Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Resumen

Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes.

Resumen

La invasión y la colonización de las células huésped por patógenos bacterianos dependen de la actividad de un gran número de proteínas procariotas, definido como factores de virulencia, que puede subvertir y manipular las funciones de acogida clave. El estudio de las interacciones huésped / patógeno tanto, es extremadamente importante comprender las infecciones bacterianas y desarrollar estrategias alternativas para hacer frente a las enfermedades infecciosas. Este enfoque, sin embargo, requiere el desarrollo de nuevos ensayos de alto rendimiento para el, la identificación automatizada imparcial y caracterización de determinantes de virulencia bacteriana. A continuación, describimos un método para la generación de una biblioteca mutante GFP-etiquetados por mutagénesis de transposones y el desarrollo de cribado de alto contenido de enfoques para la identificación simultánea de múltiples fenotipos transposón-asociado. Nuestro modelo de trabajo es la bacteriano patógeno intracelular Coxiella burnetii, el agente etiológico de la fiebre Q zoonosis, que se asocia con severe brotes con la consiguiente carga sanitaria y económica. La naturaleza intracelular obligado de este patógeno ha, hasta hace poco, obstaculizado gravemente la identificación de los factores bacterianos implicados en las interacciones de patógenos de acogida, por lo que de Coxiella el modelo ideal para la implementación de enfoques de alto rendimiento / alto-contenido.

Introducción

La bacteria Coxiella burnetii endémica emergente es responsable de grandes brotes de fiebre Q, una zoonosis parecida a la gripe debilitante con la salud graves e impacto económico ^1. Los principales reservorios de Coxiella son animales domésticos y de granja, y se estima que más del 90% de las vacas lecheras en los EE.UU. llevar C. burnetii ^2. Los seres humanos son huéspedes accidentales que están infectados por inhalación de aerosoles contaminados. Fiebre Q humano se manifiesta ya sea como una enfermedad aguda o crónica, que puede tener complicaciones fatales con una tasa de mortalidad de llegar a 65% ^{de 1,3.} Con una dosis infecciosa de 1 - 10 organismos, Coxiella es el patógeno más infecciosa conocida y ha sido investigado como un arma potencial bio ^4. El reciente brote explosivo de la fiebre Q en los Países Bajos (2007 - 2010), con casos crecientes de 182 a más de 2.000 por año, se erige como un ejemplo de la severa virulencia de este patógeno^5.

La notable eficacia de infecciones Coxiella probablemente se asocie con su resistencia al estrés ambiental, combinado con su adaptación única a las células huésped. De hecho, Coxiella está presente en el medio ambiente en forma de pequeñas variantes metabólicamente inactivos celulares (SCV), que son notablemente resistentes a varias condiciones duras (desecación, temperatura, etc.). SCVs son hasta tomada por las células fagocíticas a través de α _V β ₃ integrinas ⁶ mientras que la invasión de células no fagocíticas está mediada por la Coxiella adhesión / invasión OmpA ⁷ y un receptor aún no identificado. Tras la absorción, Coxiella reside en vacuolas ajustados, positivos para los marcadores endosomales primeros Rab5 y EEA1 ^8. Las bacterias responden a la acidificación endosomal convirtiendo a las variantes de células grandes metabólicamente activas (LCV) y la activación de un sistema de secreción tipo 4 Dot / ICM (T4SS) ⁹, Altamente homóloga a la de Legionella pneumophila ^10. La secreción de efectores Dot / ICM permite Coxiella para generar un compartimento ácida gran LAMP1-positivo que contiene enzimas lisosomales activos donde las bacterias pueden prosperar y proteger activamente las células infectadas de la apoptosis ^11. Por lo tanto, el ciclo intracelular de Coxiella es controlado por la translocación mediada por Icm Dot / de efectores bacterianos ^12, sin embargo, los factores microbianos implicados en la invasión de células huésped, la replicación bacteriana y la difusión de la infección siguen siendo en gran medida desconocido.

Combinando mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia, estamos desarrollando métodos imparciales para la identificación simultánea de factores bacterianos implicados en los pasos principales de infecciones Coxiella: 1) la internalización en las células huésped, 2) la replicación intracelular, 3) de propagación de célula a célula y 4) la persistencia. Hasta la fecha, hemos proyectado más de 1.000 mutations en 500 secuencias Coxiella codificación, que nos proporcionaron conocimientos sin precedentes en las interacciones huésped-patógeno que regulan Coxiella patogénesis ^7. De nota, este enfoque puede ser aplicado al estudio de otros patógenos intracelulares que comparten características de biología celular con Coxiella.

Protocolo

1. Generación de una biblioteca de Coxiella mutantes transposón GFP-etiquetados

Manipular Coxiella burnetii RSA439 NMII en un nivel de contención de bioseguridad 2 (BSL-2) en una cabina de seguridad microbiológica (MSC) en el cumplimiento de las normas locales. Si es compatible con el modelo bacteriana utilizada, repita los pasos de 1.4.1 a 1.4.4 para aumentar la probabilidad de obtener mutantes clonales. Una biblioteca mutante típico se compone (al menos) de un número de mutantes que es igual a tres veces el número de secuencias anotado en el genoma del organismo utilizado codificación.

