Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Resumo

Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

Resumo

Invasão e colonização de células hospedeiras por agentes patogénicos bacterianos depender da actividade de um grande número de proteínas procarióticas, definida como factores de virulência, que pode subverter e manipular funções principais hospedeiras. O estudo das interações hospedeiro / agente patogénico é, portanto, extremamente importante compreender infecções bacterianas e desenvolver estratégias alternativas para combater as doenças infecciosas. Esta abordagem, no entanto, requer o desenvolvimento de novos ensaios de alto rendimento para a imparcial, identificação e caracterização automatizado de determinantes de virulência da bactéria. Aqui, nós descrevemos um método para a geração de uma biblioteca mutante marcadas com GFP através de mutagénese de transposões e o desenvolvimento de rastreio de alto conteúdo-abordagens para a identificação simultânea de vários fenótipos associada-transposões. O nosso modelo de trabalho é o agente patogénico bacteriano burnetii Coxiella intracelular, o agente etiológico da febre zoonose Q, que está associada com o SEvere surtos, com o consequente saúde e dos custos económicos. A natureza intracelular obrigatório deste patógeno, até recentemente, severamente prejudicado a identificação de fatores bacterianos envolvidos na interação patógeno anfitrião, fazendo de Coxiella o modelo ideal para a implementação de abordagens de alto rendimento / alto conteúdo.

Introdução

A bactéria endêmica emergente Coxiella burnetii é responsável por grandes surtos de febre Q, uma zoonose gripal debilitante com graves na saúde eo impacto económico ^1. Os principais reservatórios de Coxiella são animais domésticos e de quinta, e estima-se que mais de 90% do gado leiteiro em os EUA realizar C. burnetii ^2. Os seres humanos são hospedeiros acidentais que estão infectadas por inalação de aerossóis contaminados. Febre Q humana se manifesta seja como uma doença aguda ou crônica, que pode ter complicações fatais com uma taxa de mortalidade chegar a 65% ^1,3. Com uma dose infecciosa de 1 - 10 organismos, Coxiella é o agente patogénico mais infecciosa, conhecida e tem sido investigado como uma potencial arma bio ^4. O recente surto explosivo de febre Q nos Países Baixos (2007 - 2010), com os casos crescentes de 182 para mais de 2.000 por ano, se destaca como um exemplo da virulência grave deste patógeno^5.

A notável eficiência de infecções Coxiella é provável associada com a sua resistência ao estresse ambiental, combinada com a sua adaptação única para as células hospedeiras. Com efeito, Coxiella está presente no ambiente na forma de variantes de pequenas células metabolicamente inactivas (SCV), que são extremamente resistentes a várias condições adversas (dessecação, temperatura, etc.). VCEs são tomadas pelos células fagocíticas através α _V β ₃ integrinas ⁶ enquanto a invasão de células não fagocíticas é mediada pela adesão Coxiella / invasão OmpA ⁷ e um receptor ainda não identificado. Na sequência de captação, Coxiella reside em vacúolos apertadas, positivas para os marcadores endossomais primeiros Rab5 e EEA1 ^8. Bactérias responder aos endosomal acidificação através da conversão de grandes variantes de células metabolicamente ativas (VCL) e ativar um sistema Dot / Icm tipo 4 secreção (T4SS) ⁹, Altamente homóloga à de Legionella pneumophila ^10. A secreção de effectors Dot / Icm permitir Coxiella para gerar um grande compartimento, LAMP1-positivo ácida contendo enzimas lisossomais activos onde as bactérias podem prosperar e ativamente protegem as células infectadas da apoptose ^11. Assim, o ciclo intracelular de Coxiella é controlada pela translocação Dot / Icm-mediada de efectores bacterianas ^12, no entanto, os factores microbianas envolvidas na invasão de célula hospedeira, a replicação bacteriana e a disseminação da infecção permanecem em grande parte desconhecida.

