דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Summary

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

Abstract

פלישה והתישבות של תאי מארח על ידי חיידקים פתוגנים תלויה בפעילות של מספר רב של חלבוני פרוקריוטים, שהוגדר כגורמים ארסי, שיכול לערער ולשנות פונקציות מארח מפתח. המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן לכן חשוב מאוד להבין זיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. גישה זו לעומת זאת, דורשת הפיתוח של מבחני תפוקה גבוהה החדשים לזיהוי משוחד, אוטומטי והאפיון של גורמי אלימות חיידקים. כאן, אנו מתארים שיטה לייצור ספריית מוטציה מתויג GFP ידי mutagenesis transposon ופיתוח גבוה הקרנת תוכן גישות לזיהוי בו זמני של פנוטיפים הקשורים transposon מרובים. מודל העבודה שלנו הוא burnetii תאית חיידקי Coxiella הפתוגן, סוכן etiological של קדחת Q zoonosis, אשר מזוהה עם seVere התפרצויות עם בריאות כתוצאה מכך וניטל כלכלי. הטבע תאיים לחייב של הפתוגן זה, עד לאחרונה, הקשה מאוד על זיהוי של גורמי חיידקים מעורבים באינטראקציות הפתוגן מארח, מה שהופך את של Coxiella המודל האידיאלי ליישום תפוקה גבוהה / גבוה תוכן גישות.

Introduction

החיידק מתעוררים, אנדמי Coxiella burnetii אחראי להתפרצויות גדולות של קדחת Q, zoonosis דמוית שפעת מתישה עם בריאות חמורה והשפעה כלכלית ^1. המאגרים העיקריים של Coxiella הם חיות בית ומשק, וההערכה היא כי יותר מ -90% מבקר לחלב בארה"ב לשאת ג burnetii ^2. בני אדם הם מארחים מקריים שנגועים על ידי שאיפה של אירוסולים מזוהמים. קדחת Q האנושית באה לידי ביטוי גם כמחלה אקוטית או כרונית, שעשויה להיות לי סיבוכים קטלניים עם שיעור תמותה מגיע 65% ^1,3. עם מינון זיהומיות של 1 - 10 אורגניזמים, Coxiella הוא הפתוגן זיהומיות הידועים ביותר והוא נחקר כנשק ביו פוטנציאל ^4. ההתפרצות האחרונה הנפץ של קדחת Q בהולנד (2007 - 2010), במקרי הסלמה מ-182 ליותר מ 2,000 בשנה, עומדת כדוגמא לאלימות הקשה של הפתוגן^5.

היעילות המדהימה של זיהומי Coxiella הוא צפוי הקשורים להתנגדותה ללחץ סביבתי, בשילוב עם ההתאמה הייחודית שלה לארח תאים. ואכן, Coxiella נמצא בסביבה בצורה של גרסאות מטבולית פעילה קטנות תא (SCV), אשר להפליא עמידים במספר תנאים קשים (התייבשות, טמפרטורה, וכו '). SCVs נתפס על ידי תאי phagocytic באמצעות _V α β ₃ integrins ⁶ תוך פלישה של תאים שאינם phagocytic מתווכת על ידי ההדבקה / פלישת Coxiella ⁷ OmpA וקולט עדיין לא מזוהה. בעקבות ספיגה, Coxiella מתגורר בvacuoles ההדוק, חיובי לסמני endosomal המוקדמים Rab5 וEEA1 ^8. חיידקים להגיב להחמצת endosomal ידי המרה לגרסות מטבולית פעילה גדולות תא (LCVs) והפעלת מערכת דוט / ICM סוג 4 הפרשה (T4SS) ⁹, הומולוגי מאוד לזה של Legionella pneumophila ^10. הפרשת effectors דוט / ICM תאפשר Coxiella ליצור תא גדול, LAMP1 חיובי חומצי המכיל אנזימי lysosomal פעילים בי חיידקים יכולים לשגשג ופעיל בהגנה על תאים נגועים מאפופטוזיס ^11. לפיכך, המחזור תאיים של Coxiella נשלט על ידי טרנסלוקציה תיווך ICM דוט / של effectors חיידקי ^12, לעומת זאת, גורמי החיידקים מעורבים בפלישת מארח תא, שכפול והפצה של חיידקי הזיהום יישארו במידה רבה לא ידועים.

שילוב mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת, אנו מפתחים גישות משוחדת לזיהוי בו זמני של גורמי חיידקים מעורבים בשלבים העיקריים של זיהומי Coxiella: 1) הפנמה בתוך תאי מארח, 2) שכפול תאיים, 3) התפשטות תא אל התא , ו 4) התמדה. עד כה, יש לנו יותר מ -1,000 מטר הוקרנוutations ב500 רצפי Coxiella קידוד, אשר סיפק לנו תובנות חסרות תקדים לתוך אינטראקציות מארח הפתוגן המסדירות פתוגנזה Coxiella ^7. ראוי לציין, גישה זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של פתוגנים תאיים אחרים שחולקים תכונות ביולוגיה של תא עם Coxiella.

Protocol

1. דור של ספרייה של מוטציות transposon מתויג GFP Coxiella

מניפולציות Coxiella burnetii RSA439 NMII ברמת בטיחות ביולוגית בלימת 2 (BSL-2) בקבינט בטיחות חיידקים (MSC) בעמידה בכללים מקומיים. אם בקנה אחד עם מודל החיידקים משמש, צעדים חוזרים מ1.4.1 ל1.4.4 להגדיל את ההסתברות לקבלת מוטציות משובטים. ספריית מוטציה אופיינית מורכבת (לפחות) של מספר מוטציות שהוא שווה לשלושה פעמים מספר קידוד הרצפים מבואר בגנום של האורגניזם בשימוש.