1. Preparación de electrocompetentes Coxiella RSA439 NMII:
   1. Preparar 1x ACCM-2 ^13: 13.4 mM de ácido cítrico, citrato sódico 16,1 mM, fosfato de potasio 3,67 mM, cloruro de magnesio 1 mM, cloruro de calcio 0,02 mM, 0,01 mM de sulfato de hierro, cloruro de sodio 125,4 mM, 1,5 mM L-cisteína, 0,1 g / L Bacto Neopeptona, 2,5 g / l de casaminoácidos, 1 g / L metil beta ciclodextrina, 125 ml / L RPMI. Ajustar el pH a 4,75 y esterilizar filtro (no autoclave). Nota: Liquid ACCM-2 es estable a 4 ° C durante aproximadamente 1 mes.
   2. Se inoculan 100 ml de ACCM-2 con 2 x 10 ⁶ genoma equivalente (GE) / ml de Coxiella RSA439 NMII (de una población bacteriana previamente generado y cuantificado como en el paso 1.5) de -80 ° reservas de C y distribuir la suspensión bacteriana en el 75 ² frascos de cultivo de células cm con tapas de ventilación (10 - 15 ml de suspensión bacteriana por frasco). Crecer durante 7 días a 37 ° C en un ambiente humidificado del 5% de CO ₂ y el 2,5% de O _2.
   3. Agrupar la suspensión bacteriana resultante en tubos de 50 ml y centrifugar a 3900 xg durante 1 hora a 4 ° C.
   4. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 30 ml de 10% de glicerol. Centrifugar a 3900 xg durante 1 hora a 4 ° C.
   5. Resuspender el precipitado en un volumen adecuado de 10% de glicerol (típicamente 2 ml) y 50 l alícuota en tubos de 500 mL. Mantenga resuspendido bacteria en hielo durante todo el proceso. Nota: En esta etapa, las bacterias son electrocompetentes y una alícuota es suficiente para realizar una electroporación. Las suspensiones bacterianas se pueden almacenar a -80 ° C durante 6 meses o usarse directamente para la electroporación de ADN de plásmido.
2. Electroporación de Coxiella competente transposon- y plásmidos que codifican transposasa-:
   Nota: para el siguiente protocolo, el elemento de transposición y la transposasa son codificadas por dos plásmidos diferentes (pitṛ-CAT-GFP y pUC19-Himar1C9, respectivamente) ^7. Ambos plásmidos carecen de un origen de replicación-Coxiella específica, lo que los plásmidos suicidas cuando electroporación en Coxiella. Esto asegura transposón inserciones estables. El elemento de transposición contiene un casete de resistencia a cloranfenicol bajo la regulación del promotor p1169 Coxiella para la selección y el gen gfp bajo la regulación del promotor P311 Coxiella etiquetar los mutantes generados con las buenas prácticas agrarias.
   1. Pre-enfriar una cubeta de electroporación de 0,1 cm durante 10 minutos en hielo. Mezclar 50 l de electrocompetente Coxiella con 10 g plásmido transposón y 10 g de plásmido transposasa ^7. Asegúrese de que la concentración de plásmido es superior a 500 g / ml para minimizar la dilución de la glicerol.
   2. Electroporar utilizando la siguiente configuración: 18 kV, 500 Ω, 25 mF. Asegúrese de que la constante de tiempo resultante está comprendido entre 9 y 13 mseg.
   3. Añadir inmediatamente 950 l de RPMI, resuspender las bacterias electroporación y transferir a un tubo de tapón de rosca y mantener a temperatura ambiente.
   4. Tomar 200 l de las bacterias a electroporación y añadir 3 ml de ACCM-2 suplementado con inactivado por calor 1% suero bovino fetal (FBS) en placas de 6 pocillos. Añadir 88 l de DMSO al volumen restante de bacterias electroporadas (para llegar a una concentración final de 10% de DMSO) y se almacena a -80 ° C.
3. Selección de los mutantes de transposón:
   1. Incubate los 6 y placas inoculadas como se describió anteriormente (1.2.4) durante la noche a 37 ° C en un ambiente humidificado del 5% de CO ₂ y el 2,5% de O _2. Añadir los antibióticos apropiados (375 mg / ml de kanamicina o 3 mg / ml de cloranfenicol). Incubar el cultivo bacteriano durante 3 días adicionales en las condiciones descritas anteriormente.
4. Aislamiento de mutantes individuales:
   1. Preparación de sólidos ACCM-2 placas y planchas de mutantes transposón Coxiella
      Nota: Las instrucciones siguientes son para 1 placa de Petri, varias diluciones de cultivos de bacterias tienen que ser probados para evaluar el volumen de la inoculación óptima para el aislamiento de colonias.
      1. Calentar 10,5 ml de agarosa al 0,5% en el microondas y dejar enfriar en un baño de agua a 55 ° C. Calentar 11,25 ml de 2x ACCM-2 (pH 4,75) a 37 ° C.
      2. Preparar agarosa inferior:
         1. Mezclar 10 ml de 0,5% de agarosa fundida con 10 ml de 2x ACCM-2 y añadir los antibióticos apropiados (375 g / ml de kanamicina o 3g / ml de cloranfenicol).
         2. Vierta inmediatamente en la placa de Petri. Mantenga el plato unlidded Petri, deje enfriar medio durante 30 minutos y durante 20 minutos se seque al aire.
      3. Preparar la parte superior de agarosa:
         1. Mezclar 1,25 ml de 2x ACCM-2 con 0,75 ml de agua en un tubo de poliestireno de 5 ml, añadir los antibióticos apropiados (375 g / ml de kanamicina o 3 mg / ml de cloranfenicol) y se incuba a 37 ° C.
         2. Añadir el cultivo bacteriano (típicamente de 1 a 100 l) y agitar durante 5 seg.
         3. Añadir 0,5 ml de agarosa derretida, mezclar y verter inmediatamente en la parte inferior de agarosa.
         4. Dejar enfriar durante 20 min, sustituir la tapa en la placa de Petri y se incuba a 4 ° C durante 20 min para facilitar la solidificación de agarosa.
         5. Deje secar al aire durante 20 min unlidded en un MSC. Crecer placas a 37 ° C en un ambiente humidificado del 5% de CO ₂ y el 2,5% de O ₂ de 6 a 7 días.
   2. Añadir DMSO a las bacterias restantesl culturas con el fin de llegar a una concentración final de DMSO al 10% y se almacena a -80 ° C.
   3. Evaluar la dilución óptima de la siguiente manera: asegurar que las colonias son de 0,5 a 1 mm de diámetro y se aíslan adecuadamente para evitar la contaminación cruzada. Descongelar restante cultivos bacterianos desde el punto 1.4.2 y la placa a la dilución apropiada en ACCM-2 agar como se describe en 1.4.1.2 y 1.4.1.3. Incubar durante 6-7 días descrita en 1.4.1.3.5.
   4. Una vez que las colonias son detectables, recoger ellos cortando el extremo de una punta de 1 ml, recogiendo el tapón que contiene colonias aisladas y dispersar la colonia por pipeteado en 1,5 ml de ACCM-2 que contiene los antibióticos apropiados (375 g / ml de kanamicina o 3 mg / ml de cloranfenicol) en una placa de 24 pocillos. Amplificar colonias individuales durante 6 días en las condiciones descritas en el punto 1.3.1. El día 3 de incubación, dispersar los grumos bacterianos pipeteando cada cultura.
   5. Guarde cada suspensión mutante en tubos de tapón de rosca con código de barras 2D en placas de 96 pocillos en 10% De DMSO a -80 ° C.
5. Evaluación de la concentración bacteriana:
   Nota: el siguiente protocolo se puede aplicar para obtener las curvas de crecimiento de mutantes bacterianos de replicación en un medio axénico (véase 1.4.4).
   1. Preparación de la curva estándar:
      1. Preparar una solución / ml 2 g de dsDNA (típicamente un plásmido aleatoria de tamaño conocido y concentración) en 1X Tris-EDTA (TE). Preparar 10 veces diluciones seriadas de la solución madre para obtener concentraciones que van de 2 g / ml a 2 ng / ml. Dispensar 50 l de cada concentración a pocillos individuales de una microplaca de 96 pocillos con paredes negras y fondo (véase la Tabla de Materiales).
      2. Diluir la cuantificación reactivo dsDNA 1: 200 en tampón 1x TE y añadir 55 l de reactivo diluido a cada muestra en la microplaca de 96 pocillos. Mezclar bien usando un agitador de placas y se incuba durante 2 a 5 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.
      3. Medir la fluorescencia de las muestras utilizando una fluorescencialector de microplacas nce y filtros para longitudes de onda estándar de fluoresceína (~ 480 nm de excitación, emisión de ~ 520 nm).
      4. Trazar el rango de concentración de plásmido en contra de las lecturas de intensidad de fluorescencia.
   2. Bacteriana cuantificación suspensión:
      1. Dispensar 5 l de 10% de Triton X-100 por pocillo en una microplaca de 96 pocillos con paredes negras y fondo (véase la Tabla de Materiales). Añadir 50 l de las suspensiones bacterianas a cada pocillo e incubar 10 min a temperatura ambiente, en un agitador de placas.
      2. Diluir la cuantificación reactivo dsDNA 1: 200 en tampón 1x TE y añadir 55 l de reactivo diluido a cada muestra en la microplaca de 96 pocillos. Mezclar bien usando un agitador de placas y se incuba durante 2 a 5 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.
      3. Medir la fluorescencia de las muestras usando un lector de microplacas de fluorescencia y filtros para longitudes de onda estándar de fluoresceína (~ 480 nm de excitación, emisión de ~ 520 nm).
      4. Para obtener el DN bacterianaUna concentración, trazar las lecturas de fluorescencia en el gráfico obtenido en el punto 1.5.1.4. Divida la concentración de ADN por la masa del genoma Coxiella (2,2 fg) para obtener las concentraciones de bacterias. Expresar los resultados en el genoma / ml equivalentes.
      5. Deseche mutantes que exhiben un defecto importante crecimiento en ACCM-2.

