Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Özet

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Özet

Invasion ve bakteriyel patojenlerin konakçı hücrelerin kolonizasyonunun bozmak ve temel bir konak işlevlerini manipüle virülans faktörü olarak tanımlanan prokaryotik proteinleri, çok sayıda, aktivitesine bağlıdır. Ev sahibi / patojen etkileşimlerinin araştırılması bakteriyel enfeksiyonların anlamak ve bulaşıcı hastalıkların karşı alternatif stratejiler geliştirmek için bu nedenle son derece önemlidir. Bu yaklaşım, ancak bakteriyel virülans belirleyicileri tarafsız, otomatik tanımlama ve karakterizasyonu için yeni yüksek verimli tahlillerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, transpozon mutagenezi ile GFP etiketli mutant kütüphanesi oluşturulması için bir yöntem tarif ve yüksek içerik tarama gelişimi çok sayıda transpozon ilişkili fenotip eşzamanlı belirlenmesi için yaklaşımlar. Bizim çalışma modeli se ile ilişkili hücre içi bakteri patojen Coxiella burnetii, zoonoz Q ateşi etiyolojik ajandırvere bir sonucu sağlık ve ekonomik yük ile salgınlar. Bu patojenin zorunlu hücre içi doğası, son zamanlara kadar, ciddi Coxiella yüksek verimlilik / yüksek içeriği yaklaşımların uygulanması için ideal bir model haline ana patojen etkileşimlerinde karıştığına bakteriyel faktörlerin tanımlanmasını engellemiştir.

Giriş

gelişmekte olan, endemik bakteri Coxiella burnetii Q ateş, şiddetli sağlık ve ekonomik etkisi ¹ ile zayıflatıcı grip benzeri zoonoz büyük salgınlar sorumludur. Coxiella ana rezervuar iç ve çiftlik hayvanları, ve ABD'de süt sığırı% 90'dan fazla C taşıdıkları tahmin ediliyor ² burnetii. İnsanlar kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla bulaşmış yanlışlıkla ana vardır. İnsan Q humması tezahür ya% 65 ^1,3 ulaşan mortalite oranı ile ölümcül komplikasyonların olabileceğini akut veya kronik hastalığı gibi. 1 bir enfeksiyon dozu ile - 10 organizmalar, Coxiella bilinen en bulaşıcı patojen ve potansiyel bir biyo silah ⁴ olarak araştırılmıştır. Hollanda (2007 - 2010) Q ateşi son patlayıcı salgını vakası yılda fazla 2,000 182 tırmanan ile, bu patojenin ciddi virulans bir örnek olarak duruyor^5.

Coxiella enfeksiyonlarının dikkate değer bir verimi büyük olasılıkla konakçı hücreler için eşsiz uyum ile birlikte çevresel strese karşı direnci ile ilişkilidir. Gerçekten de, Coxiella çok sert koşullar (kuruma, sıcaklık, vs.) önemli ölçüde dirençli olan metabolik olarak aktif olmayan küçük hücreli varyantları (SCV) şeklinde bir ortamda bulunmaktadır. Fagositik olmayan hücreleri istila Coxiella yapışması / istila OmpA ⁷ ve henüz tanımlanmamış reseptörün aracılık ederken SCVs kadar ₃ integrinler ⁶ β α _V ile fagositik hücreler tarafından alınır. Alımı takiben, Coxiella Rab5 ve EEA1 ⁸ erken endozomal belirteçleri için pozitif dar vakuollerin, yaşıyor. Bakteriler Dot / Icm tip 4 salgı sistemini (T4SS) ⁹ metabolik olarak aktif büyük hücreli çeşitleri (LCVs) dönüştürme ve aktive ederek endozomal asitlenme cevapLegionella pneumophila ^10'dakine yüksek ölçüde homolog. Nokta / ICM efektör salgılanması Coxiella bakteri gelişirler ve aktif apoptozis ¹¹ enfekte hücreleri korumak aktif lızozomal enzimleri ihtiva eden büyük bir LAMP1 pozitif asidik bir bölme oluşturmak için izin verir. Bu nedenle, Coxiella hücre içi döngüsü bakteriyel efektörlerinin ¹² Nokta / Icm-aracılı translokasyonu ile kontrol edilir, ancak konakçı hücre istilası, bakteriyel replikasyonu ve enfeksiyonunun yayılması yer mikrobiyal faktörler büyük ölçüde bilinmemektedir.

Ev sahibi hücre içinde 1) içselleştirme, 2) hücre içi çoğaltma, 3) hücreden hucreye yayılma: transposon mutagenez ve floresans-esaslı tahliller birleştirerek, Coxiella enfeksiyonlarının ana adımları yer bakteriyel faktörlerinin eş zamanlı olarak tanımlanması için tarafsız yaklaşımlar geliştirmektedir ve 4) sebat. Bugüne kadar, 1000 m üzerinde ekranlıCoxiella patogenezi ⁷ düzenleyen konak-patojen etkileşimleri içine görülmemiş anlayışlar bize sağlanan 500 Coxiella kodlama dizilerinde utations. Dikkat çekici bir şekilde, bu yaklaşım Coxiella hücre biyolojisi özellikleri paylaşan diğer hücre içi patojen çalışmaya uygulanabilir.

Protokol

GFP etiketli Coxiella transpozon mutant bir kütüphane 1. Üretim

Yerel kurallara uygun olarak bir mikrobiyal güvenlik kabini (MSC) bir biyogüvenlik tutma seviyesinde 2 (BSL-2) 'de Coxiella burnetii RSA439 NMII işleyin. Kullanılan bakteri modeliyle uyumlu değilse, 1.4.1 den 1.4.4 için tekrar adımları klonal mutantlar elde etme olasılığını artırmak için. Tipik bir mutant kütüphanesi oluşmaktadır (en azından) kullanılan organizmanın genomuna açıklamalı kodlama dizilerinin üç kat sayısına eşit olan mutant bir dizi.