1. הכנת electrocompetent Coxiella RSA439 NMII:
   1. הכן ACCM-2 ¹³ 1x: 13.4 חומצה ציטרית מ"מ, 16.1 מ"מ נתרן ציטרט, אשלגן 3.67 מ"מ, מגנזיום כלוריד 1 מ"מ, סידן כלורי 0.02 מ"מ, 0.01 מ"מ סולפט ברזל, נתרן כלורי 125.4 מ"מ, L-ציסטאין 1.5 מ"מ, גרם 0.1 / L Bacto Neopeptone, חומצות casamino L / 2.5 G, 1 גרם / cyclodextrin בטא תיל L, RPMI 125 מיליליטר / L. התאם ל- pH 4.75 ולעקר מסנן (לא החיטוי). הערה: נוזל ACCM-2 הוא יציב ב 4 מעלות צלזיוס למשך כ 1 חודש.
   2. לחסן של ACCM-2 100 מיליליטר עם 2 x 10 ⁶ שווה הגנום (GE) / מיליליטר של Coxiella RSA439 NMII (ממניות חיידקים שנוצרו בעבר ולכמת כמו בשלב 1.5) ממניות -80 ° C ולהפיץ את ההשעיה החיידקים ב -75 צלוחיות סנטימטר ² תא תרבות עם כובעים פרקו (10 - 15 מיליליטר של השעיה חיידקים לכל בקבוק). לגדול במשך 7 ימים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO ₂ ו -2.5% O _2.
   3. בריכת ההשעיה וכתוצאה מהחיידקים בצינורות 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 3,900 XG במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
   4. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 30 מיליליטר של גליצרול 10%. צנטריפוגה ב 3,900 XG במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
   5. Resuspend גלולה בנפח מספק של גליצרול 10% (בדרך כלל 2 מיליליטר) וaliquot 50 μl ב 500 צינורות μl. שמור ב מושעהacteria על קרח במהלך כל התהליך. הערה: בשלב זה, חיידקים electrocompetent וaliquot אחת מספיק כדי לבצע electroporation אחד. ניתן לאחסן השעיות החיידקים ב -80 ° C למשך 6 חודשים או להשתמש ישירות לelectroporation של פלסמיד דנ"א.
2. Electroporation של Coxiella המוסמך עם transposon- ופלסמידים קידוד-transposase:
   ⁷ לפרוטוקול הבא, טרנספוזון וtransposase מקודדים על ידי שני פלסמידים שונים (pITR-CAT-GFP וpUC19-Himar1C9, בהתאמה): שים לב. שני פלסמידים חסרי מוצא שכפול Coxiella ספציפי, מה שהופך אותם פלסמידים התאבדות כאשר electroporated בCoxiella. זה מבטיח הוספות transposon יציבים. טרנספוזון מכיל קלטת התנגדות chloramphenicol תחת הרגולציה של p1169 Coxiella האמרגן לבחירה וגן GFP תחת הרגולציה של p311 אמרגן Coxiella לתייג את מוטציות שנוצרו עם GFP.
   1. Prדואר לקרר קובט electroporation 0.1 סנטימטר במשך 10 דקות על קרח. מערבבים 50 μl של electrocompetent Coxiella עם 10 מיקרוגרם פלסמיד transposon ו -10 מיקרוגרם של פלסמיד transposase ^7. ודא שריכוז פלסמיד הוא גבוה יותר מ -500 מיקרוגרם / מיליליטר כדי למזער דילול של גליצרול.
   2. Electroporate באמצעות ההתקנה הבאה: 18 קילו וולט, 500 Ω, 25 μF. ודא שקבוע זמן וכתוצאה מכך מורכב בין 9 ו -13 אלפיות שניים.
   3. מייד להוסיף 950 μl של RPMI, resuspend חיידקי electroporated ולהעביר לצינור כובע בורג ולשמור בטמפרטורת חדר.
   4. קח 200 μl של חיידקי electroporated ולהוסיף 3 מיליליטר של ACCM-2 בתוספת סרום שור העוברי מומת-חום (1% FBS) ל6-גם צלחות. להוסיף 88 μl של DMSO לנפח הנותר של חיידקי electroporated (להגיע לריכוז סופי של 10% DMSO) ולאחסן ב -80 ° C.
3. בחירה של מוטציות transposon:
   1. אינקובטוריםte 6 הצלחות גם מחוסנת כפי שתואר לעיל (1.2.4) לילה על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO ₂ ו -2.5% O _2. הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה (375 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin או 3 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol). דגירה תרבות החיידקים במשך 3 ימים נוספים בתנאים שתוארו לעיל.
4. בידוד של מוטציות בודדות:
   1. הכנת-2 ACCM צלחות מוצקות וציפוי של מוטציות transposon Coxiella
      הערה: ההוראות להלן ל1 צלחת פטרי, כמה דילולים של תרבויות חיידקים צריכים להיבדק כדי להעריך את חיסון הנפח האופטימלי לבידוד מושבה.
      1. מחממים 10.5 מיליליטר של 0.5% agarose במיקרוגל ולתת לו מגניב באמבט מים C ° 55. מחממים 11.25 מיליליטר של 2x ACCM-2 (pH 4.75) על 37 מעלות צלזיוס.
      2. הכן agarose התחתון:
         1. לערבב 10 מיליליטר של 0.5% מומסים agarose עם 10 מיליליטר של 2x ACCM-2 ולהוסיף האנטיביוטיקה המתאימה (מיקרוגרם 375 / מיליליטר kanamycin או 3מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol).
         2. יוצקים מייד לצלחת פטרי. שמור ללא מכסים בצלחת פטרי, בואו מגניב הבינוני למשך 30 דקות ואוויר יבש למשך 20 דקות.
      3. הכן agarose העליון:
         1. לערבב 1.25 מיליליטר של 2x ACCM-2 עם 0.75 מיליליטר של מים בצינור קלקר 5 מיליליטר, להוסיף את האנטיביוטיקה המתאימה (375 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin או 3 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס.
         2. הוסף את תרבות החיידקים (בדרך כלל 1-100 μl) ומערבולת במשך 5 שניות.
         3. הוסף 0.5 מיליליטר של agarose נמס, מערבב ומייד יוצק על agarose התחתון.
         4. אפשר להתקרר במשך 20 דקות, להחליף את המכסה על צלחת פטרי ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להקל על מיצוק agarose.
         5. אוויר יבש במשך 20 דקות ללא מכסים בMSC. לגדול צלחות על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO ₂ ו -2.5% O ₂ במשך 6 עד 7 ימים.
   2. להוסיף DMSO לחיידקים שנותרותרבויות l כדי להגיע לריכוז סופי של 10% DMSO ולאחסן ב -80 ° C.
   3. להעריך את הדילול האופטימלי כדלקמן: להבטיח שמושבות הן 0.5-1 מ"מ קוטר ומבודדים כראוי, כדי למנוע זיהום צולב. להפשיר נותרו תרבויות חיידקים מנקודת 1.4.2 וצלחת בדילול המתאים בACCM-2 אגר כפי שתואר ב1.4.1.2 ו1.4.1.3. דגירה של 6-7 ימים, כמתואר ב1.4.1.3.5.
   4. ברגע שמושבות הן לגילוי, לאסוף אותם על ידי חיתוך הקצה של קצה 1 מיליליטר, לקטוף את התקע המכיל מושבות מבודדות ופיזור המושבה על ידי pipetting ב 1.5 מיליליטר של ACCM-2 (מיקרוגרם המכיל האנטיביוטיקה המתאימה 375 / מיליליטר kanamycin או 3 מיקרוגרם / chloramphenicol מיליליטר) בצלחת 24 גם. להגביר מושבות בודדות עבור 6 ימים בתנאים המתוארים ב1.3.1. ביום 3 של דגירה, לפזר את גושי חיידקים על ידי pipetting כל תרבות.
   5. אחסן כל השעיה מוטציה בצינורות screwcap המינימרקטים 2D ב96-גם צלחות ב 10DMSO% ב -80 מעלות צלזיוס.
5. הערכה של ריכוז חיידקים:
   הערה: הפרוטוקול הבא יכול להיות מיושם כדי להשיג את עקומות הגדילה של חיידקי מוטציות משכפלות במדיום axenic (ראה 1.4.4).
   1. הכנת עקומה סטנדרטית:
      1. הכן פתרון 2 מיקרוגרם / מיליליטר מניות של dsDNA (בדרך כלל פלסמיד של גודל ידוע וריכוז אקראי) ב1x טריס EDTA (TE). הכן 10 לקפל דילולים סדרתי מפתרון המניות לקבל ריכוזים הנעים בין 2 מיקרוגרם / מיליליטר 2 ng / ml. לוותר 50 μl של כל ריכוז לבארות בודדות של microplate 96-היטב עם קירות ותחתונים שחורים (ראה טבלה של חומרים).
      2. לדלל את מגיב quantitation dsDNA 1: 200 במאגר 1x TE ולהוסיף 55 μl של המגיב המדולל לכל דגימה בmicroplate 96-היטב. מערבבים היטב באמצעות ייקר צלחת ודגירה של 2 עד 5 דקות בטמפרטורת חדר, בחושך.
      3. למדוד את הקרינה דגימות באמצעות לזרוחNCE קורא microplate ומסננים לאורכי גל סטנדרטי והעמסת (עירור ~ 480 ננומטר, פליטה ~ 520 ננומטר).
      4. עלילה טווח ריכוז פלסמיד נגד קריאות עוצמת הקרינה.
   2. quantitation השעיה חיידקים:
      1. לוותר 5 μl של 10% Triton X-100 לכל גם בmicroplate 96-היטב עם קירות ותחתונים שחורים (ראה טבלה של חומרים). הוסף 50 μl של השעיות חיידקים לכל היטב דגירה 10 דקות בטמפרטורת חדר, על שייקר צלחת.
      2. לדלל את מגיב quantitation dsDNA 1: 200 במאגר 1x TE ולהוסיף 55 μl של המגיב המדולל לכל דגימה בmicroplate 96-היטב. מערבבים היטב באמצעות ייקר צלחת ודגירה של 2 עד 5 דקות בטמפרטורת חדר, בחושך.
      3. למדוד את הקרינה דגימות באמצעות קורא הקרינה microplate ומסננים לאורכי גל סטנדרטי והעמסת (עירור ~ 480 ננומטר, פליטה ~ 520 ננומטר).
      4. כדי להשיג את DN החיידקיםריכוז, העלילה קריאות הקרינה בתרשים שהושג בשלב 1.5.1.4. מחלקים את ריכוז ה- DNA על ידי המסה של הגנום Coxiella (2.2 FG) להשיג ריכוזי חיידקים. הגעה תוצאות במ"ל / Equivalent הגנום.
      5. מוטציות בטל מציגות פגם צמיחה משמעותי בACCM-2.