2. Single Primer colonia PCR, secuenciación y anotación

Nota: el siguiente protocolo es para la amplificación de ADN de 96 muestras, se recomienda una pipeta multicanal para los siguientes pasos. Columna de purificación de productos de PCR utilizando perlas magnéticas y secuenciación del ADN con una imprimación-transposón específica (2.3) se subcontrata a una empresa externa.

1. Asegúrese de que el cebador de amplificación está diseñado con el fin de hibridar entre 100 y 200 pares de bases aguas arriba de la repetición en tándem invertida (ITR), para obtener productos de PCR que cubren el sitio de inserción del transposón en Coxiellun genoma. Preparar 3 ml de mezcla de PCR (1x tampón de alta fidelidad, 200 mM dNTPs, 1 M cebador de amplificación, 20 U / ml de ADN polimerasa de alta fidelidad) y dispensar 29 l por pocillo en una placa de 96 pocillos PCR establecido en hielo. Transferencia de 1 l de cada mutante en fase estacionaria en ACCM-2 a la mezcla de PCR.
2. Run PCR con desnaturalización inicial (98 ° C, 1 min), 20 ciclos de alta rigurosidad (98 ° C, 10 seg; 50 ° C, 30 seg; 72 ° C, 90 seg), 30 ciclos de astringencia bajas (98 ° C, 10 seg; 30 ° C, 30 seg; 72 ° C, 90 seg) y 30 ciclos de astringencia elevadas (98 ° C, 10 seg; 50 ° C, 30 seg; 72 ° C, 90 seg), seguido de una extensión final a 72 ° C durante 7 min.
3. Purificar los productos de PCR utilizando perlas magnéticas y la secuencia de ADN con una imprimación-transposón específico. Diseñar el cebador-transposón específico con una temperatura de fusión predicho comprendido entre 50 ° C y 75 ° C, un contenido de GC entre 40% y 60%, una longitud de entre 18 y 25 nucleótidos y un SI de recocidoTe aguas abajo del sitio de hibridación del cebador de amplificación y al menos 100 pares de bases aguas arriba de la primera par de bases de la ITR transposón.
4. El uso de software de análisis de secuencia, cargue el genoma completo, anotada de Coxiella burnetii 493 NMI. Utilice la función de "alinear a la referencia" para cargar y alinear (blastn) los resultados de la secuenciación y determinar el sitio de la transposición. Deseche mutantes con no-juego y / o exhibir doble reads.To monitorear la saturación de la biblioteca de mutantes, mantener un registro de la ocurrencia de múltiples inserciones transposón en el mismo sitio.