1. Elektro Coxiella RSA439 NMII hazırlanması:
   1. 13.4 mM sitrik asit, 16.1 mM sodyum sitrat, 3.67 mM potasyum fosfat, 1 mM magnezyum klorür, 0.02 mM kalsiyum klorid, 0.01 mM, demir sülfat, 125.4 mM sodyum klorid, 1.5 mM L-sistein, 0.1 g: 1x ACCM-2 ¹³ hazırlama / L Bacto Neopeptone, 2.5 g / L kasamino asitleri, 1 g / L metil beta-siklodekstrin, 125 ml / L RPMI. 4.75 ve filtre sterilize (otoklav yoktur) pH ayarlayın. Not: Sıvı ACCM-2, yaklaşık 1 ay için 4 ° C'de stabildir.
   2. -80 ° C stoktan (daha önce üretilir ve adım 1.5 olarak ölçülmüştür bakteriyel stoktan), 2 x 10 ⁶ genom eşdeğerine (GE) Coxiella RSA439 NMII / ml ile ACCM-2 100 ml inoküle ve 75 bakteriyel süspansiyonun dağıtma (- şişesi başına bakteriyel süspansiyon 15 ml 10) Bacalı kapakları cm ² hücre kültürü şişeleri. % 5 _CO2 ve% 2.5 O ₂ nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C 'de 7 gün boyunca büyütün.
   3. 4 ° C 'de 1 saat süre ile 3900 x g de elde edilen bakteriyel 50 ml tüpler içinde süspansiyon ve santrifüj havuz.
   4. Süpernatant atılır ve% 10 gliserol, 30 ml pelletini. 4 ° C 'de 1 saat süre ile 3900 x g'de santrifüjleyin.
   5. % 10 gliserol (tipik olarak 2 mi) ve kısım 500 ul tüplerde 50 ul yeterli bir hacimde pelletini. Yeniden süspanse b tutuntüm süreç boyunca buz üzerinde Ancak bakteriler. Not: Bu aşamada, bakteri elektro ve tek bir kısım, bir elektroporasyon uygulamak için yeterlidir. Bakteri süspansiyonları, 6 ay boyunca -80 ° C 'de muhafaza edilebilir veya doğrudan plasmid DNA'nın elektroporasyon için kullanılabilir.
2. Transposon- transposaz kodlayan plazmid ile yetkili Coxiella Elektroporasyon:
   Not: Aşağıdaki protokol, transpoze edilebilir eleman transposaz (sırasıyla, pITR-CAT-GFP ve pUC19-Himar1C9), iki farklı plazmit ile kodlanır ^7. Coxiella elektroporasyona olduğunda Her iki plazmit olanağına intihar plasmidleri yapma, Coxiella özgü replikasyon orjinini barındırmamaktadır. Bu dengeli transpozon eklemeleri sağlamaktadır. transpoze eleman seçimi için Coxiella promotör p1169 ve GFP ile oluşturulan mutantlar etiketlemek için Coxiella promotör P311 düzenlemesi altında GFP geninin düzenlemesi altında bir Kloramfenikol direnci kasetini içermektedir.
   1. PrBuz üzerinde 10 dakika boyunca bir 0.1 cm elektroporasyon küvetine E-soğutun. 50 10 ug transposon plazmid ile elektrokompetan Coxiella ul transposaz plazmid ⁷ 10 mikrogram karıştırın. Plazmid konsantrasyonu, gliserol seyreltme en aza indirmek için daha yüksek, 500 ug / ml olduğundan emin olun.
   2. Aşağıdaki kurulumu kullanarak electroporate: 18 kV, 500 Ω, 25 jxF. Elde edilen zaman sabiti 9 ve 13 milisaniye arasında oluşan olduğundan emin olun.
   3. Hemen, RPMI 950 ul ekleyin Electroporated bakterileri tekrar süspansiyon ve vida kapaklı tüp transfer ve oda sıcaklığında tutun.
   4. Elektroporasyona bakterilerin 200 ul alın ve 6-delikli plakalara% 1 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş ACCM-2 3 ml ekle. Elektroporasyona bakteri geriye kalan hacim DMSO içinde 88 ul ekle -80 ° C de depo (% 10 DMSO nihai konsantrasyona ulaşmak için).
3. Transpozon mutantlarının seçimi:
   1. Doğmuş iyileşmesinite,% 5 _CO2 ve% 2.5 O ₂ nemli bir atmosferde gece boyunca 37 ° C 'de (1.2.4), yukarıda tarif edildiği gibi inoküle 6 oyuklu plakalar. Uygun antibiyotik ekleyin (375 ug / ml kanamisin ya da 3 | ig / ml kloramfenikol). Yukarıda tarif edilen şartlar altında 3 gün daha bakteri kültürü inkübe edin.
4. Tek tek mutantlann izole edilmesi:
   1. Coxiella transpozon mutantlarının bir katı ACCM-2 plakalarının hazırlanması ile kaplama
      Not: Aşağıdaki talimatlar 1 Petri kabı için, bakteri kültürlerinin çeşitli seyreltmeleri koloni izolasyonu için en uygun aşılama hacmi değerlendirmek için test edilmesi gerekir vardır.
      1. Bir mikrodalga agaroz 10.5 ml% 0.5 Isı ve 55 ° C su banyosunda soğumasını bekleyin. 37 ° C'de (pH 4.75) 2x ACCM-2 11.25 ml ısıtın.
      2. Alt agaroz hazırlayın:
         1. Uygun antibiyotik agaroz 2x ACCM-2 10 ml eritilmiş% 0.5 10 ml karıştırın ve ekleme (375 ug / ml kanamisin ya da 3| ig / ml kloramfenikol).
         2. Petri kabı içine hemen dökün. 30 dakika karıştırıldı ve havada kurumaya 20 dakika boyunca orta soğuması, Petri tabağı unlidded tutun.
      3. Üst agaroz hazırlayın:
         1. Uygun antibiyotik (375 ug / ml kanamisin ya da 3 | ig / ml kloramfenikol) ekleyin ve 37 ° C'de inkübe, 5 ml'lik bir polistiren tüp içinde su, 0.75 ml 2x ACCM-2 1.25 ml karıştırın.
         2. 5 saniye için bakteri kültürü (tipik olarak 1 ul ila 100) ve vorteks ekleyin.
         3. Erimiş agaroz 0.5 ml ekleyin karıştırın ve hemen alt agaroz dökün.
         4. 20 dakika agaroz katılaşmasını sağlamak için, 20 dakika boyunca soğumaya Petri kabı kapağı yerine takın ve 4 ° C'de inkübe izin verin.
         5. Bir MSC unlidded 20 dakika boyunca hava kuru. 6-7 gün için% 5 _CO2 ve% 2.5 O ₂ nemli bir atmosferde 37 ° C'de plakalar büyütün.
   2. Geri kalan bakteriler DMSO ekleyınamacıyla l kültürler, -80 ° C'de, bir son% 10 DMSO konsantrasyonu ve mağaza ulaşmak için.
   3. Aşağıdaki gibi optimum seyreltme değerlendirin: koloniler çapı 0.5 ile 1 mm ve düzgün çapraz bulaşmayı önlemek için izole olduğundan emin olun. 1.4.1.2 Bir ve 1.4.1.3 de anlatıldığı gibi ACCM-2 agar uygun seyreltme noktaya 1.4.2 ve plaka bakteri kültürleri kalan çözülme. 1.4.1.3.5 tarif edildiği gibi 6-7 gün süreyle inkübe edin.
   4. Koloniler saptanabilir kez, 1 ml ucu ucuna kesme fişi toplama izole kolonilerini içeren ve ACCM-2 1.5 ml uygun antibiyotik içeren (375 ug pipetleme koloni dağıtarak onları toplamak / ml kanamisin veya 3 mg / 24 oyuklu bir plaka içerisinde ml kloramfenikol). 1.3.1 tarif edilen koşullar 6 gün boyunca ayrı ayrı koloniler yükseltin. Inkübasyon 3. günde, her kültür pipetleme bakteriyel kümeleri dağıtmak.
   5. 10 96-yuvalı plakalar içinde 2D barkod screwcap tüplerde Her mutant süspansiyonu Mağaza-80 ° C de,% DMSO.
5. Bakteriyel konsantrasyon Değerlendirilmesi:
   Not: Aşağıdaki protokol, aksenik ortam içinde replike bakteriyel mutantlann (1.4.4 bakınız) büyüme eğrileri elde etmek için uygulanabilir.
   1. Standart eğri hazırlama:
      1. DsDNA bir 2 ug / ml stok çözeltisi 1x Tris-EDTA (TE) içinde (bilinen boyut ve konsantrasyon tipik olarak rastgele bir plazmid) hazırlayın. 2 ug / ml ile 2 ng / ml arasındaki konsantrasyonlar elde etmek üzere stok çözeltisinden 10-kat seri dilüsyonları hazırlayın. Siyah duvarlar ve bir tabana sahip 96 oyuklu mikro-tek oyuklara Her konsantrasyondan 50 ul koyun (Malzeme Tablo).
      2. 1X TE tampon maddesi içinde 200 ve 96 çukurlu bir mikrolevhadaki her bir örnek için seyreltik çözelti 55 ul: dsDNA niceleme reaktifi 1 seyreltin. İyice karıştırın, bir plaka karıştırıcısı kullanılarak ve karanlıkta, oda sıcaklığında 2 ila 5 dakika boyunca inkübe edin.
      3. Bir floresan kullanan örnekler floresan ölçünStandart floresein dalga boylarında (uyarma ~ 480 nm, emisyon ~ 520 nm) için nce mikroplak okuyucu ve filtreler.
      4. Floresan yoğunluğu okumaları karşı plazmid konsantrasyonu aralığı çizilir.
   2. Bakteriyel süspansiyon kantitatif:
      1. Siyah duvarlar ve bir tabana sahip 96 oyuklu bir mikro-içinde% 10 Triton X-100, oyuk başına 5 ul koyun (Malzeme Tablo). Bir plaka karıştırıcısı üzerinde, her bir kuyu için bakteriyel süspansiyonların 50 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
      2. 1X TE tampon maddesi içinde 200 ve 96 çukurlu bir mikrolevhadaki her bir örnek için seyreltik çözelti 55 ul: dsDNA niceleme reaktifi 1 seyreltin. İyice karıştırın, bir plaka karıştırıcısı kullanılarak ve karanlıkta, oda sıcaklığında 2 ila 5 dakika boyunca inkübe edin.
      3. Standart floresein dalga boylarında (uyarma ~ 480 nm, emisyon ~ 520 nm) bir floresan mikroplaka okuyucu ve filtreleri kullanarak örnekleri floresan ölçün.
      4. Bakteriyel DN edinmek içinBir konsantrasyon, nokta 1.5.1.4 elde edilen grafikte floresan okumaları arsa. Bakteriyel konsantrasyonlar elde etmek Coxiella genomunun (2.2 fg) kütlece DNA konsantrasyonu bölün. Genom Eşdeğer / ml sonuçları ifade eder.
      5. ACCM-2'de önemli bir büyüme sergileyen kusur atın mutantlar.