2. יחיד פריימר המושבה PCR, רצף, וביאור

הערה: הפרוטוקול הבא הוא להגברת DNA של 96 דגימות, פיפטה רבה מומלצת לשלבים הבאים. טיהור עמודה של מוצרי ה- PCR באמצעות חרוזים מגנטיים ורצפי DNA עם פריימר transposon הספציפי (2.3) הן קבלן לחברה חיצונית.

1. ודא שפריימר ההגברה נועד כדי להכליא בין 100 ל -200 בסיס זוגות במעלה הזרם של טנדם חוזר ההפוך (ITR), כדי להשיג מוצרי ה- PCR המכסים את הכניסה לאתר transposon על Coxiellהגנום. הכן 3 מיליליטר של תערובת PCR (1x חיץ נאמנות גבוה, 200 מיקרומטר dNTPs, פריימר ההגברה 1 מיקרומטר, 20 U / DNA פולימרז איכות גבוהה מיליליטר) ולוותר 29 μl לכל גם ב96-גם צלחת PCR להגדיר על קרח. העברה 1 μl של כל מוטציה בשלב נייח בACCM-2 לתערובת PCR.
2. הפעלת PCR עם denaturation הראשוני (98 מעלות צלזיוס, 1 דקות), 20 מחזורים גבוהים החמרה (98 מעלות צלזיוס, 10 שניות; 50 ° C, 30 שניות; 72 ° C, 90 שניות), 30 מחזורי חומרה נמוכים (98 מעלות צלזיוס, 10 שניות; 30 ° C, 30 שניות; 72 ° C, 90 שניות) ו- 30 מחזורים גבוהים החמרה (98 מעלות צלזיוס, 10sec; 50 ° C, 30 שניות; 72 ° C, 90 שניות) ואחריו סיומת סופית ב 72 ° C למשך 7 דקות.
3. לטהר מוצרי PCR באמצעות חרוזים מגנטיים ו- DNA רצף עם פריימר transposon הספציפי. עיצוב פריימר transposon הספציפי עם טמפרטורת התכה חזתה מורכבת בין 50 ° C ו 75 מעלות צלזיוס, תוכן GC בין 40% ו -60%, אורך בין 18 ו -25 נוקלאוטידים וסי חישולזוגות te במורד הזרם של אתר הכלאת פריימר ההגברה ולפחות 100 בסיס במעלה הזרם של זוג הבסיס הראשון של ITR transposon.
4. שימוש בתוכנת ניתוח רצף, לטעון את הגנום המלא, המבואר של burnetii Coxiella 493 NMI. השתמש בפונקצית "ליישר להתייחסות" כדי לטעון וליישר את תוצאות הרצף (blastn) ולקבוע את האתר של שכול. בטל מוטציות עם הלא-התאמה ו / או הצגת reads.To הכפול לפקח על הרוויה של ספריית המוטציה, לשמור תיעוד של המופע של הוספות transposon מרובות באותו האתר.