3. Las células eucariotas reto con Coxiella Mutantes y el monitoreo del crecimiento intracelular

Nota: Se recomienda una pipeta multicanal para los siguientes pasos. Las infecciones se realizaron por triplicado en estéril microplacas de 96 pocillos con paredes negras y fondo transparente plana. burnetii en peso Coxiella que expresan GFP ¹⁴ wconforme a lo dispuesto por el Dr. Robert Heinzen.

1. Crecer células Vero en medio RPMI sin rojo fenol suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en ausencia de antibióticos (Completar medios RPMI).
2. El día antes de la infección, lavar las células Vero de un confluente o matraz de cultivo celular sub-confluente con 10 ml de PBS.
3. Separar las células Vero mediante la adición de 1 ml de solución de EDTA tripsina al matraz de cultivo celular y se incuba durante 3 a 5 min a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2.
4. Resuspender las células en 10 ml de medio RPMI completo. Recuento de células y preparar una suspensión celular de 10 ⁵ células por ml.
5. Dispensar 100 l de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de color negro con fondo transparente plana.
6. Centrifugar durante 5 min a 400 xg a temperatura ambiente para facilitar la adhesión celular en el fondo de los pocillos e incubar durante la noche a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2.
7. Descongelar las placas de 96 pocillos que contienen el Comutantes xiella a TA y se diluyen 150 l de suspensión bacteriana en 300 l de RPMI sin rojo fenol y FBS en una placa de 96 pocillos de pozo profundo.
8. Retire el medio de la microplaca contienen células Vero y dispensar 100 l / pocillo de mutantes Coxiella diluidas (MOI de 100). Utilice A1 como negativo (células no infectadas) de control y Wells A2 y A3 como controles positivos (células infectadas con el peso Coxiella expresando GFP ¹⁴ a multiplicidades de infección (MOI) de 100 y 200).
9. Centrifugar la placa durante 10 minutos a 400 xg a temperatura ambiente usando un soporte de la placa centrífuga hermética a los aerosoles.
10. Incubar a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO ₂ durante 2 h entonces reemplazan las bacterias que contienen medio con 100 l / pocillo de medio fresco, RPMI completo.
11. Medir la fluorescencia de GFP diaria durante 7 días utilizando un lector de microplacas de fluorescencia y filtros para longitudes de onda estándar de fluoresceína (~ 480 nm de excitación, emisión de ~ 520 nm). Evitarla interferencia debida a la condensación y la dispersión de la señal en el medio de cultivo, utilizar excitación parte inferior y la grabación de emisiones en el lector de microplacas.

4. Preparación de muestras para Automated Image Acquisition

Nota: El procedimiento es para una placa de 96 pocillos, escala de seguridad de volúmenes en consecuencia. A pasos de 4,2 se puede hacer uso de un lavador de placas.

1. En el día 7 después de la infección ^TH, retire medio de la placa y reemplazarlo con 50 l / pocillo de medio fresco, completo que contiene un colorante fluorescente permeable celular a la dilución apropiada (por lo general 1: 1000, para ser optimizado de acuerdo con la línea celular utilizada ). Se incuban las células para 30 - 60 min a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2.
2. Reemplazar medio con 50 l / pocillo de 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS, incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT) a continuación, eliminar el tampón que contiene PFA-y lavar 3 veces con PBS.
3. Retire PBS y DISPENSe 50 l / pocillo de solución de bloqueo (0,5% de albúmina de suero bovino, 50 mM NH ₄ Cl en PBS, pH 7,4) suplementado con 0,05% de saponina. Incubar a TA durante 30 min.
4. Reemplazar solución de bloqueo con 40 l / pocillo de solución de bloqueo fresco suplementado con saponina (como arriba) y con un anticuerpo anti-LAMP1 en una dilución 1: 500. Incubar la placa durante 30 min a RT.
5. Eliminar la solución de bloqueo y lavar la placa de 96 pocillos 5 veces con 100 l / pocillo de PBS.
6. Dispensar 40 l / pocillo de solución de bloqueo suplementado con saponina (como arriba), el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia apropiado (a una dilución de 1: 1000) para revelar el anticuerpo anti-LAMP1 aplicada en el paso 4.4, y con Hoechst 33258 a 5 g / ml. Incubar la placa durante 30 min a RT.
7. Eliminar la solución de bloqueo y lavar la placa de 96 pocillos 5 veces con 100 l / pocillo de PBS. Deje el volumen de PBS correspondiente a la última de lavado en la placa de 96 pocillos, como las células fijadas no deben secarse.
8. Imagen de la placa de inmediato o placa se almacena a 4 ° C, protegido de la luz, para su posterior análisis.

5. Adquisición de imágenes

1. Adquirir imágenes de la GFP (488 nm, bacterias), Hoechst 33258 (350 nm, los núcleos de la célula huésped), rojo (~ 555 nm, membrana celular marcador) y rojo lejano (~ 615 nm, LAMP1) canales usando un microscopio de epifluorescencia automatizado equipadas con un objetivo 20X. Adquirir 21 campos independientes por pocillo con el fin de imagen un mínimo de 5000 células por muestra. Aplicar enfoque automático utilizando el canal de núcleos de la célula huésped como una referencia. Cuando se trabaja con patógenos bacterianos infectar un bajo porcentaje de células huésped, los usuarios pueden ajustar el número de campos independientes fotografiados por pozo, con el fin de obtener un mínimo de 500 células infectadas para analizar.

Procesamiento 6. Imagen

Nota: los siguientes pasos son específicos para el uso de la imagen de software CellProfiler análisis. En todos los casos, el algorit óptimahm para la segmentación debe definirse experimentalmente y los objetos que tocan el borde de la imagen debe ser eliminado con la función apropiada.