A combinação de mutagénese de transposões e ensaios baseados em fluorescência, que estão a desenvolver abordagens imparciais para a identificação simultânea de factores bacterianos envolvidos nas principais etapas de infecções Coxiella: 1) internalização dentro das células hospedeiras, 2) replicação intracelular, 3) propagação de célula-a-célula , e 4) de persistência. Até à data, temos selecionados mais de 1.000 mutations em 500 sequências codificantes Coxiella, que nos forneceram com insights sem precedentes sobre as interações patógeno-hospedeiro que regulam Coxiella patogênese ^7. De notar que esta abordagem pode ser aplicada ao estudo de outros agentes patogénicos intracelulares que compartilham características da biologia celular com Coxiella.

Protocolo

1. A geração de uma biblioteca de mutantes por transposões Coxiella GFP

Coxiella burnetii manipular RSA439 NMII em um nível de contenção biossegurança 2 (BSL-2) numa câmara de segurança microbiana (MSC) em conformidade com as regras locais. Se compatível com o modelo bacteriana utilizada, passos de repetição a partir de 1.4.1 a 1.4.4 para aumentar a probabilidade de obter mutantes clonais. Uma biblioteca de mutante típico é composto (pelo menos) de um número de mutantes que é igual a três vezes o número de sequências de codificação anotadas no genoma do organismo utilizado.