3. תאים האיקריוטים אתגר עם מוטאנטים Coxiella וניטור של תאיים צמיחה

הערה: פיפטה רבה מומלצת לשלבים הבאים. זיהומים בוצעו בtriplicates ב96-גם סטרילי microplates עם קירות שחורים ותחתון שקופים שטוח. burnetii WT Coxiella להביע GFP ¹⁴ wכאמור על ידי ד"ר רוברט Heinzen.

1. לגדל תאי Vero בRPMI ללא פנול אדום בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) בהעדר האנטיביוטיקה (השלם תקשורת RPMI).
2. היום לפני הזיהום, לשטוף תאי Vero ממחוברות או בקבוק תרבית תאים תת-מחוברות עם 10 מיליליטר של PBS.
3. ניתוק תאי Vero ידי הוספת 1 ​​מיליליטר של תמיסת EDTA טריפסין לבקבוק תרבות תא דגירה במשך 3 עד 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO _2.
4. תאי Resuspend ב 10 מיליליטר של תקשורת RPMI השלמה. ספירת תאים ולהכין השעיה תא של 10 ⁵ תאים לכל מיליליטר.
5. לוותר על ההשעיה תא 100 μl בכל טוב של צלחת 96-היטב שחורה עם תחתית שקופה שטוחה.
6. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 XG ב RT כדי להקל על הידבקות תא בתחתית בארות דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO _2.
7. להפשיר את צלחות 96-המכילות גם Coמוטציות xiella ב RT ולדלל 150 μl של השעיה חיידקים ב300 μl של RPMI ללא פנול אדום וFBS בצלחת 96-היטב גם עמוק.
8. הסר תקשורת מmicroplate המכיל תאי Vero ולוותר 100 μl / טוב של מוטציות Coxiella מדוללים (משרד הפנים של 100). השתמש גם A1 כשלילי (תאים שאינם נגועים) A2 שליטה והבארות וA3 כפקדים חיוביים (תאים נגועים בCoxiella WT להביע ¹⁴ GFP בmultiplicities של זיהומים (משרד הפנים) של 100 ו -200).
9. צנטריפוגה את הצלחת למשך 10 דקות ב 400 XG ב RT באמצעות בעל צלחת צנטריפוגות תרסיס חזק.
10. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO ₂ לשעה 2 ולאחר מכן להחליף חיידקים המכילים בינוניים עם 100 μl / טוב של מדיום חדש, שלם RPMI.
11. למדוד הקרינה GFP כל יום במשך 7 ימים באמצעות קורא הקרינה microplate ומסננים לאורכי גל סטנדרטי והעמסת (עירור ~ 480 ננומטר, פליטה ~ 520 ננומטר). להימנעהתערבות בשל עיבוי ופיזור אות במדיום התרבות, להשתמש עירור תחתון והקלטת פליטה על קורא microplate.

4. הכנת דוגמאות לרכישת תמונה אוטומטית

הערה: ההליך הוא לצלחת אחת 96-היטב, בהיקף של עד כרכים בהתאם. צעדים מ4.2 עלולים לנצל את מכונת כביסה צלחת.

1. בפוסט היום הזיהום ^-7, להסיר בינוני מצלחת ולהחליף אותו עם 50 μl / טובה של מדיום חדש, שלם המכיל צבע ניאון חדיר תא בדילול המתאים (בדרך כלל 1: 1,000, להיות מותאמת על פי קו התא המשמש ). דגירה תאים עבור 30 - 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO _2.
2. החלף בינוני עם 50 μl / טוב של 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS, דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר (RT) ולאחר מכן להסיר את החיץ PFA המכיל ולשטוף 3 פעמים עם PBS.
3. הסר PBS וdispensדואר 50 μl / טוב של פתרון חסימה (0.5% אלבומין בסרום שור, 50 Cl NH ₄ מ"מ ב- PBS, pH 7.4) בתוספת saponin 0.05%. לדגור על RT למשך 30 דקות.
4. החלף פתרון חוסם עם 40 μl / היטב פתרון טרי חסימה בתוספת saponin (כאמור לעיל) ועם נוגדן אנטי LAMP1 בדילול 1: 500. דגירה צלחת למשך 30 דקות ב RT.
5. הסר חסימת פתרון ולשטוף את הצלחת 96-היטב 5 פעמים עם 100 μl / טוב של PBS.
6. לוותר 40 μl / טוב של פתרון חסימה בתוספת saponin (כאמור לעיל), הנוגדנים משני שכותרתו fluorescently המתאימות (בדילול של 1: 1,000) כדי לחשוף את הנוגדן אנטי LAMP1 מיושם בשלב 4.4, ועם Hoechst 33258 בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה צלחת למשך 30 דקות ב RT.
7. הסר חסימת פתרון ולשטוף את הצלחת 96-היטב 5 פעמים עם 100 μl / טוב של PBS. השאר את הנפח של PBS המתאים לשטיפה האחרונה בצלחת 96-היטב, כמו התאים הקבועים לא צריכים להתייבש.
8. תמונת הצלחת מייד או צלחת חנות ב 4 ° C, מוגן מפני אור, לניתוח שלאחר מכן.

5. תמונת רכישה

1. לרכוש תמונות בGFP (488 ננומטר, חיידקים), Hoechst 33258 ערוצים (350 ננומטר, תא מארח גרעינים), אדום (~ 555 ננומטר, תא קרום סמן) והרבה אדום (~ 615 ננומטר, LAMP1) באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence האוטומטי מצוידים עם מטרת 20X. לרכוש 21 שדות עצמאיים לכל גם כדי תמונה מינימאלית של 5,000 תאים לדגימה. החל autofocusing באמצעות ערוץ גרעין תא מארח כנקודת התייחסות. כאשר עובד עם חיידקים פתוגנים הדבקת אחוז נמוך של תאי מארח, משתמשים יכולים להתאים את מספר השדות העצמאיים צילמו בכל טוב, על מנת לקבל מינימום של 500 תאים נגועים לנתח.

עיבוד 6. תמונה

הערה: השלבים הבאים הם ספציפיים לשימוש בCellProfiler תוכנת ניתוח תמונה. בכל המקרים, algorit האופטימליHM לפילוח חייב להיות מוגדר באופן ניסיוני והאובייקטים נוגעים בגבול של התמונה צריכים לחסל עם הפונקציה המתאימה.