1. Cargar todas las imágenes en CellProfiler.
2. Utilice el módulo "ImageMath" para restar el canal de GFP desde el canal de Hoechst, para evitar la detección de colonias Coxiella (también etiquetados por Hoechst) como núcleos de células huésped en las siguientes etapas.
3. Utilice la opción "IdentifyPrimaryObjects" módulo a los núcleos de células anfitrionas segmento de la imagen resultante de la etapa 6.2. Nombrar los objetos segmentados "Núcleos".
4. Utilice la opción "IdentifySecondaryObjects" módulo a células huésped segmento de las 555 imágenes nm utilizando los núcleos detectados en la etapa 6.3 como semillas. Nombrar los objetos segmentados "Células".
5. (Opcional) Utilice la opción "IdentifyTertiaryObjects" módulo para restar núcleos identificados en el paso 6.3 de las células identificadas en el paso 6.4. Nombrar los objetos segmentados Citoplasma "221 ;.
6. Utilice la opción "EnhanceOrSuppressFeatures" módulo sobre los 615 nm para eliminar imágenes de fondo y facilitar la siguiente identificación de compartimentos LÁMPARA1-positivo.
7. Utilice la opción "IdentifyPrimaryObjects" módulo en la imagen obtenida en el paso 6.6 para identificar compartimientos LÁMPARA1-positivo. Nombrar los objetos segmentados "Los lisosomas".
8. Utilice la opción "IdentifyPrimaryObjects" módulo en la imagen de 488 nm para identificar colonias Coxiella. Nombrar los objetos segmentados "colonias".
9. Utilice la opción "IdentifySecondaryObjects" módulo sobre los 615 imágenes nm para identificar vacuolas que contienen Coxiella-utilizando las colonias Coxiella detectados en el paso 6.8 como semillas. Nombrar los objetos segmentados "ccvs".
10. Utilice la opción "MaskObjects" módulo para seleccionar CCV detectados en las células (como se han eliminado las células que tocan el borde de la imagen, algunos CCV se pueden detectar células "externos"). Nombra los resulting objetos "CCV filtrados".
11. Utilice la opción "MaskObjects" módulo para seleccionar colonias detectadas en las células (como se han eliminado las células que tocan el borde de la imagen, algunas colonias se pueden detectar células "externos"). Nombrar los objetos resultantes "Colonias filtrados".
12. Utilice la opción "MaskObjects" módulo asociar lisosomas de las células. Nombrar los objetos resultantes "Filtered Lisosomas".
13. Utilice la opción "MaskObjects" módulo para seleccionar las células que contienen colonias Coxiella. Nombrar los objetos resultantes "células infectadas".
14. Utilice el módulo "Relacionar objetos" para ajustar los objetos "ccvs filtradas" como hijos de los objetos de los padres "Células". Esto permitirá contar el número de CCV / célula.
15. Utilice el módulo "Relacionar objetos" para ajustar los objetos "Colonias filtradas" como hijos de los objetos padre "células". Esto harápermitir contando el número de colonias / célula.
16. Utilice el módulo "Relacionar objetos" para ajustar los objetos "Filtered Lisosomas" como hijos de los objetos de los padres "Células". Esto permitirá contar el número de lisosomas / célula.
17. Utilice el módulo "MeasureObjectSizeShape" para obtener un análisis morfológico de los núcleos, células, ccvs filtradas, Colonias filtradas y filtrada lisosomas
18. Utilice el módulo "MeasureObjectIntensity" para cuantificar la fluorescencia de GFP asociado con Filtered CCV y estimar la eficiencia de la replicación Coxiella dentro de CCV.
19. Utilizando los módulos "OverlayOutlines" y "SaveImages" superponer los resultados de la segmentación y la imagen original para el control de calidad.
20. Utilice el módulo "ExportToSpreadsheet" para exportar la totalidad o una selección de los resultados de análisis de imagen.
21. (Opcional) Utilice el módulo "ExportToDatabase" para analizar los resultadosutilizando el Analista CellProfiler software.

Análisis 7. Datos

1. Para cada parámetro obtenido, identificar y eliminar los valores atípicos (debido a errores en la segmentación de la imagen) y luego calcular los valores medios por cada mutante.
2. Utilice puntajes Z para identificar fenotipos significativos. Considere fenotipos con un Z-score> -2 como no significativa, fenotipos con una puntuación Z entre -2 y -4 tan suave y fenotipos con un Z-score ≤ -4 tan fuerte.
3. Combinaciones parcela de parámetros de acuerdo a las necesidades experimentales.

Resultados

Tras el aislamiento de mutantes de transposón, sola colonia cebador de PCR es un método robusto y de alto rendimiento para identificar el sitio de inserción del transposón para cada mutante. Este enfoque se deriva de un protocolo típico PCR anidada pero aquí un único cebador hibrida específicamente y / o no específicamente a la plantilla de ADN dependiendo de la rigurosidad de la temperatura de recocido (Figura 1A). Los productos típicos de PCR consisten en múltiples fragmentos de ADN, la mayoría de los cuales son específicos (Figura 1B). El uso de un cebador de secuenciación diferente que hibrida aguas arriba derecha de la ITR transposón, y aguas abajo de la secuencia reconocida por el cebador de amplificación proporciona especificidad para la etapa de secuenciación (Figura 1C). Software automatizado para el análisis de secuencias alinea las secuencias obtenidas en el genoma Coxiella proporcionar el sitio exacto del transposón inserciones (Figura 1C). Todas las inserciones de transposones pueden ser entonces annotated sobre el genoma Coxiella (Figura 1D).