1. Preparação de electrocompetentes Coxiella RSA439 NMII:
   1. Prepare 1x ACCM-2 ^13: 13,4 mM de ácido cítrico, citrato de sódio 16,1 mM, 3,67 mM de fosfato de potássio, cloreto de magnésio 1 mM, cloreto de cálcio 0,02 mM, 0,01 mM de sulfato de ferro, cloreto de sódio 125,4 mM, 1,5 mM de L-cisteína, 0,1 g / l de Bacto Neopeptone, 2,5 g / l de casaminoácidos, 1 g / L de metilo beta-ciclodextrina, 125 ml / L de RPMI. Ajustar o pH para 4,75 e esterilizar filtro (não autoclave). Nota: Líquido ACCM-2 é estável a 4 ° C durante aproximadamente 1 mês.
   2. Inocular 100 ml de ACCM-2 com 2 x 10 ⁶ genoma equivalente (GE) / ml de Coxiella RSA439 NMII (a partir de um estoque bacteriana previamente gerado e quantificado tal como no passo 1.5) a partir de estoques de -80 ° C e distribuir a suspensão bacteriana em 75 cm ² frascos de cultura de células com tampas ventiladas (10 - 15 ml de suspensão bacteriana por frasco). Crescer durante 7 dias a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO ₂ e 2,5% _{de O2.}
   3. Reúnem-se os suspensão bacteriana resultante em tubos de 50 ml e centrifugar a 3900 x g durante 1 h a 4 ° C.
   4. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 30 ml de glicerol a 10%. Centrifugar a 3.900 xg durante 1 hora a 4 ° C.
   5. Ressuspender o sedimento num volume adequado de glicerol a 10% (tipicamente de 2 ml) e alíquota de 50 ul em 500 ul tubos. Mantenha ressuspenso bacteria em gelo durante todo o processo. Nota: Nesta fase, as bactérias são electrocompetentes e uma alíquota é suficiente para realizar uma eletroporação. As suspensões bacterianas podem ser armazenadas a -80 ° C durante 6 meses ou ser utilizado directamente para a electroporação de ADN de plasmídeo.
2. Eletroporação de Coxiella competente com transposon- e plasmídeos que codificam transposase:
   Nota: para o seguinte protocolo, o elemento transponível ea transposase são codificados por dois plasmídeos diferentes (PITR-CAT-GFP e pUC19-Himar1C9, respectivamente) ^7. Ambos os plasmídeos não possuem uma origem de replicação específicos de Coxiella, tornando-os plasmídeos suicidas quando electroporado em Coxiella. Isto assegura inserções de transposões estáveis. O elemento transponível contém uma cassete de resistência ao cloranfenicol sob a regulação do promotor p1169 Coxiella para a selecção e o gene GFP sob a regulação do promotor P311 Coxiella para marcar os mutantes gerados com GFP.
   1. Pre-arrefecer uma cuvete de electroporação de 0,1 centímetros a 10 min em gelo. Misturar 50 ul de electrocompetentes Coxiella com 10 ug de plasmídeo transposão e 10 ug de plasmídeo de transposase ^7. Certifique-se de que a concentração de plasmídeo é maior do que 500 ug / ml para minimizar a diluição do glicerol.
   2. Electroporate com a seguinte configuração: 18 kV, 500 Ω, 25 iF. Assegure-se que a constante de tempo resultante está compreendida entre 9 e 13 ms.
   3. Imediatamente adicionar 950 uL de meio RPMI, voltar a suspender as bactérias electroporadas e transferir para um tubo de tampa de rosca e manter à temperatura ambiente.
   4. Tome 200 ul de as bactérias electroporadas e adicionar 3 ml de ACCM-2 suplementado com 1% de calor-inactivado de Soro Fetal Bovino (FBS) em placas de 6 poços. Adicionar 88 ul de DMSO para o volume restante de bactérias electroporadas (para atingir uma concentração final de DMSO a 10%) e armazenar a -80 ° C.
3. Selecção dos mutantes por transposões:
   1. Incubate as placas de 6 poços inoculados como descrito acima (1.2.4) durante a noite a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO ₂ e 2,5% _{de O2.} Adicionar os antibióticos apropriados (375 ug / ml de canamicina ou 3 mg / mL de cloranfenicol). Incubar a cultura bacteriana durante 3 dias adicionais nas condições descritas acima.
4. Isolamento de mutantes individuais:
   1. Preparação de sólidos ACCM-2 placas e plaqueamento de Coxiella mutantes por transposões
      Nota: Seguindo instruções são para uma placa de Petri, várias diluições de culturas bacterianas têm de ser testados para avaliar o volume de inoculação ideal para o isolamento colônia.
      1. Aqueça 10,5 ml de 0,5% de agarose em um forno de microondas e deixe esfriar em um C banho de água 55 °. Aquecer 11,25 ml de 2x ACCM-2 (pH 4,75) a 37 ° C.
      2. Prepare agarose inferior:
         1. Misturar 10 ml de 0,5% de agarose fundida com 10 ml de 2x ACCM-2 e adicionar os antibióticos apropriados (375 ug / ml de canamicina ou 3ug / ml de cloranfenicol).