1. לטעון את כל התמונות בCellProfiler.
2. השתמש "ImageMath" מודול להפחית את ערוץ ה- GFP מערוץ Hoechst, כדי למנוע זיהוי של מושבות Coxiella (גם מסומנות על ידי Hoechst) כגרעיני תא מארח בשלבים הבאים.
3. השתמש "IdentifyPrimaryObjects" מודול לגרעין תא מארח קטע מהתמונה של צעד 6.2 וכתוצאה מכך. שם האובייקטים המפולחים "גרעינים".
4. השתמש "IdentifySecondaryObjects" מודול לתאי מארח קטע מהתמונות 555 ננומטר באמצעות הגרעינים זוהו בשלב 6.3 כזרעים. שם אובייקטים "תאים" המפולחים.
5. (אופציונאלי) השתמש ב" IdentifyTertiaryObjects "מודול לגרוע גרעינים שזוהו בשלב 6.3 מהתאים שזוהו בשלב 6.4. ציטופלזמה שם החפצים המפולחים "221 ;.
6. השתמש "EnhanceOrSuppressFeatures" מודול על 615 תמונות ננומטר להסיר רקע ולהקל על זיהוי של תאי LAMP1 החיובי הבא.
7. השתמש "IdentifyPrimaryObjects" מודול על התמונה המתקבלת בשלב 6.6 לזהות תאי LAMP1-חיובי. שם אובייקטים "יזוזומים" המפולחים.
8. השתמש "IdentifyPrimaryObjects" מודול על תמונת 488 ננומטר לזהות מושבות Coxiella. שם האובייקטים המפולחים "מושבות".
9. השתמש "IdentifySecondaryObjects" מודול על 615 תמונות ננומטר לזהות vacuoles המכיל Coxiella באמצעות מושבות Coxiella זוהו בשלב 6.8 כזרעים. שם האובייקטים המפולחים "CCVs".
10. השתמש "MaskObjects" מודול כדי לבחור CCVs זוהה בתאים (תאים נוגעים בגבול של התמונה בוטלו, כמה CCVs ניתן לזהות תאים "בחוץ"). שם מילulting אובייקטים "CCVs מסונן".
11. השתמש "MaskObjects" מודול כדי לבחור מושבות זוהו בתאים (תאים נוגעים בגבול של התמונה בוטלו, כמה מושבות ניתן לזהות תאים "בחוץ"). שם אובייקטים וכתוצאה מכך "מושבות מסוננות".
12. השתמש "MaskObjects" מודול לשייך יזוזומים לתאים. שם אובייקטים וכתוצאה מכך "מסוננים יזוזומים".
13. השתמש "MaskObjects" מודול כדי לבחור תאים המכילים מושבות Coxiella. שם אובייקטים וכתוצאה מכך "תאים נגועים".
14. להשתמש במודול "מתייחס אובייקטים" כדי להגדיר את האובייקטים "CCVs מסונן" כילדים של "התאים" אובייקטי הורה. זה יאפשר ספירת מספר CCVs / נייד.
15. להשתמש במודול "מתייחס אובייקטים" כדי להגדיר את האובייקטים "מושבות מסוננות" כילדים של אובייקטי ההורה "תאים". רצון זהלאפשר לספור את מספר מושבות / נייד.
16. להשתמש במודול "מתייחס אובייקטים" כדי להגדיר את האובייקטים "מסוננים יזוזומים" כילדים של אובייקטי הורה "התאים". זה יאפשר ספירת מספר יזוזומים / נייד.
17. להשתמש במודול "MeasureObjectSizeShape" כדי לקבל ניתוח מורפולוגי של גרעינים, תאים, CCVs מסונן, מושבות מסוננות ומסוננים יזוזומים
18. השתמש "MeasureObjectIntensity" מודול לכמת את הקרינה GFP הקשורים מסונן CCVs ולהעריך את היעילות של שכפול Coxiella בתוך CCVs.
19. שימוש במודולים "OverlayOutlines" ו- "SaveImages" כיסוי תוצאות הפילוח ואת התמונה המקורית לבקרת איכות.
20. להשתמש במודול "ExportToSpreadsheet" לייצא מבחר של תוצאות ניתוח תמונה או כל.
21. (אופציונאלי) השתמש במודול "ExportToDatabase" לנתח את התוצאותבאמצעות אנליסט CellProfiler תוכנה.

ניתוח 7. נתונים

1. לכל פרמטר שהושג, לזהות ולחסל חריגים (בשל טעויות בפילוח תמונה) לאחר מכן לחשב את הערכים הממוצעים למוטציה.
2. השתמש Z-ציונים לזהות פנוטיפים משמעותיים. שקול פנוטיפים עם Z-ציון> -2 שכאינם מהותי, פנוטיפים עם Z-ציון בין -2 ו -4 קלים ופנוטיפים כעם ≤ Z-ציון -4 חזק.
3. שילובי עלילה של פרמטרים בהתאם לצרכי ניסוי.

תוצאות

עם הבידוד של מוטציות transposon, המושבה פריימר היחידה PCR הוא שיטה לזיהוי האתר של הכנסת transposon לכל מוטציה חזקה, תפוקה גבוהה. גישה זו נובעת מפרוטוקול PCR מקונן טיפוסי אבל כאן פריימר יחיד hybridizes ו / או שאינו ספציפי במיוחד לתבנית ה- DNA בהתאם לחומרה של חישול בטמפרטורה (איור 1 א). מוצרי ה- PCR הטיפוסיים מורכבים ממספר רב של שברי ה- DNA, שרובם ספציפיים (איור 1). השימוש בפריימר רצף שונה שanneals תקין במעלה הזרם של ITR transposon, ומורד זרם של הרצף מוכר על ידי פריימר ההגברה מספק סגוליות לצעד הרצף (איור 1 ג). תוכנה אוטומטית לניתוח רצף מיישרת את הרצפים שהתקבלו לגנום Coxiella מתן האתר של הוספות transposon (איור 1 ג) המדויק. כל הוספות transposon יכולות להיות אז אןotated על הגנום Coxiella (1D איור).

כל מוטציה Coxiella מבודדת ומוגברת axenically בACCM-2 בינוניים לפני או אחסון או הקרנה. איור 2 מדגים דוגמא של 38 מוטציות transposon בנקודת 16 / גני Coxiella ICM (איור 2 א). כדי להעריך את הכדאיות של מוטציות Coxiella, עקומות גדילת axenic מתקבלות על ידי דגימת תרבויות חיידקים למשך 7 ימים לאחר חיסון ויישום assay ריכוז החיידקים מתואר ב1.5 (Figurie 2B). אז מוטציות מוגברות מודגרת עם תאי אפיתל, ב96-גם צלחות בשלושה עותקים למשך 7 ימים. כל מוטציות Coxiella נוצרו להיות מתויג GFP, עקומות גדילה תאיות מתקבלות על ידי מדידת עוצמת הקרינה GFP של כל טוב, בכל שעה 24, וקשירת קשר לערכים שנמדדו כפונקציה של זמן (איור 2 ג).