Cada mutante Coxiella se aísla y se amplifica axénicamente en ACCM-2 medio antes de su almacenamiento o de detección. La Figura 2 ilustra un ejemplo de 38 mutantes de transposón en 16 puntos / icm genes Coxiella (Figura 2A). Para evaluar la viabilidad de los mutantes de Coxiella, curvas de crecimiento axénicos se obtienen mediante el muestreo de cultivos bacterianos durante 7 días después de la inoculación y aplicando el ensayo de concentración bacteriana se describe en 1.5 (Figurie 2B). Mutantes amplificados se incuban a continuación con las células epiteliales, por triplicado en placas de 96 pocillos durante 7 días. Todos los mutantes generados Coxiella siendo GFP-etiquetados, las curvas de crecimiento intracelular se obtienen mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de GFP de cada pozo, cada 24 horas, y el trazado de los valores medidos como una función del tiempo (Figura 2C).

Intrcurvas de crecimiento acelulares proporcionan un análisis cuantitativo de los fenotipos asociados con cada inserción del transposón en el genoma Coxiella. Para agregar información cualitativa sobre los mismos mutantes transposón, se optó por la adquisición de imágenes y análisis automatizado. Siete días después de la infección, las placas son fijos, procesado por inmunofluorescencia como se describe en 4 y se analizaron usando un microscopio de epifluorescencia automatizado como se describe en 5. automatizada de software de análisis de imágenes como CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.com ) procesa los canales adquiridos independientemente y segmentos identificados objetos para el análisis comparativo (Figura 3). Esto permite la identificación y caracterización morfológica de núcleos de células huésped, los contornos de células, lisosomas y Coxiella colonias (Figura 3 paneles superiores). La correlación de colonias Coxiella con las células y permite que los lisosomas identificatiy el análisis morfológico específico de Coxiella vacuolas -Con (que son LAMP1 positivo, Figura 3 panel inferior izquierdo). La correlación de colonias Coxiella con contornos célula huésped permite la identificación y el análisis morfológico específico de las células infectadas (Figura 3 panel central inferior). Por último, los 4 canales se combinan para fines de control de calidad y la ilustración (Figura 3 panel de abajo a la derecha).

Los datos obtenidos de análisis de imagen automatizado se pueden trazar uno contra el otro para obtener "gráficos de dispersión multi-fenotípicos". Como ejemplo, en la Figura 4A, el área media (en m ²⁾ de las colonias de Coxiella se representa gráficamente frente al número de colonias por célula (Figura 4A), con el fin de identificar mutaciones que afectan a la replicación intracelular de Coxiella (fenotipo de replicación) y / o la capacidad de las bacterias para invadir las células huésped (internafenotipo lización). Se utilizó el análisis estadístico para definir las regiones en el gráfico de dispersión resultante correspondiente a (-4 (Figura 4A, rosa y puntos rojos); mutaciones que afectaban internalización Coxiella en las células se agruparon en la parte inferior de la parcela (Figura 4A, azul claro y oscuro puntos) y, finalmente, puntos verdes en el extremo derecho de la región de la trama corresponden a mutaciones que resultan en fenotipos no significativas ( Z-score> -2). Es importante destacar que los mutantes que no logran replicar, pero todavía son capaces de invadir las células huésped, se detectan después de 7 días de la infección como bacterias individuales o pequeñas colonias, junto a la sede de los núcleos celulares (Figura 4C, segundo panel). Por lo tanto, el tamaño de Coxiella "coloempre- "se verá afectado de manera significativa, pero el número de células infectadas no variará en comparación con las células infectadas WT Coxiella. Por el contrario, las mutaciones que afectan a la capacidad de Coxiella para invadir las células huésped resultan en una disminución en el número de colonias / célula. Cuando este número es significativamente inferior a 1, indica que, en promedio, hay una disminución en el número total de células infectadas. Alternativamente, el área media (en m ²⁾ de las colonias de Coxiella puede registrarse en el número de células huésped sobrevivían a la infección (Figura 4B), para identificar mutaciones que confieren citotoxicidad para Coxiella (fenotipo citotóxico). Como el anterior, se utilizó el análisis estadístico para definir las regiones en el gráfico de dispersión resultante correspondiente a (-4 (Figura 3B puntos verdes). 37 mutaciones supervivencia de la célula huésped ligeramente afectada (Figura 3B, puntos rojos de luz), y 7 mutaciones fueron particularmente perjudiciales para el anfitrión de la supervivencia celular (Figura 3B, puntos de color rojo oscuro). Tenga en cuenta que los parámetros adicionales obtenidos por el procedimiento de análisis de imágenes automatizado se pueden utilizar para derivar otros apartados, de acuerdo a las necesidades experimentales.