2. Tek Primer Colony PCR Sıralama ve Ek Açıklama

Not: Aşağıdaki protokol 96 numune DNA amplifikasyonu için, çok kanallı bir pipet, aşağıdaki adımları için tavsiye edilir. Bir transpozon özgü primer (2.3) ile birlikte manyetik boncuklar ve DNA dizilemesi kullanılarak, PCR ürünlerinin sütun saflaştırma işleminin başka bir şirket devredilmesi söz konusu.

1. Yükseltme primeri Coxiell ilgili transpozon ekleme yeri kapsayan PCR ürünleri elde etmek için ters tandem tekrar (ITR), yukan 100 ve 200 baz çifti arasında melezleşme için tasarlanmış olduğundan emin olunBir genom. 3 PCR karışımı ml (1 x yüksek doğrulukta tampon, 200 uM dNTP, 1 uM amplifikasyon primeri, 20 U / ml, yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı) hazırlayın ve buz üzerine yerleştirilmiş bir 96-çukurlu PCR plakasında kuyucuk başına 29 ul dağıtın. Aktarım PCR karışımına ACCM-2 durağan faz, her mutantın 1 ul.
2. Başlangıç ​​denatürasyon ile çalıştırın PCR (98 ° C, 1 dakika), 20, yüksek sertlikteki çevrim (98 ° C, 10 saniye; 50 ° C, 30 saniye; 72 ° C, 90 sn), 30, düşük sertlikteki çevrim (98 ° C, 10 saniye; 30 ° C, 30 saniye; 72 ° C, 90 saniye) ve 30 yüksek sertlikteki çevrim (10 sn 98 ° C; 50 ° C, 30 saniye; 72 ° C, 90 saniye), 72 ° C'de son uzatma ve ardından 7 dakika süreyle ° C.
3. Bir transpozon-özgü primer ile manyetik boncuklar ve dizi DNA kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır. 50 ° C ve 75 ° C'de,% 40 ve% 60 arasında bir GC içeriğine, 18 ve 25 nükleotid ve tavlama si arasında bir uzunluk arasında bir tahmin erime sıcaklığına sahip transpozon özgü primer tasarımıTranspozon ITR ilk baz çiftinin yukarı te amplifikasyon astar melezleme sitenin aşağı ve en az 100 baz çifti.
4. Dizi analizi yazılımı kullanarak, Coxiella burnetii 493 NMI tam açıklamalı genom yükleyin. Yük ve (blastn) sıralama sonuçlarını hizalayın ve aktarılması siteyi belirlemek için "align referans" işlevini kullanın. Olmayan eşleme ve / veya çift reads.To mutant kütüphane doygunluk izlemek görüntüleme ile mutantlar atın, aynı sitede birden transposon eklemeleri geçtiği bir kaydını tutmak.