Intrעקומות גדילה תאיות לספק ניתוח כמותי של פנוטיפים הקשורים כל הכנסת transposon בגנום Coxiella. כדי להוסיף מידע איכותי על אותו מוטציות transposon, בחרנו לרכישת תמונה אוטומטית וניתוח. שבעה ימים שלאחר זיהום, צלחות קבועות, מעובד לimmunofluorescence כמתואר ב 4 ונותחו באמצעות מיקרוסקופ, כמתואר ב5. תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית כגון CellProfiler (Broad Institute, אוטומטי, epifluorescence www.cellprofiler.com) מעבד את הערוצים שנרכשו באופן עצמאי ומגזרים מזוהים אובייקטים לניתוח השוואתי (איור 3). זה מאפשר זיהוי ואפיון מורפולוגי של גרעיני מארח תא, קווי המתאר תא, lysosomes ומושבות Coxiella (איור 3 פנלים העליונים). התאמת מושבות Coxiella עם תאים ומאפשר lysosomes identificatiובניתוח צורני ספציפי של vacuoles המכיל Coxiella (שהם LAMP1 החיובי, איור 3 פנל שמאלי תחתון). התאמת מושבות Coxiella עם קווי המתאר תא מארח מאפשר זיהוי וניתוח צורני ספציפי של תאים נגועים (איור 3 פנל מרכז תחתון). לבסוף, 4 הערוצים ימוזגו להמחשה ולמטרות בקרת איכות (איור 3 פנל ימני תחתון).

נתונים שהתקבלו מניתוח תמונה אוטומטית ניתן להתוות אחד נגד השני כדי להשיג "מגרשי פיזור רב פנוטיפי". כדוגמא, באיור 4 א השטח הממוצע (במיקרומטר ²⁾ של מושבות Coxiella זממו נגד מספר מושבות לכל תא (איור 4 א), על מנת לזהות מוטציות המשפיעות על שכפול תאיים של Coxiella (פנוטיפ שכפול) ו / או היכולת של חיידקים לפלוש תאי מארח (internaפנוטיפ lization). ניתוח סטטיסטי המשמש להגדרת אזורים בעלילת פיזור וכתוצאה מכך המתאימה ולחמור (Z-ציון ≤ -4) פנוטיפים קלים (Z-ציון ≤ -2 -4 <). מוטציות נצפו ב 3 אשכולות עיקריים: מוטציות שגרמו לצמיחה תאית פגומה של Coxiella קובצו בחלק השמאלי ביותר של העלילה (איור 4 א, ​​ורוד ונקודות אדומות); מוטציות שהשפיעו על הפנמת Coxiella בתאים קובצו בחלק התחתון של העלילה (איור 4 א, ​​נקודות אור והצבע כחולים כהה) ולבסוף, נקודות ירוקות בימני ביותר באזור של העלילה מתאימות למוטציות וכתוצאה מכך פנוטיפים שאינם משמעותיים ( Z-ציון> -2). חשוב לציין, מוטציות שאינן מצליחין לשכפל אבל עדיין מסוגל לפלוש לתאי מארח, מזוהות לאחר 7 ימים של זיהום חיידקים בודדים, או מושבות קטנות, סמוכים לארח תא גרעינים (איור 4C, פנל שני). לפיכך, קולו הגודל של Coxiella "nies "יושפע באופן משמעותי, אך מספר התאים נגועים לא להשתנות בהשוואה לתאי -infected WT Coxiella. להיפך, מוטציות המשפיעות על היכולת של Coxiella לפלוש תאי מארח לגרום לירידה במספר מושבות / תא. כאשר מספר זה הוא נמוך משמעותי 1, הוא מציין כי, בממוצע, יש ירידה במספר הכולל של תאים נגועים. לחלופין, השטח הממוצע (במיקרומטר ²⁾ של מושבות Coxiella ניתן להתוות נגד מספר תאי מארח שרדו זיהום (איור 4), לזהות מוטציות המעניקות רעיל לCoxiella (פנוטיפ ציטוטוקסיות). כאמור לעיל, ניתוח סטטיסטי המשמש להגדרת אזורים בעלילת פיזור וכתוצאה מכך המתאימה ולחמור (Z-ציון ≤ -4) פנוטיפים קלים (Z-ציון ≤ -2 -4 <). רוב הוקרן מוטציות לא השפיעו באופן משמעותי הישרדות תא, ללא קשר לשכפול חיידקים בתוך מארחתאים (נקודות ירוקות איור 3). 37 מוטציות הישרדות תא מארח מושפעת במתינות (איור 3, נקודות אדומות אור), ו- 7 מוטציות היו הרסניות, במיוחד לארח הישרדות תא (איור 3, נקודות אדומות כהות). שים לב שפרמטרים נוספים שהושגו על ידי הליך ניתוח תמונה האוטומטי יכולים לשמש כדי להפיק תרשימים אחרים, בהתאם לצרכי ניסוי.