Figura 1:. Secuenciación y anotación de los mutantes de transposón Coxiella (A) sola colonia cebador de PCR se utiliza para amplificar fragmentos de ADN que contienen el sitio de inserción del transposón. Un cebador de amplificación (Amp) se utiliza tanto como un cebador específico y no específico dependiendo de la rigurosidad de la temperatura de recocido. (B) Resultado Típico de colonia única cebador de PCR. Cada Reactien produce una serie de fragmentos de tamaño variable, algunos de los cuales contienen el sitio de inserción del transposón; algunos otros son amplificadas al azar como subproductos del ciclo de PCR de baja rigurosidad. (C) El uso de un cebador de secuenciación (SEC) que se hibrida con la secuencia de transposón permite la secuenciación de los fragmentos de interés. Software (D) Análisis de secuencias permite la anotación automática de transposón inserciones en el genoma bacteriano. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2:. Axénicas y crecimiento intracelular de mutantes transposón Coxiella (A) En la pantalla del piloto, hemos aislado, secuenciado y apantallado 38 mutantes transposón en 16 g núcleoenes del sistema de secreción dot / icm Coxiella (indican en rojo). (B) A fin de evaluar la viabilidad de cada mutante de transposón, el crecimiento de cada aislamiento en medio de cultivo axénicos se monitoriza durante 8 días utilizando un marcado con fluorescencia agente de intercalación de ADN. (C) Cada mutante se utiliza entonces para infectar a las células epiteliales. A medida que el transposón posee un cassette GFP, el crecimiento de bacterias intracelulares se controla más de 7 días de la infección siguiendo las variaciones de la fluorescencia de GFP asociada con la replicación Coxiella, utilizando un lector de microplacas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: automatizado de análisis de imágenes de infecciones Coxiella Un auto.microscopio de epifluorescencia acoplado se utiliza para la imagen 21 posiciones por pocillo por triplicado de placas de 96 pocillos. Los segmentos de software de análisis de imágenes de objetos en cada uno de los canales adquiridos para la cuantificación y el análisis. En todos los casos, se excluyen los objetos que tocan la frontera de las imágenes. (A) El canal de Hoechst se utiliza para identificar los núcleos de la célula huésped (en el círculo en verde). (B) Estos son utilizados como semillas para identificar los contornos de la célula huésped en el canal de Cy3 (la posición de los núcleos es un círculo en azul, los contornos celulares están en verde). (C) El canal de Cy5 se utiliza para identificar compartimentos LÁMPARA1-positivo (un círculo en verde); Sólo los objetos incluidos en los contornos celulares previamente identificados (en rojo) se conservan para el análisis de imágenes. (D) El canal de GFP se utiliza para identificar colonias Coxiella (en el círculo en verde). (E) correlacionar colonias Coxiella con compartimentos LÁMPARA1-positivo permite la identificación de Coxiella vacuolas -Con (CCV); Sólo los objetos incluidos en los contornos celulares previamente identificados (en verde) se conservan para el análisis de imágenes. (F) correlacionar colonias Coxiella con contornos celulares permite la identificación de células infectadas (pseudocoloreada). (G) Imágenes adquiridas en los 4 canales de fluorescencia (que corresponde a las colonias Coxiella (verde), núcleos de las células huésped (azul), membrana plasmática de la célula huésped (gris), compartimentos LÁMPARA1-positivo (rojo)) se fusionan y se utiliza para la ilustración y la calidad control. Escala de Barras 10 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: la identificación a gran escala de los factores que intervienen en Coxiella huésped / patógeno interactúaniones. (A) La zona media (en m ²⁾ de las colonias de Coxiella se traza contra el número relativo de colonias por células, para identificar de replicación y de internalización fenotipos de interés. Los puntos verdes representan fenotipos que se desvían de WT Coxiella por un Z-score> -2 (no significativo). Rosa y puntos azules claros representan replicación y de internalización fenotipos respectivamente, con una puntuación Z entre -2 y -4 (fenotipos leves). Puntos azules oscuros Roja y representan fenotipos con un Z-score ≤ -4 (fenotipos fuertes). (B) El área media (en m ²⁾ de las colonias de Coxiella se representó frente al número total de células (infectadas y no infectadas) que sobrevivieron 7 días de la infección para estimar el efecto citotóxico resultante de las inserciones de transposones. Los puntos verdes representan fenotipos que se desvían de WT Coxiella por un Z-score> -2 (no significativo). Los puntos rosados ​​representan ph citotóxicaenotypes con una puntuación Z entre -2 y -4 (fenotipos leves). Los puntos rojos representan fenotipos citotóxicos con un Z-score ≤ -4 (fenotipos fuertes). Las flechas indican mutantes ilustrados por la letra minúscula correspondiente en C. (C) Imágenes representativas de la replicación, la internalización y fenotipos citotóxicos. En todos los casos, los núcleos de células huésped están en rojo, Coxiella colonias son de color verde. Escala de Barras 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El estudio de las interacciones huésped / patógeno ha demostrado ser un método notable de entender infecciones bacterianas y desarrollar estrategias alternativas para contrarrestar las enfermedades infecciosas. Sin embargo, debido a la diversidad de estrategias elaboradas por diferentes patógenos bacterianos, la identificación y caracterización de factores de virulencia bacterianos y del huésped vías de señalización que están dirigidos durante las infecciones representan un verdadero desafío. Esto requiere el desarrollo de nuevos enfoques para la identificación a gran escala de los centros principales de interacción huésped / patógeno. El reciente desarrollo de innovadores, de alto rendimiento y técnicas de selección de alto contenido representa un recurso muy valioso que se puede adaptar al estudio de patógenos bacterianos intracelulares ^15. En este caso, hemos utilizado el zoonótica bacteriana Coxiella burnetii patógeno como modelo para desarrollar enfoques de cribado que combinan mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia. Importantly, este método de cribado permite la monitorización simultánea de múltiples pasos del ciclo intracelular Coxiella, proporcionando una visión global de las estrategias desarrolladas por esta bacteria invadir, replicarse y persistir en las células infectadas.

El método descrito aquí se basa en dos técnicas bien establecidas, mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia, que se han aplicado con éxito para el estudio de patógenos bacterianos. La combinación de estas técnicas en el contexto de las pantallas de alto rendimiento / alto contenido nos permite evaluar los efectos de un elevado número de mutaciones bacterianas mediante el análisis de un número muy elevado de eventos (típicamente 15.000 células infectadas por mutaciones bacterianas son fotografiados y analizados). Esto proporciona un importante análisis estadístico de eventos tales como la invasión bacteriana de las células huésped y la replicación intracelular, que son, por naturaleza, sujetos a una alta variabilidad. Es importante tener en cuenta que las líneas celulares distintas de epithelial se puede utilizar para este tipo de cribado. Sin embargo, las células epiteliales planas y grandes son óptimas para análisis de imagen como orgánulos de la célula huésped son más fáciles de detectar. Debido a que la mayoría de los microscopios automatizados puede manejar automáticamente un gran número de platos, prácticamente no hay límites para el número de mutantes que se proyectará simultáneamente. Dependiendo del patógeno, la lata usuario privilegio el uso de un epifluorescencia o un microscopio confocal. El tiempo de adquisición de la imagen dependerá sobre todo de la sensibilidad de la cámara microscopio, en el número de campos adquiridos por pocillo y en el número de canales adquiridos por campo de visión. El usuario puede decidir cómo ajustar estos factores para optimizar el protocolo de cribado. Como ejemplo, tenemos fotografiado uno de 96 pocillos placa / hr utilizando las condiciones indicadas en el punto 5.1. Análisis de la imagen depende en gran medida de la máquina (o grupo de máquinas) que se utiliza. Utilizamos un 12 núcleos (2 x 3.06 GHz 6-Core), estación de trabajo de RAM 48 GB. Esta máquina requiere aproximadamente 40 minutos para analizar las imágenes adquiridas de una placa.