3. Ökaryotik Hücreler Coxiella Mutants ve hücre içi Büyüme İzleme ile meydan

Not: bir çok kanallı pipet, aşağıdaki adımları için tavsiye edilir. Enfeksiyonlar siyah duvarlar ve düz, şeffaf dipli mikro steril 96 oyuklu üç kez yapıldı. w GFP ¹⁴ ifade wt Coxiella burnetiiDr Robert Heinzen tarafından sağlanan.

1. Antibiyotik yokluğunda% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş fenol kırmızısı (RPMI ortamı tam) olmadan RPMI Vero hücreleri büyütün.
2. enfeksiyonun bir gün önce, 10 ml PBS ile birleşene veya alt konfluent hücre kültürü şişesine Vero hücreleri yıkayın.
3. Hücre kültürü şişesine tripsin EDTA çözeltisi 1 ml ekleyerek Vero hücreleri çıkarın ve% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C'de 3 ila 5 dakika boyunca inkübe edin.
4. Tam RPMI ortamı içinde, 10 ml içinde süspanse hücreleri. Hücre sayımı ve ml başına 10 ⁵ hücre, bir hücre süspansiyonu hazırlanır.
5. Düz, şeffaf dipli, siyah 96 oyuklu plakanın her bir hücre süspansiyonu, 100 ul koyun.
6. Oda sıcaklığında, 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje kuyu altındaki hücre yapışmasını kolaylaştırır ve% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe etmek.
7. Co ihtiva eden 96 oyuklu plakalar çözülmeoda sıcaklığında xiella mutantlar ve derin 96-oyuklu bir plaka içerisinde, fenol kırmızı ve FBS'siz RPMI 300 ul bakteri süspansiyonuna 150 ul seyreltilir.
8. Vero hücreleri ihtiva eden mikro-ortamı çıkarın ve 100 ul / oyuk seyreltilmiş Coxiella mutantları (100 MOI) dağıtmak. Pozitif kontroller (ağırlık Coxiella 100 ve 200 enfeksiyon (MOI) bir çokluklar GFP ¹⁴ ifade ile enfekte edilmiş hücrelerde) halinde (non-enfeksiyonlu hücreler), kontrol ve oyuklar, A2 ve A3 negatif hem de A1 kullanımı.
9. Bir aerosol geçirmez santrifüj plakası tutucu kullanarak oda sıcaklığında 400 x g'de 10 dakika boyunca plaka santrifüjleyin.
10. Daha sonra 100 ul / oyuk taze, tam RPMI ortamı ile orta bakteri içeren yerine 2 saat boyunca% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edilir.
11. Standart floresein dalga boylarında (uyarma ~ 480 nm, emisyon ~ 520 nm) bir floresan mikroplaka okuyucu ve filtreleri kullanarak 7 gün GFP floresan gün ölçün. Kaçınmakparazit kültür ortamında yoğunlaştırma ve sinyal dispersiyon, mikroplaka okuyucusu üzerinde taban eksitasyon ve emisyon kayıt kullanımı nedeniyle.

Otomatik Image Acquisition için Numunelerin 4. hazırlanması

Prosedür, bir 96-çukurlu plaka için buna göre hacimleri büyütmek: edin. 4.2 basamaklar bir tabak yıkayıcı yararlanabilir.

1. ^7. günlük enfeksiyondan üzerinde plakadan orta kaldırmak ve genelde 1 uygun bir seyreltme (bir hücre geçirgen floresan boya ihtiva / oyuk taze tam ortam, 50 ul ile değiştirin: kullanılan hücre hattına göre optimize edilmesi için, 1000 ). % 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C'de 60 dakika - 30 hücreleri inkübe edin.
2. Sonra PFA-içeren tampon çıkarın ve 3 kez PBS ile yıkayın, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca inkübe edin / göz% 4 paraformaldehid 50 ul PBS (PFA) ile orta yerine.
3. PBS ve dispens kaldırE 50 ul / oyuk,% 0.05 saponin ile takviye çözeltisi (% 0.5 inek serum albümini, PBS içinde 50 mM _NH4CI, pH 7.4) ile bloke. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
4. : 500 oranında seyreltilmiş 40 ul / oyuk (yukarıdaki gibi) saponin ile desteklenmiş taze bloke solüsyonu ile ve 1 de bir anti-LAMP1 antikoru ile bloke çözeltisi değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca plaka inkübe edin.
5. Bloke etme çözeltisi çıkarın ve 100 ul / oyuk PBS ile 96 oyuklu plaka 5 kez yıkayın.
6. Dağıtın 40 / oyuk (1 dilusyondaki: 1000) (yukarıdaki gibi) saponin ile takviye edilmiş çözelti, uygun bir floresan etiketli ikincil antikor bloke ul adımında 4,4 uygulanan anti-LAMP1 antikor ortaya çıkarmak için ve 5 ug Hoechst 33258 ile / ml olmuştur. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca plaka inkübe edin.
7. Bloke etme çözeltisi çıkarın ve 100 ul / oyuk PBS ile 96 oyuklu plaka 5 kez yıkayın. Sabitlenen hücreler kurumaz gerektiği gibi, 96-çukurlu plaka içindeki son yıkama tekabül eden PBS hacmi bırakın.
8. Görüntü daha sonra analiz için ışıktan korumalı 4 ° C 'de hemen levha veya mağaza levha,.

5. Görüntü Alma

1. Epifloresans otomatik mikroskop kullanılarak 33258 (350 nm, konakçı hücre çekirdekleri), kırmızı (~ 555 nm, hücre zarı işaretleyici) ve uzak kırmızı (~ 615 nm, LAMP1) kanalları donanımlı GFP görüntüleri (488 nm, bakteriler), Hoechst Edinme 20X amacı ile. Görüntü için, numune başına 5000 hücre, oyuk başına en az 21, bağımsız alanları elde edin. Bir referans olarak, konakçı hücre çekirdekleri kanalı kullanarak otomatik odaklama uygulanır. Bakteriyel patojenler konakçı hücrelerin düşük bir yüzde enfekte ile çalışırken, kullanıcı analiz etmek için 500 enfekte hücrelerin en az elde edilmesi amacıyla, yuva başına görüntülü bağımsız alanların sayısını ayarlayabilir.

6. Görüntü İşleme

Not: Aşağıdaki adımlar görüntü analiz yazılımı CellProfiler kullanımı için spesifiktir. Tüm durumlarda, en uygun algoritbölümleme hm deneysel olarak tanımlanmış olması ve görüntünün sınır dokunmadan nesneleri uygun fonksiyonu ile giderilmelidir.

