 세포를 품어. 우리의 사용에서, 차 DOR에 대한 항체 (토끼 반 DOR)과 중 하나 Rab5 (마우스 항 - Rab5), 랩 11 (마우스 항 - Rab11), 및 램프 1 (염소 항 - 램프 1).
5. 3.3에 기술 된 바와 같이, 세척 당 세척 완충액 중 ~ 1 ㎖로, 가볍게 세 번 세포를 씻어.
6. 상이한 형광 물질에 접합 된 이차 항체와 세포를 부화 RT에서 1 시간 동안 항체 희석액 300 μL의 (아래 설명 참조). 이, 이후의 모든 단계에서 빛으로부터 세포를 보호합니다. 대표적인 결과를 얻으려면, 녹색 발광 형광 접합 된 항 - 토끼와 eith을 사용어 적색 발광 형광 접합 된 항 - 마우스 또는 적색 발광 형광 접합 된 항 염소.
7. 3.3에 기술 된 바와 같이, 세척 당 세척 완충액 중 ~ 1 ㎖로, 부드럽게 3 번 세포를 씻어.
8. ~에 접시를 들고, 잘 각각 45 °를 세척 버퍼 ~ 1ml를 떠나 24 웰 플레이트에서 12 라운드 된 커버를 제거하고 미세 집게를 사용 고타 떨어져 커버 슬립을 올립니다. 커버 슬립은 용이하게 집게를 사용하여 제거 할 수있는 곳에서, 웰 벽에 닿 올 것이다.
9. 현미경, 커버 슬립, 세포 측 다운 마운트 장착 매체를 방지 페이딩 슬라이드.

5. 현미경 설정

1. 고배율 대물 렌즈 (100X)를 사용하여, 표면 형광 제를 사용하여 묘화 될 수있는 대표적인 셀을 찾은.
2. 예를 들어, 사용되는 각 형광 물질의 검출, 488 nm 내지 59 (각 분류 채널의 8 비트 압축 TIFF 화상을 기록하는 촬상 설정 구성4 ㎚), (중 라인 또는 프레임에 의해), 최종 이미지에 대한 평균 4 ~ 6 스캔 이미지에 각 채널을 순차적으로. 최적의 이미지 해상도는 현미경 별 수 있지만 X 1024 (1024)는 일반적으로 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.
3. 공 초점 이미징 경로로 전환 세포의 중심을 Z-면에 초점을 맞 춥니 다.
4. 핀홀 (전형적 에어리 1 부), 레이저 전력, 광전자 증 배관 전압 (게인)를 최적화하고, 각 채널에 대한 오프셋. 이러한 설정을 기록 / 저장합니다. 같은 복제에 특정 대상 쌍에 대해 표시된 모든 세포 이미징에 대해 같은 현미경 설정을 사용합니다.
   참고 :이 프로세스는 일반적으로이 세포 분석을 위해 몇 군데되지 않도록 충분한 광표백 발생합니다.

6. 이미징

1. 고배율 대물 렌즈 (예를 들어, 100X)를 사용하여, 표면 형광 제를 사용하여 묘화 될 수있는 세포를 찾아.
2. 공 초점 이미징 경로로 전환 세포의 중심을 Z-면에 초점을 맞 춥니 다. 나는F 가능한 소프트웨어를 사용 크게 / 작물의 관심 셀로의 스캔 영역을 제한한다.
3. 설정을 사용하여 레이블이있는 각 채널에 대한 이미지를 캡처 이전에 설립했다. 반복 충분한 샘플을 보장하기 위해 이미지에 복제 당 조건 당 15 이상의 셀을 6.3에 6.1 단계를 반복합니다.