Un aspecto importante a tener en cuenta en el desarrollo de estos ensayos es la puesta en marcha de nuevo (o la optimización de los existentes) protocolos para permitir la manipulación y el procesamiento de un gran número de muestras. Un ejemplo típico es el desarrollo del enfoque de PCR colonia único cebador, lo que nos permitió amplificar rápidamente y fragmentos de ADN Coxiella secuencia que contienen el sitio de inserción de cada transposón, desde muestras muy pequeñas. Basándonos en nuestra experiencia, la alta fidelidad de la polimerasa tiene que ser cuidadosamente seleccionados y probados a fin de obtener resultados reproducibles. La única limitación de este enfoque puede ocultar en la observación de que, en la mayoría de los casos, aproximadamente el 30% de las muestras procesadas no son explotables, ya sea debido a la PCR o los pasos de secuenciación. Sin embargo, teniendo en cuenta que el aislamiento de nuevos mutantes de transposón Coxiella no es un paso limitante de la velocidad, esto no repreenviado un problema importante. Del mismo modo, el desarrollo de un ensayo fiable para cuantificar la concentración bacteriana de las poblaciones de mutantes ha sido clave para este enfoque. Debido a la tendencia de Coxiella a agregarse cuando en suspensión, el uso de lecturas de densidad óptica no es aplicable para calcular la concentración de las culturas Coxiella y la única alternativa existente era PCR cuantitativa (qPCR). Aquí, el uso de un agente de intercalación de ADN marcado con fluorescencia aceleró significativamente bacterias cuantificación.

Este enfoque también puede tomar ventaja de la utilización de líneas celulares estables que expresan marcadores fluorescentes para varios compartimentos intracelulares dependiendo del patógeno utilizado. Otro aspecto importante es el uso de medios de cultivo celular exento de rojo de fenol. Hemos observado que este indicador de pH tiene una fluorescencia natural que abarca el espectro rojo y verde que satura la señal grabada en el lector de fluorescencia automatizado.

Tél estrategia que aquí se presenta se basa en la mutagénesis de transposones azar. Para los mutantes de interés, se recomienda validar transposiciones únicos (y clonalidad) mediante Southern blot y PCR amplificaciones de la zona de inserción del transposón.

Además de los equipos descritos en la sección de protocolo, equipos interesados ​​en utilizar el enfoque de selección que aquí se presenta, se llevarán una gran ventaja en la puesta en marcha de una base de datos relacional para la recopilación de datos, un servidor de almacenamiento de datos y una estación de trabajo para el análisis de imágenes rápida.

Es importante destacar que el método aquí descrito es adecuado para el estudio de otros patógenos bacterianos intracelulares siempre que exista un método de mutagénesis aleatoria para el patógeno, las líneas celulares pueden ser infectadas por el patógeno y éste muestra un fenotipo específico durante la infección.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citric acid	Sigma	C0759-500G	ACCM-2 medium component
Sodium citrate	Sigma	S4641-500G	ACCM-2 medium component
Potassium phosphate	Sigma	60218-100G	ACCM-2 medium component
Magnesium chloride	Sigma	M2670-100G	ACCM-2 medium component
Calcium chloride	Sigma	C5080-500G	ACCM-2 medium component
Iron sulfate	Sigma	F8633-250G	ACCM-2 medium component
Sodium chloride	Sigma	S9625-500G	ACCM-2 medium component
L-cysteine	Sigma	C6852-25G	ACCM-2 medium component
Bacto Neopeptone	BD (Beckton-Dickinson)	211681	ACCM-2 medium component
Casamino acids	BD (Beckton-Dickinson)	223050	ACCM-2 medium component
Methyl-B-Cyclodextrin	Sigma	C4555-10G	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax	Gibco	61870-010	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax, without phenol red	Gibco	32404-014	For cell culture and infection
Fetal Bovine Serum	GE healthcare	SH30071	For cell culture
Trypsin EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056	For cell culture
Saponin	Sigma	47036	For immunofluorescence staining
Ammonium chloride	Sigma	A9434	For immunofluorescence staining
Bovine Serum Albumine	Sigma	A2153	For immunofluorescence staining
Electroporation cuvette 0.1 cm	Eurogentec	ce0001-50	For Coxiella transformation
Trackmates screw top tubes with caps	Thermo Scientific	3741	2D barcoded screwcap
96-well microplate with black walls and bottom	Greiner	655076	Flat dark bottom, for dsDNA quantitation
96-well microplate, ��clear, black walls	Greiner	655090	Flat transparent bottom, for cell culture and imaging
96-well PCR microplate	Biorad	2239441	DNAse/RNAse free
96-well plate, Deepwell	Labcon	949481	For Coxiella mutants infections
PicoGreen	Life Technologies	P7581	For dsDNA quantitation
Triton X-100	Sigma	T9284-500ML	For dsDNA quantitation
Phusion High fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L	For single primer colony PCR
Celltracker Red CMTPX	Life Technologies	C34552	For imaging
Anti-LAMP1 antibody	Sigma	94403-1ML	For immunofluorescence staining
Hoechst 33258	Sigma	L1418	For imaging
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro	Tecan
Epifluorescence automated microscope Cellomics	Thermo Scientific