1. CellProfiler tüm görüntüleri yükleyin.
2. Aşağıdaki adımlarda konakçı hücre çekirdekleri olarak (aynı zamanda Hoechst tarafından etiketlenmiştir) Coxiella kolonilerin saptanmasını önlemek için, Hoechst kanalından GFP kanalı çıkarma modülü "ImageMath" kullanın.
3. Adım 6.2 ortaya çıkan görüntüden bölüm konak hücre çekirdekleri modül "IdentifyPrimaryObjects" kullanın. Parçalı nesneleri "Çekirdekler" olarak adlandırın.
4. Tohum olarak adım 6.3 tespit çekirdekleri kullanılarak 555 nm görüntülerden bölüm konak hücrelerine modül "IdentifySecondaryObjects" kullanın. Parçalı nesneler "Hücreleri" olarak adlandırın.
5. (İsteğe bağlı) aşama 6.4 tespit hücrelerden adım 6.3 tespit çekirdekleri çıkarmak için modülü "IdentifyTertiaryObjects" kullanın. Parçalı nesneleri Adı "Sitoplazma221 ;.
6. Arka planı kaldırmak ve LAMP1 pozitif bölmeden aşağıdaki belirlenmesini kolaylaştırmak için 615 nm görüntülerde modülü "EnhanceOrSuppressFeatures" kullanın.
7. LAMP1 pozitif bölmeler tanımlamak için adım 6.6 elde resmin üzerine modülü "IdentifyPrimaryObjects" kullanın. Parçalı nesneler "lizozomlara" olarak adlandırın.
8. Coxiella kolonileri tanımlamak için 488 nm resmin üzerine modülü "IdentifyPrimaryObjects" kullanın. Parçalı nesneleri "Kolonileri" olarak adlandırın.
9. Tohum olarak adım 6.8 tespit Coxiella kolonileri kullanarak Coxiella içeren vakuoller belirlemek için 615 nm görüntülerde modülü "IdentifySecondaryObjects" kullanın. Parçalı nesneleri "CCVS" olarak adlandırın.
10. (Görüntünün sınır dokunmadan hücreleri ortadan kaldırılmıştır gibi bazı CCVS "dışarıda" hücreler tespit edilebilir) hücreleri üzerinde algılanan CCVS seçmek için modül "MaskObjects" kullanın. Res Adıulting "Filtreli CCVS" nesneleri.
11. (Görüntünün sınır dokunmadan hücreleri ortadan kaldırılmıştır gibi bazı Kolonileri "dışarıda" hücreler tespit edilebilir) hücreleri üzerinde algılanan Koloni seçmek için modül "MaskObjects" kullanın. Ortaya çıkan nesneleri "Filtreli Kolonileri" olarak adlandırın.
12. Hücrelere lizozomlar ilişkilendirmek modül "MaskObjects" kullanın. Ortaya çıkan nesneleri "Filtreli Lizozomlar" olarak adlandırın.
13. Coxiella kolonileri içeren hücreleri seçmek için modül "MaskObjects" kullanın. Ortaya çıkan nesneleri "Enfekte Hücreler" olarak adlandırın.
14. Modülünü kullanın ebeveyn nesneleri "Hücreler" çocuklar gibi nesneleri "Filtreli CCVS" ayarlamak "Nesneler ilişkilendirin." Bu CCVS / Hücre sayısını sayarak sağlayacaktır.
15. Modülünü kullanın ebeveyn nesneleri "Hücreler" çocuklar gibi nesneleri "Filtreli Kolonileri" ayarlamak "Nesneler ilişkilendirin." Bu iradeKoloniler / hücre sayısının sayılmasıyla sağlar.
16. Ebeveyn nesneleri "Hücreler" çocuklar gibi nesneleri "Filtreli Lizozomlar" ayarlamak "Nesneler Relate" modülünü kullanın. Bu Lizozomlar / Hücre sayısını sayarak sağlayacaktır.
17. Çekirdekler, Hücreler, Filtreli CCVS, Filtreli Kolonileri ve Filtreli lizozomlarda bir morfolojik analizini elde etmek için modül "MeasureObjectSizeShape" kullanın
18. Filtreli CCVS ile ilişkili GFP floresan ölçmek ve CCVS içinde Coxiella çoğaltma verimliliğini tahmin etmek modülü "MeasureObjectIntensity" kullanın.
19. Modüller "OverlayOutlines" ve "SaveImages kullanılması" segmentasyon sonuçları ve kalite kontrolü için orijinal görüntü bindirme.
20. Tamamını veya bir görüntü analiz sonuçlarının bir seçim ihracat modülü "ExportToSpreadsheet" kullanın.
21. (İsteğe bağlı) sonuçlarını analiz modülü "ExportToDatabase" kullanınYazılım CellProfiler Analyst kullanılarak.

7. Veri analizi

1. Her bir parametre elde için, tanımlamak ve sonra da mutant başına ortalama değerlerini hesaplamak (nedeniyle görüntü segmentasyonu hatalara) aykırı ortadan kaldırır.
2. Önemli fenotipleri tanımlamak için Z-skorları kullanın. > Z-skoru fenotipleri düşünün -2 anlamlı olmayan gibi bir Z-skoru ≤ -4 kadar güçlü -2 ve -4 gibi hafif ve fenotip arasındaki Z-skoru ile fenotip.
3. Deneysel ihtiyaçlarına göre parametrelerin arsa kombinasyonları.

Sonuçlar

Transposon mutantların izolasyonu üzerine, tek primer koloni PCR her mutant için transpozon yerleştirme siteyi belirlemek için sağlam, yüksek verim yöntemidir. Bu yaklaşım, tipik bir iç içe PCR protokolü türeyen, ancak burada tek bir primer tavlama sıcaklığı (Şekil 1A) sıkılığına bağlı olarak, şablon DNA spesifik ve / veya non-spesifik olarak melezleşir. Tipik bir PCR ürünleri özgü çoğu birden fazla DNA fragmanları (Şekil 1B) oluşur. Sağ transpozon ITR yukan ve büyütme primeri tarafından tanınan sekansının alt baş tavlanan farklı dizileme primeri kullanımı dizileme aşama (Şekil 1C) BY için spesifisite sağlamaktadır. Dizi analizi için otomatik bir yazılım transpozon eklemeler (Şekil 1C) tam yeri sağlayan bir Coxiella genomuna edilen sekansları hizalanır. Tüm transposon eklemeleri sonra ann olabilirCoxiella genomu (Şekil 1D) üzerine otated.