7. colocalization을 분석

1. 이미지의 쌍을 엽니 다 (예를 들어, '녹색'과 '빨간색') ImageJ에있는 셀의. > 컬러> RGB 이미지를 생성하는 명령 ... 채널 병합 이미지를 사용합니다.
2. 관심의 세포 주위에 선택을 그립니다. 선택한 셀에 대상의 colocalization을 정량화 (https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/에서 사용할 수 ¹¹⁾ "PSC colocalization을을"플러그인 ImageJ에 사용합니다.
3. 원하는 colocalization을 측정 (일반적으로 피어슨의 R ^17)를 기록한다. 반복 각 군데 셀에 대한 7.1-7.3 단계를 반복합니다.

8. 데이터 정규화

1. 각각의 공통 제어 조건의 기록 colocalization을 값들의 평균을 계산한다 각 표시 상태의 복제.
   참고 : 예를 들어, 뉴런의 colocalization을 값의 평균 "48 시간 차량 60 분 차량"3 라벨 조건 (수용체와 3 구획의 각) 각 3 독립적 인 복제 각각의 약물 상태.
2. (-1) 각 각 라벨 상태에서 복제에 대 한 오프셋 산출하는 기준 수단을 곱하십시오. 각각 그 복제의 각 colocalization을 값으로 각각의 라벨 상태에서 복제에 대 한 오프셋 (offset) 추가.
   주의 : 이것은 공통 제어 조건에 대한 평균 측정 colocalization을 각 표시 상태의 각 복제에 0이되도록 데이터를 정규화한다.
3. 각 표시 상태의 모든 복제에서 데이터를 풀.
   참고 : colocalization을의 변화는 지금 복제를 통해 분석 할 수 있습니다. 통계 항문이 Analysis 실험 설계에 따라 달라집니다하지만 일반적으로 분석 수준의 분산을 포함 할 것이다 (ANOVA)은 (예를 들어, Tukey에) 적절한 사후 테스트 하였다. 통계 자료를 들어, ^18, ​​예를 참조하십시오.

결과

이 기술을 사용하면, 장기간 / 만성 및 급성 약물 치료 모두 다음 수용체 내재화 후 거래의 변화를 정량화하는 것이 가능하다. 약물 치료, 정착, 및 표지 한 후, 고해상도 2 채널 현미경은 관심의 각 셀의 포획된다. 대표적인 이미지는 예시적인 도면 (도 1)를 생성하기 위해 거짓 색 colocalization을 함께 결합 될 수있다. 후속 colocalizational 분석 한 바와 같이, 목표 대상 colocalization을 (예를...

토론

우리는 성인 후근 신경절 신경 세포 (차 감각 뉴런)의 차 문화의 분석을 위해이 프로토콜을 최적화했다. 또한 광범위 단층 도금 배양 된 세포에 대해 거의 또는 수정없이 사용할 수있다. colocalizational 분석 그러나 약물 치료 및 조직 고정 / 혼합물의 구성 요소가 적절하지 않을 것입니다, 또한 조직의 조각 및 기타 준비 ^(11)에서 가능하다.

흥미로운 것은, 여기에 제시된 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503-500G
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888-500G
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	258148
Albumin from Bovine Serum	Sigma Aldrich	A7906-100G
Gelatin from cold water fish skin	Sigma Aldrich	G7041-100G
Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well	Fisher Scientific	720084
12 circle Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount	Polysciences	18606-20
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	S9638-500G
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	S9763-500G
Paraformaldehyde	Polysciences	00380-1
Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30
Rabbit anti-DOR antibody	MyBioSource	MBS316175	Used at 1:1,500
Mouse anti-Rab5 antibody	Sigma Aldrich	R7904	Used at 1:750
Mouse anti-Rab11 antibody	Millipore	05-853	Used at 1:500
Goat anti-LAMP1 antibody	Santa Cruz	SC8098	Used at 1:750
Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody	Life Technologies	A-21206	Used at 1:200 to 1:2,000
Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11005	Used at 1:200 to 1:2,000
Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody	Life Technologies	A-11058	Used at 1:200 to 1:2,000