איור 1:. המושבה פריימר יחידה רצף וביאור של מוטציות transposon Coxiella () PCR משמש כדי להגביר קטעי DNA המכילים את האתר של הכנסת transposon. פריימר הגברה (AMP) משמש גם כפריימר ספציפי ולא ספציפי, בהתאם לחומרה של חישול בטמפרטורה. תוצאה אופיינית של המושבה פריימר היחידה PCR (B). כל Reactiבמייצר מספר שברים בגודל משתנה, שחלקם מכילים את אתר הכנסת transposon; כמה אחרים הם מוגברים באופן אקראי כתוצרי לוואי של מחזור PCR חומרה הנמוכה. (ג) השימוש בפריימר רצף (Seq) שhybridizes לרצף transposon מאפשר הרצף של שברים של עניין. תוכנת ניתוח (ד ') רצף מאפשרת ביאור האוטומטי של הוספות transposon על הגנום של החיידקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:. Axenic וצמיחה תאית של מוטציות transposon Coxiella (א) במסך הטייס, יש לנו מבודד, רצף והוקרנו 38 מוטציות transposon בגרם ליבה 16Enes של מערכת הפרשת הנקודה / ICM Coxiella (מצויינים באדום). (ב) על מנת להעריך את הכדאיות של כל מוטציה transposon, הצמיחה של כל הבודד במדיום תרבות axenic מנוטר על 8 ימים באמצעות מתויג fluorescently סוכן intercalating DNA. (ג) כל מוטציה משמשת אז כדי להדביק תאי אפיתל. כtransposon בעל קלטת GFP, התפתחות חיידקים תאית היא פיקוח על 7 ימים של זיהום על ידי ביצוע השינויים של הקרינה GFP קשורה לשכפול Coxiella, באמצעות קורא microplate. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: אוטומטי ניתוח תמונה של זיהומי Coxiella אוטומטי.מיקרוסקופ epifluorescence הזדווגו משמש לתמונה 21 עמדות בכל טוב של 96-גם צלחות בשלושה עותקים. מגזרי תוכנת ניתוח תמונת אובייקטים בכל ערוצים שנרכשו לכימות וניתוח. בכל המקרים, חפצים נוגעים בגבול של התמונות אינם נכללים. () ערוץ Hoechst משמש לזיהוי גרעין תא מארח (מוקף בעיגול ירוק). (ב) אלה משמשים כגרעינים לזהות קווי המתאר תא מארח בערוץ Cy3 (העמדה של גרעינים היא בעיגול כחול, קווי המתאר תא נמצאים בירוק). (C) ערוץ Cy5 משמש לזיהוי תאי LAMP1-חיובי (בעיגול ירוק); רק האובייקטים כלולים בקווי מתאר התא זוהה בעבר (באדום) נשמרים לניתוח תמונה. ערוץ ה- GFP (ד) משמש לזיהוי מושבות Coxiella (מוקף בעיגול ירוק). (ה) התאמת מושבות Coxiella עם תאי LAMP1 חיובי מאפשרת זיהוי של Coxiella Vacuoles המכיל (CCVs); רק האובייקטים הכלולים בקווי מתאר התא זוהה בעבר (בירוק) נשמרים לניתוח תמונה. (F) התאמת מושבות Coxiella עם קווי המתאר תא מאפשר זיהוי של תאים נגועים (pseudocolored). תמונות (G) שנרכשו בערוצי הקרינה 4 (המקביל למושבות Coxiella (ירוק), גרעיני תאי מארח (כחול), קרום פלזמה תא מארח (אפור), תאי LAMP1-חיובי (אדום)) ימוזגו ומשמש להמחשה ואיכות שליטה. בקנה מידה מונעת 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: זיהוי בקנה מידה גדולה של גורמים המעורבים בCoxiella מארח / אינטראקציה הפתוגןהשטח הממוצע (במיקרומטר ²⁾ של מושבות Coxiella זממו נגד המספר היחסי של מושבות לכל תא יונים. (א), לזהות פנוטיפים שכפול והפנמה של עניין. נקודות ירוקות מייצגות פנוטיפים שחורגים מWT Coxiella על ידי Z-ציון> -2 (לא משמעותי). ורוד ונקודות בצבע תכלת מייצגים פנוטיפים שכפול והפנמת בהתאמה, עם Z-ציון בין -2 ו -4 (פנוטיפים קלים). אדום ונקודות בצבע כחולות כהות מייצגים פנוטיפים עם ≤ Z-ציון -4 (פנוטיפים חזקים). השטח הממוצע (במיקרומטר ²⁾ (ב) למושבות Coxiella היה זמם נגד המספר הכולל של תאים (נגוע ולא נגוע) ששרדו 7 ימים של זיהום להעריך את ההשפעה הרעילה לתאים וכתוצאה מהוספות transposon. נקודות ירוקות מייצגות פנוטיפים שחורגים מWT Coxiella על ידי Z-ציון> -2 (לא משמעותי). נקודות הוורודות מייצגות ph ציטוטוקסיותenotypes עם Z-ציון בין -2 ו -4 (פנוטיפים קלים). נקודות אדומות מייצגות פנוטיפים ציטוטוקסיות עם ≤ Z-ציון -4 (פנוטיפים חזקים). חצים מצביעים על מוטציות מאוירות על ידי האות קטנה המקבילה בג (ג) נציג תמונות של שכפול, הפנמה ופנוטיפים ציטוטוקסיות. בכל המקרים, גרעיני תא מארח הם באדום, מושבות Coxiella נמצאות בירוק. בקנה מידה מונעת 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן הוכיח להיות שיטה יוצאת דופן כדי להבין בזיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. עם זאת, בשל המגוון של אסטרטגיות הרחיבו על ידי חיידקים פתוגנים שונה, זיהוי והאפיון של גורמים ארסי חיידקים ושל מארח מסלולי איתות שממוקדים בזיהומים מייצגים אתגר אמיתי. זה קורא לפיתוח גישות החדשות לזיהוי בקנה מידה גדולה של רכזות אינטראקציה המארח / פתוגן מפתח. הפיתוח האחרון של, תפוקה גבוהה חדשנית וטכניקות הקרנה גבוהות תוכן מייצג משאב יקר שיכול להיות מותאם למחקר של חיידקים פתוגנים תאית ^15. הנה, יש לנו בשימוש burnetii Coxiella פתוגן חיידקי zoonotic כמודל לפיתוח גישות הקרנה המשלבות mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת. Importantly, שיטת הקרנה זו מאפשרת ניטור סימולטני של שלבים מרובים של המחזור תאיים Coxiella, מתן סקירה עולמית של האסטרטגיות שפותחו על ידי חיידק זה לפלוש, לשכפל ולהתמיד בתאים נגועים.