Her Coxiella mutantı izole edilmiş ve depolama ya da ayıklama öncesinde ACCM-2 ortamı içinde aksenik biçimde yükseltilir. 2 16 nokta / ICM Coxiella genleri (Şekil 2A), 38 transpozon mutantlarının bir örneğini göstermektedir, Şekil. Coxiella mutantlarının uygulanabilirliğini değerlendirmek için, aksenik büyüme eğrileri 1.5 (Figurie 2B) 'de tarif edilen bakteri konsantrasyonu tahlili Aşılama sonrası 7 gün bakteri kültürleri numune alma ve uygulanması ile elde edilir. Amplifiye mutantlar daha sonra, 7 gün için üçlü 96-yuvalı plakalar içinde, epitel hücreleri ile inkübe edilir. Üretilen tüm Coxiella mutantlar GFP etiketli hücre içi büyüme eğrileri de, her 24 saatte, her GFP floresans yoğunluğunu ölçülmesi ve zamanın bir fonksiyonu (Şekil 2C) olarak ölçülen değerlerin konulması sureti ile elde edilir edilir.

Intracellular büyüme eğrileri Coxiella genomunda her transpozon ekleme ile ilişkili fenotipleri kantitatif analiz sağlar. Aynı transposon mutantlar hakkında nitel bilgiler eklemek için, otomatik görüntü toplama ve analiz için seçti. Yedi gün plakalar 4 açıklanmıştır ve bu CellProfiler (geniş Enstitüsü, 5. Otomatik görüntü analizi yazılımı tarif edildiği gibi otomatik bir, Epifloresans mikroskop kullanılarak analiz edildiği immünofloresans için işleme, sabittir, enfeksiyondan www.cellprofiler.com alınan kanal işlem) bağımsız ve segmentler karşılaştırmalı analizi (Şekil 3) için nesneleri tespit. Bu konak hücre çekirdekleri, hücre konturları, lizozomlar ve Coxiella koloniler (Şekil 3 üst paneller) tanımlanması ve morfolojik karakterizasyonu sağlar. Hücreler ve lizozomlar ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi identificati sağlarve (pozitif LAMP1, Şekil 3 sol alt panel vardır) Coxiella ihtiva-eden vakuollerin özgü morfolojik analizi. Konak hücre konturları ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi kimlik ve enfekte olmuş hücrelerin spesifik morfolojik analizi (Şekil 3 orta alt panel) izin verir. Son olarak, 4 kanal illüstrasyon ve kalite kontrol amaçlı (Şekil 3 sağ alt panel) için birleştirilir.

Otomatik görüntü analizinden elde edilen veriler "çok fenotipik dağılım araziler" elde etmek için birbirlerine karşı çizilebilir. Bir örnek olarak, Coxiella kolonilerinin Şekil 4A (um ²⁾ ortalama alan olarak Coxiella (çoğaltma fenotip) ve / veya hücre içi çoğaltma etkileyen mutasyonları tespit etmek için, hücre (Şekil 4A), ortalama koloni sayısı karşı çizilir Ev sahibi hücreleri istila bakterilerin kapasitesi (internakatmanlara ayrılmasına fenotip). İstatistiksel analiz hafif (-4 (Şekil 4A, pembe ve kırmızı noktalar) en sol kısmında gruplandırıldı; hücrelerde Coxiella içselleştirilmesi etkilenen mutasyonlar arsa alt kısmında gruplandırıldı (Şekil 4A, açık ve koyu mavi nokta) ve son olarak, arsa sağ çoğu bölgede yeşil noktalar (anlamlı olmayan fenotipleri sonuçlanan mutasyonlar karşılık Z-skoru> -2). Önemli olarak, çoğaltma için başarısız ama yine de konakçı hücreleri istila mümkün olan mutantlar, hücre çekirdekleri (Şekil 4C, ikinci panel) barındırmak için bitişik tek bakteri ya da küçük koloniler, enfeksiyon 7 gün sonra tespit edilir. Bu nedenle, Coxiella boyutu "ColoNies "önemli ölçüde etkilenecek, ama enfekte olmuş hücrelerin sayısı WT Coxiella ile enfekte olan hücreler ile karşılaştırıldığında farklı olmayacaktır. Aksine, konak hücreleri işgal etmek Coxiella kapasitesini etkileyen mutasyonlar koloni / hücre sayısında bir azalmaya neden olur. Bu sayısı önemli ölçüde 1 'in altında olduğu zaman, bu ortalama, enfekte olmuş hücrelerin toplam sayısında bir azalma olduğunu işaret etmektedir. Seçenek olarak ise, Coxiella kolonileri (um ²⁾ ortalama alan Coxiella (sitotoksik fenotip) sitotoksiteye kazandıran mutasyonlar tespit etmek enfeksiyonu (Şekil 4B) hayatta konakçı hücreler, sayısına karşı çizilmiştir edilebilir. Yukarıdaki gibi, istatistiksel analiz hafif (-4 (Şekil 3B yeşil noktalar). 37 mutasyon hafif etkilenen konak hücre sağkalım (Şekil 3B, açık kırmızı noktalar) ve 7 mutasyonlar hücre sağkalım (Şekil 3B, koyu kırmızı noktalar) barındırmak için özellikle zararlı idi. Deneysel ihtiyaçlarına göre, otomatik bir görüntü analizi prosedürü ile elde edilen ek parametreler, diğer grafikleri elde etmek için kullanılabilir olduğunu not edin.