         2. Derrame imediatamente na placa de Petri. Mantenha o unlidded placa de Petri, deixe o meio legal para 30 min e 20 min para secar ao ar.
      3. Prepare top agarose:
         1. Misture 1,25 mL de 2x ACCM-2 com 0,75 ml de água em um tubo de poliestireno de 5 ml, adicionar os antibióticos apropriados (375 ug / ml de canamicina ou 3 mg / ml de cloranfenicol) e incubação a 37 ° C.
         2. Adicionar a cultura bacteriana (tipicamente de 1 a 100 uL) e agitar com vortex durante 5 segundos.
         3. Adicionar 0,5 ml de agarose derretido, misture e despeje imediatamente na parte inferior de agarose.
         4. Deixa-se arrefecer durante 20 min, substituir a tampa da caixa de Petri e incubar a 4 ° C durante 20 minutos para facilitar a solidificação de agarose.
         5. Ar seco durante 20 min unlidded num MSC. Crescer as placas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO ₂ e O ₂ a 2,5%, durante 6 a 7 dias.
   2. Adicionar DMSO para as bactérias remanescentesl culturas, a fim de chegar a uma concentração final de DMSO a 10% e armazenar a -80 ° C.
   3. Avaliar a diluição óptima da seguinte forma: assegurar que as colónias são 0,5 a 1 mm de diâmetro e são adequadamente isolados para evitar a contaminação cruzada. Descongelar restantes culturas bacterianas a partir do ponto 1.4.2 e placa na diluição apropriada em ACCM 2-ágar, tal como descrito em 1.4.1.2 e 1.4.1.3. Incubar durante 6 a 7 dias, tal como descrito em 1.4.1.3.5.
   4. Uma vez que as colónias são detectáveis, recolher por o corte da extremidade de uma ponta de 1 ml, escolhendo o tampão contendo colónias isoladas e dispersar a colónia por pipetagem em 1,5 ml de ACCM-2 contendo os antibióticos apropriados (375 ug / ml de canamicina ou 3 mg / ml de cloranfenicol) numa placa de 24 poços. Amplificar colónias individuais durante 6 dias nas condições descritas em 1.3.1. No dia 3 de incubação, dispersar os aglomerados de bactérias por pipetagem cada cultura.
   5. Armazenar cada suspensão mutante em tubos de tampa roscada com código de barras 2D em placas de 96 poços em 10% De DMSO a -80 ° C.
5. Avaliação da concentração bacteriana:
   Nota: o seguinte protocolo pode ser aplicado para obter as curvas de crescimento de bactérias mutantes que replicam em meio axénico (ver 1.4.4).
   1. Preparação padrão curva:
      1. Prepara-se uma solução de estoque / ml de 2 ug de ADNcd (tipicamente um plasmídeo conhecido aleatória de tamanho e concentração) em 1x tampão Tris-EDTA (TE). Preparar 10 diluições em série a partir da solução de reserva para se obter as concentrações que variam de 2 ug / ml a 2 ng / ml. Pipetar 50 ul de cada concentração a cavidades individuais de uma microplaca de 96 poços, com paredes pretas e fundo (ver Tabela de Materiais).
      2. Dilui-se a quantificação reagente dsDNA 1: 200 em tampão 1x TE e adicionar 55 ul de reagente a cada amostra diluída na microplaca de 96 poços. Misturar bem utilizando um agitador de placas e incubar durante 2 a 5 min à temperatura ambiente, no escuro.
      3. Medir a fluorescência de amostras usando uma fluorescêncialeitor de microplacas nce e filtros para comprimentos de onda padrão de fluoresceína (excitação ~ 480 nm, emissão de ~ 520 nm).
      4. Traça-se a gama de concentrações de plasmídeo contra as leituras de intensidade de fluorescência.
   2. Quantificação suspensão bacteriana:
      1. Pipetar 5 ul de 10% de Triton X-100 por poço numa microplaca de 96 poços, com paredes pretas e fundo (ver Tabela de Materiais). Adicionar 50 ul das suspensões bacterianas a cada poço e incuba-se 10 min à temperatura ambiente, num agitador de placas.
      2. Dilui-se a quantificação reagente dsDNA 1: 200 em tampão 1x TE e adicionar 55 ul de reagente a cada amostra diluída na microplaca de 96 poços. Misturar bem utilizando um agitador de placas e incubar durante 2 a 5 min à temperatura ambiente, no escuro.
      3. Medir a fluorescência de amostras utilizando um leitor de microplacas de fluorescência nos comprimentos de onda e filtros padrão de fluoresceína (~ excitação 480 nm, emissão 520 nm) ~.
      4. Para obter o DN bacterianaA concentração, traçar as leituras de fluorescência no gráfico obtido no ponto 1.5.1.4. Dividir a concentração de ADN pela massa do genoma Coxiella (2,2 fg) para se obter concentrações bacterianas. Expresse resultados em Genome / ml equivalentes.
      5. Descartar mutantes que exibem um defeito crescimento significativo no ACCM-2.