הגישה המתוארת כאן מבוססת על שתי טכניקות מבוססות היטב, mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוסס, שיושמו בהצלחה למחקר של חיידקים פתוגנים. שילוב טכניקות אלה בהקשר של מסכי תפוקה גבוהה / גבוה תוכן מאפשר לנו להעריך את ההשפעות של מספר גבוה של מוטציות חיידקים על ידי ניתוח מספר גבוה מאוד של אירועים (בדרך כלל 15,000 תאים נגועים למוטציות חיידקים הם צילמו וניתחו). זה מספק ניתוח סטטיסטי חשוב של אירועים כגון פלישת חיידקים של תאי מארח ושכפול תאיים, שהם, על ידי הטבע, כפופים לשונות גבוהות. חשוב לציין כי שורות תאים אחרות מאשר EPithelial יכול לשמש לסוג זה של הקרנה. עם זאת, תאי האפיתל שטוחים וגדולים הם אופטימליים לניתוח תמונה כאברונים תא המארח הם קלים יותר לזהות. מכיוון שרוב המיקרוסקופים אוטומטיים באופן אוטומטי יכול להתמודד עם מספר רב של צלחות, יש כמעט אין גבול למספר מוטציות שיכולות להיות מוקרן בו זמנית. בהתאם לפתוגן, זכות פחית משתמשים השימוש בepifluorescence או מיקרוסקופ confocal. זמן רכישה של תמונה יהיה בעיקר תלוי ברגישות של המצלמה מיקרוסקופ, על מספר תחומים שנרכשו בכל טוב ובמספר הערוצים שנרכשו לשדה הראייה. המשתמש יכול להחליט כיצד להתאים גורמים אלה כדי לייעל את פרוטוקול ההקרנה. כדוגמא, אנחנו צילמו צלחת / hr 96-גם אחד באמצעות התנאים שצוינו בשלב 5.1. ניתוח תמונה תלוי במידה רבה במחשב (או המקבץ של מכונות) משמש. אנו משתמשים 12 ליבות (2 x 3.06 GHz 6 ליבות), תחנת עבודה RAM 48 GB. מכונה זו דורשת approxiשלו של הדבר 40 דקות כדי לנתח תמונות שנרכשו מצלחת אחת.

היבט חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ​​פיתוח מבחני אלה היא ההגדרה של חדש (או אופטימיזציה של קיימים) פרוטוקולים כדי לאפשר המניפולציה ועיבוד של מספר גדול של דגימות. דוגמא טיפוסית היא הפיתוח של הגישה אחת המושבה פריימר PCR, אשר אפשרה לנו להגביר ומהירות שברי רצף ה- DNA המכילים Coxiella האתר של החדרה של כל transposon, מדוגמאות קטנות מאוד. בהתבסס על הניסיון שלנו, פולימראז באיכות גבוהה צריך להיות שנבחר בקפידה ונבדק על מנת לקבל תוצאות לשחזור. המגבלה היחידה של גישה זו עשויה להסתיר בתצפית ש, ברוב המכריע של המקרים, כ -30% מהדגימות מעובד אינם ניצול, או בשל PCR או צעדי הרצף. עם זאת, בהתחשב בכך שהבידוד של מוטציות transposon Coxiella החדשות הוא לא צעד שער הגבלה, זה לא repreנשלח לנושא מרכזי. באופן דומה, הפיתוח של assay אמין לכמת את ריכוז החיידקים של מניות מוטציה היה מפתח לגישה זו. בשל הנטייה של Coxiella כדי לצבור כאשר בהשעיה, השימוש בקריאת צפיפות אופטית אינו ישימה לחישוב הריכוז של תרבויות Coxiella והחלופה היחידה הקיימת היה PCR כמותית (QPCR). כאן, שימוש סוכן intercalating DNA מתויג fluorescently של האיץ באופן משמעותי את quantitation חיידקים.

גישה זו יכולה גם לנצל את השימוש בשורות תאי יציבות להביע סמני ניאון לכמה תאים תאיים בהתאם לפתוגן בשימוש. היבט חשוב נוסף הוא השימוש בתרבית תאי תקשורת נטולת פנול אדום. הבחנו כי יש אינדיקטור pH זה הקרינה טבעית המשתרעת הספקטרום האדום וירוק שמרווה את האות נרשמה על קורא הקרינה האוטומטית.

Tהוא האסטרטגיה שהוצגה כאן מסתמכת על mutagenesis transposon האקראי. למוטציות של עניין, אנו ממליצים אימות חילופים וייחודיים (וclonality) באמצעות כתם הדרום וamplifications PCR של אתר הכנסת transposon.

מלבד הציוד שתואר בסעיף הפרוטוקול, צוותי המעוניינים להשתמש בגישת ההקרנה שהוצגה כאן, ינצלו גדול בהקמה של מסדי נתונים יחסיים לאיסוף נתונים, שרת לאחסון נתונים ותחנת עבודה לניתוח תמונה מהיר.

חשוב לציין, בשיטה שתוארה כאן מתאים למחקר של חיידקים פתוגנים תאיים אחרים הניתנת על שיטת mutagenesis אקראית קיימת לפתוגן, יכולות להיות נגועות שורות תאים על ידי פתוגן וזה אחד מציג פנוטיפ ספציפי בזיהום.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citric acid	Sigma	C0759-500G	ACCM-2 medium component
Sodium citrate	Sigma	S4641-500G	ACCM-2 medium component
Potassium phosphate	Sigma	60218-100G	ACCM-2 medium component
Magnesium chloride	Sigma	M2670-100G	ACCM-2 medium component
Calcium chloride	Sigma	C5080-500G	ACCM-2 medium component
Iron sulfate	Sigma	F8633-250G	ACCM-2 medium component
Sodium chloride	Sigma	S9625-500G	ACCM-2 medium component
L-cysteine	Sigma	C6852-25G	ACCM-2 medium component
Bacto Neopeptone	BD (Beckton-Dickinson)	211681	ACCM-2 medium component
Casamino acids	BD (Beckton-Dickinson)	223050	ACCM-2 medium component
Methyl-B-cyclodextrin	Sigma	C4555-10G	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax	Gibco	61870-010	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax, without phenol red	Gibco	32404-014	For cell culture and infection
Fetal bovine serum	GE healthcare	SH30071	For cell culture
Trypsin EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056	For cell culture
Saponin	Sigma	47036	For immunofluorescence staining
Ammonium chloride	Sigma	A9434	For immunofluorescence staining
Bovine serum albumin	Sigma	A2153	For immunofluorescence staining
Electroporation cuvette 0.1 cm	Eurogentec	ce0001-50	For Coxiella transformation
Trackmates screw top tubes with caps	Thermo Scientific	3741	2D barcoded screwcap
96-well microplate with black walls and bottom	Greiner	655076	Flat dark bottom, for dsDNA quantitation
96-well PCR microplate	Biorad	2239441	DNAse/RNAse free
96-well plate, deepwell	Labcon	949481	For Coxiella mutants infections
PicoGreen	Life Technologies	P7581	For dsDNA quantitation
Triton X-100	Sigma	T9284-500ML	For dsDNA quantitation
Phusion high fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530L	For single primer colony PCR
Celltracker Red CMTPX	Life Technologies	C34552	For imaging
Anti-LAMP1 antibody	Sigma	94403-1ML	For immunofluorescence staining
Hoechst 33258	Sigma	L1418	For imaging
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro	Tecan
Epifluorescence automated microscope Cellomics	Thermo Scientific