Şekil 1:. Sıralama ve Coxiella transpozon mutantlar açıklama (a) Tek primeri koloni PCR transpozon ekleme bölgesi içeren DNA fragmanlarının büyütülmesi için kullanılmıştır. Bir yükseltme primeri (Amp), tavlama sıcaklığının sıkılık bağlı olarak spesifik ve spesifik olmayan primer olarak hem de kullanılır. (B) tek primer koloni PCR tipik sonucudur. Her Reactiilgili transpozon ekleme yeri içeren bazıları değişken boyutta fragmanlar, bir dizi üretir; bazıları rastgele yan ürünlerin düşük sıkılık PCR döngüsünün olarak güçlendirilir. (C), transpozon sekansına hibridize olan bir dizileme primeri (Sekans no) kullanımı ilgi parçalarının sekanslanmasını sağlar. (D) Sıra analiz yazılımı bakteri genomu üzerinde transposon eklemeleri otomatik şerhi verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2:. Aksenik ve Coxiella transpozon mutantlar hücre içi büyüme (A) Pilot ekranında, biz 16 çekirdekli g 38 transposon mutantlar sıralı, izole ve ekranlı varCoxiella nokta / icm salgısı sistemi enes (kırmızı gösterilir). Her bir transpozon mutantının yaşayabilirliği belirlemek üzere (B), her biri bir büyüme aksenik kültür ortamı içinde izole bir floresan DNA interkalasyon temin edici madde etiketli kullanılarak 8 gün boyunca izlenir. (C) Her bir mutant daha sonra epitel hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Transpozon bir GFP kaset sahip olarak, hücre içi bakteri üremesi bir mikroplaka okuyucu kullanarak, Coxiella çoğaltma ile ilişkili GFP floresan varyasyonları takip ederek enfeksiyon üzerinde 7 gün izlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Coxiella enfeksiyonlarının Otomatik görüntü analizi Bir ​​otomatik.çiftleşmiş epifluorışıma mikroskop görüntü üç kopya 96 oyuklu plakalar, oyuk başına 21 pozisyonları kullanılır. Görüntü analiz yazılımı segmentleri ölçümü ve analizi için her edinilen kanallarda nesneleri. Tüm durumlarda, görüntü sınır temas nesneler hariçtir. (A), Hoechst kanalı (yeşil çember), konakçı hücre çekirdekleri tanımlamak için kullanılır. (B) Bu Cy3 kanalında konak hücre konturları tanımlamak için tohum olarak kullanılmaktadır (çekirdeklerin pozisyonu mavi çember, hücre konturları yeşil vardır). (C) Cy5 kanalı LAMP1 pozitif bölmeler tanımlamak için kullanılır (yeşil daire); Sadece (kırmızı) daha önce tanımlanmış olan, hücre hatlarına dahil nesnelerin görüntü analizi için muhafaza edilir. (D), GFP kanalı (yeşil çember) Coxiella kolonilerini teşhis etmek için kullanılır. (E) LAMP1 pozitif bölmeleri ile Coxiella kolonileri ilişkilendirilmesi Coxiella belirlenmesini sağlar Ihtiva-eden vakuoller (CCVS); Sadece (yeşil) daha önce tanımlanmış olan, hücre hatlarına dahil nesnelerin görüntü analizi için muhafaza edilir. Hücre konturları ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi (F) enfekte olmuş hücrelerin (yalancı) belirlenmesini sağlar. 4 floresan kanal edilen (G) resim (Coxiella koloniler (yeşil), konakçı hücre çekirdekleri (mavi), konakçı hücre, plazma membranı (gri), LAMP1 pozitif bölmeleri (kırmızı) karşılık gelen) birleştirilir ve gösterim ve kalite için kullanılan Kontrol. Ölçek 10 mikron barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: ev sahibi yer Coxiella faktörlerin büyük ölçekli tanımlama / patojen etkileşimiyonları (A). Coxiella kolonilerin (um ²⁾ hücre başına koloni nispi sayısı karşı çizilen ortalama alan, ilgi konusu çoğaltma ve içselleştirme fenotipleri tespit etmek. Yeşil noktalar Z-skoru> -2 (önemli değil) tarafından WT Coxiella sapan fenotipleri temsil etmektedir. Pembe ve açık mavi noktalar -2 ve -4 (hafif fenotip) arasında bir Z-skoru sırasıyla çoğaltma ve içselleştirme fenotipleri temsil etmektedir. Kırmızı ve koyu mavi noktalar Z-skoru ≤ -4 (güçlü fenotipleri) ile fenotipleri temsil etmektedir. Coxiella kolonileri (B) (mikron ²⁾ ortalama alan transpozon eklemeleri kaynaklanan sitotoksik etkisini tahmin etmek için enfeksiyon 7 gün hayatta hücreleri (enfekte ve enfekte olmayan) toplam sayısı karşısında çizilmiştir. Yeşil noktalar Z-skoru> -2 (önemli değil) tarafından WT Coxiella sapan fenotipleri temsil etmektedir. Pembe noktalar sitotoksik ph temsil-2 ve -4 (hafif fenotip) arasında bir Z-skoru enotypes. Kırmızı noktalar Z-skoru ≤ -4 (güçlü fenotipleri) ile sitotoksik fenotipleri temsil etmektedir. Oklar C (C) karşılık gelen küçük harf ile gösterilen mutantlar çoğaltma, içselleştirme ve sitotoksik fenotipleri Temsilcisi görüntüleri gösterir. Her durumda, konakçı hücre çekirdekleri kırmızı olan Coxiella koloniler yeşil içindedir. Ölçek, 50 mikron barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Ev sahibi / patojen etkileşimlerinin araştırılması bakteriyel enfeksiyonların anlamak ve bulaşıcı hastalıkların karşı alternatif stratejiler geliştirmek için dikkate değer bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, farklı bakteriyel patojenler tarafından hazırlanan stratejilerin çeşitliliği, bakteriyel virülans faktörleri ve enfeksiyonlar sırasında hedeflenen sinyal yollarının host kimlik ve karakterizasyonu gerçek bir meydan okuma temsil etmektedir. Bu anahtar konak / patojen etkileşimi göbeklerinin büyük ölçekli tanımlama için yeni yaklaşımların geliştirilmesi için çağrıda bulunmaktadır. yenilikçi, yüksek verimlilik ve yüksek içerik tarama tekniklerinin son gelişme hücre içi bakteriyel patojenler ¹⁵ çalışmaya adapte edilebilir paha biçilmez bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, transpozon mutagenezi ve floresan bazlı tahliller kombine bir tarama yaklaşımların geliştirilmesi için bir model olarak zoonotik bakteriyel patojen Coxiella burnetii'ye kullandık. Importantly, bu tarama yöntemi, işgal çoğaltmak ve enfekte hücreler içinde devam için bu bakterinin tarafından geliştirilen stratejilerin küresel bakış sağlayan, Coxiella içi döngüsünün birden adımların eşzamanlı olarak izlenmesine olanak verir.

Burada tarif edilen yaklaşım, bakteriyel patojenlerin çalışma uygulanmış iki iyi bilinen tekniklerle, transpozon mutagenezi ve floresan bazlı deneylerde, dayanmaktadır. Yüksek verimli / yüksek içerik ekranlarında bağlamında bu tekniklerin birleştiren bize olayların çok yüksek sayıda (bakteriyel mutasyon başına tipik 15.000 enfekte olan hücreleri görüntülü ve analiz edilir) analiz ederek bakteriyel mutasyon sayısının yüksek etkilerini değerlendirmek için izin verir. Bu tür, doğası gereği, yüksek değişkenliğe tabidir konak hücreleri ve hücre içi çoğaltma, bakteriyel işgali gibi olaylar önemli bir istatistiksel analiz sağlar. Bu ep dışındaki bu hücre hatları dikkat etmek önemlidirithelial tarama bu tür için kullanılabilir. Konakçı hücre organelleri tespit etmek daha kolay Ancak, düz ve büyük epitel hücreleri görüntü analizi için uygun olan. Otomatik mikroskoplar çoğunluğu otomatik plakaların sayıda işleyebilir, çünkü aynı anda elenebilir mutantların sayısı neredeyse hiçbir sınırı vardır. Patojenin bağlı olarak, kullanıcı teneke ayrıcalık, bir Epifloresans veya konfokal mikroskop kullanımı. görüntü elde etme zamanı çoğunlukla kuyu başına ve görüş alanı başına elde edilen kanalların sayısı edinilen alanların sayısı, mikroskop kameranın duyarlılığına bağlıdır. Kullanıcı tarama protokolü optimize etmek için bu faktörleri nasıl ayarlanacağı karar verebilirsiniz. Bir örnek olarak, bu noktada 5.1 de belirtilen koşullar kullanılarak, bir 96-çukurlu plaka / saat görüntülenmiş. Görüntü analizi büyük ölçüde kullanılan makine (veya makinelerin küme) bağlıdır. Biz 12 çekirdekli (2 x 3.06 GHz 6 Çekirdekli), 48 GB RAM iş istasyonu kullanın. Bu makine approxi gerektiriryaklaşık 40 dakika bir plaka elde edilen görüntüleri analiz etmek.

Bu analizleri uygularken, gelişmekte olan yeni resim kadar (veya mevcut optimizasyonu) numune çok sayıda manipülasyon ve işlenmesini sağlamak için protokolleri olduğunda önemli bir yönü dikkate alınacak. Tipik bir örnek bize hızla yükseltmek ve izin tek primer koloni PCR yaklaşımı, gelişimi çok küçük örneklerden, her transpozonun ekleme siteyi içeren dizisi Coxiella DNA fragmanları. Bizim deneyime dayalı, yüksek kalitede polimeraz özenle seçilmiş ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için test edilmelidir. Bu yaklaşımın tek sınırlama, vakaların çoğunda, işlenmiş örneklerin yaklaşık% 30'u yararlanılamaz değil, gözlem PCR veya sıralama adımlar nedeniyle ya gizleyebilirsiniz. Bununla birlikte, yeni Coxiella transpozon mutantların izolasyonu, bir oran-sınırlayıcı aşama olmadığını dikkate alınarak, bu repre etmezönemli bir sorun gönderdi. Benzer şekilde, mutant stokların bakteri konsantrasyonunu ölçmek için güvenilir bir tahlil gelişimi bu yaklaşım için anahtar olmuştur. Süspansiyon içinde toplamak için Coxiella eğilimi nedeniyle, optik yoğunluk okumaları kullanılmasıydı Coxiella kültürler ve sadece mevcut alternatif konsantrasyonunu kantitatif PCR (qPCR) hesaplamak için geçerli değildir. Burada, bir floresan etiketli DNA interkalasyon maddesinin kullanımının önemli ölçüde bakteri kantitatif hızlandırdı.

Bu yaklaşım, aynı zamanda kullanılan patojene bağlı olarak birkaç hücre içi fluoresan işaretleri ekspres eden stabil hücre çizgilerinin kullanımının avantajını sunar. Bir başka önemli yönü, fenol kırmızısı içermeyen hücre kültür ortamının kullanılmasıdır. Biz bu pH indikatör otomatik floresan okuyucu kaydedilen sinyali doyurur kırmızı ve yeşil spektrum kapsayan doğal bir floresan sahip olduğu görülmektedir.

TBurada sunulan strateji rastgele transpozon mutajenezi dayanır. Ilgi mutantlar için, Güney leke ve transpozon ekleme sitenin PCR amplifikasyonlar kullanarak benzersiz transpozisyonlar doğrulama (ve klonalite) tavsiye ederim.

Protokol bölümünde açıklanan ekipman yanı sıra, burada sunulan tarama yaklaşımı kullanılarak ilgilenen ekipler, veri toplama, veri depolama için bir sunucu ve hızlı görüntü analizi için bir iş istasyonu için bir ilişkisel veritabanı set up büyük bir avantaj alacak.

Önemli bir şekilde, burada, diğer hücre içi bakteriyel patojenlerin çalışma için uygundur tarif edilen yöntem, bir rastgele mutagenez yöntemi patojenin mevcut mesafede, hücre çizgileri patojen ile enfekte olabilir ve bu bir enfeksiyon sırasında, belirli bir fenotip göstermektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citric acid	Sigma	C0759-500G	ACCM-2 medium component
Sodium citrate	Sigma	S4641-500G	ACCM-2 medium component
Potassium phosphate	Sigma	60218-100G	ACCM-2 medium component
Magnesium chloride	Sigma	M2670-100G	ACCM-2 medium component
Calcium chloride	Sigma	C5080-500G	ACCM-2 medium component
Iron sulfate	Sigma	F8633-250G	ACCM-2 medium component
Sodium chloride	Sigma	S9625-500G	ACCM-2 medium component
L-cysteine	Sigma	C6852-25G	ACCM-2 medium component
Bacto Neopeptone	BD (Beckton-Dickinson)	211681	ACCM-2 medium component
Casamino acids	BD (Beckton-Dickinson)	223050	ACCM-2 medium component
Methyl-B-Cyclodextrin	Sigma	C4555-10G	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax	Gibco	61870-010	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax, without phenol red	Gibco	32404-014	For cell culture and infection
Fetal Bovine Serum	GE healthcare	SH30071	For cell culture
Trypsin EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056	For cell culture
Saponin	Sigma	47036	For immunofluorescence staining
Ammonium chloride	Sigma	A9434	For immunofluorescence staining
Bovine Serum Albumine	Sigma	A2153	For immunofluorescence staining
Electroporation cuvette 0.1 cm	Eurogentec	ce0001-50	For Coxiella transformation
Trackmates screw top tubes with caps	Thermo Scientific	3741	2D barcoded screwcap
96-well microplate with black walls and bottom	Greiner	655076	Flat dark bottom, for dsDNA quantitation
96-well microplate, ��clear, black walls	Greiner	655090	Flat transparent bottom, for cell culture and imaging
96-well PCR microplate	Biorad	2239441	DNAse/RNAse free
96-well plate, Deepwell	Labcon	949481	For Coxiella mutants infections
PicoGreen	Life Technologies	P7581	For dsDNA quantitation
Triton X-100	Sigma	T9284-500ML	For dsDNA quantitation
Phusion High fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L	For single primer colony PCR
Celltracker Red CMTPX	Life Technologies	C34552	For imaging
Anti-LAMP1 antibody	Sigma	94403-1ML	For immunofluorescence staining
Hoechst 33258	Sigma	L1418	For imaging
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro	Tecan
Epifluorescence automated microscope Cellomics	Thermo Scientific