2. Single Primer Colony PCR, seqüenciamento e anotação

Nota: o seguinte protocolo para a amplificação de ADN é de 96 amostras, uma pipeta de canais múltiplos é recomendada para os passos seguintes. Coluna de purificação de produtos de PCR usando pérolas magnéticas e sequenciação de ADN com um primer específico do transposon (2.3) são subcontratada a uma empresa externa.

1. Certifique-se de que o iniciador de amplificação é concebido de modo a hibridar entre 100 e 200 pares de bases a montante da repetição em tandem invertida (ITR), para se obter produtos de PCR cobrindo o local de inserção do transposão no Coxiellum genoma. Prepare a 3 ml de mistura de PCR (1x tampão de alta fidelidade, 200 uM de dNTP, 1 pM de iniciadores de amplificação, 20 U / ml de DNA polimerase de alta fidelidade) e dispensar 29 ul por poço numa placa de 96 poços de PCR definida em gelo. Transferência de 1 ml de cada mutante em fase estacionária em ACCM-2 para a mistura de PCR.
2. Executar PCR com desnaturação inicial (98 ° C, 1 min), 20 ciclos de elevada severidade (98 ° C, 10 s; 50 ° C, 30 s; 72 ° C, 90 seg), 30 ciclos de restringência baixas (98 ° C, 10 s; 30 ° C, 30 s; 72 ° C, 90 seg) e 30 ciclos de elevada severidade (98 ° C, 10 seg; 50 ° C, 30 s; 72 ° C, 90 seg), seguido por uma extensão final a 72 ° C durante 7 min.
3. Purifica-se os produtos de PCR utilizando esferas magnéticas e sequência de DNA com um iniciador específico do transposão. Conceber o iniciador específico do transposão com uma temperatura de fusão compreendida entre previsto um teor de GC entre 40% e 60% a 50 ° C e 75 ° C, um comprimento entre 18 e 25 nucleótidos e um SI de recozimentote a jusante do local de hibridação de iniciadores de amplificação e, pelo menos, 100 pares de bases a montante do primeiro par de bases da ITR transposão.
4. Usando o software de análise de sequência, coloque o genoma completo, com anotações de Coxiella burnetii 493 NMI. Use a função de "alinhar a referência" para carregar e alinhar (blastn) os resultados de sequenciamento e determinar o local de transposição. Descarte mutantes com não-correspondência e / ou exibição de duplas reads.To monitorar a saturação da biblioteca mutante, manter um registro de ocorrência de várias inserções de transposões no mesmo local.

3. As células eucarióticas desafio com Coxiella Mutantes e monitoramento do crescimento intracelular

Nota: Uma pipeta multicanal é recomendada para os passos seguintes. As infecções foram realizadas em triplicado em estéril microplacas de 96 poços, com paredes pretas e fundo transparente plana. burnetii em peso Coxiella expressando GFP ¹⁴ wtal como previsto pelo Dr. Robert Heinzen.

1. Cultivar células Vero em meio RPMI sem soro suplementado com 10% de bovino fetal (FBS) vermelho de fenol na ausência de antibióticos (Conclua meio RPMI).
2. O dia antes da infecção, lavar as células Vero confluentes de um frasco de cultura de células ou sub-confluentes com 10 ml de PBS.
3. Separe as células Vero através da adição de 1 ml de solução de EDTA de tripsina para o frasco de cultura de células e incubar durante 3 a 5 min a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO _2.
4. Ressuspender as células em 10 ml de meio RPMI completo. Contagem de células e preparar uma suspensão de células de 10 de células por ⁵ ml.
5. Dispensar 100 ul da suspensão de células em cada poço de uma placa de 96 poços com fundo preto transparente plana.
6. Centrifugar durante 5 minutos a 400 xg à temperatura ambiente para facilitar a adesão de células no fundo dos poços e incubar durante a noite a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO _2.
7. Descongelar as placas de 96 poços contendo o Comutantes xiella à TA e diluir 150 uL de suspensão bacteriana em 300 ul de meio RPMI sem vermelho de fenol e de FBS numa placa de poços profundos de 96 poços.
8. Remover o meio do microplacas contendo células Vero e dispensar 100 ul / poço de mutantes Coxiella diluído (MOI de 100). Use bem A1 como negativo (células não-infectadas) de controle de poços e A2 e A3 como controlos positivos (células infectadas com peso Coxiella expressando GFP ¹⁴ a multiplicidades de infecção (MOI) de 100 e 200).
9. Centrifugar a placa durante 10 minutos a 400 xg à temperatura ambiente usando um suporte da placa de centrífuga de aerossol estanque.
10. Incubar a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO ₂ durante 2 h, em seguida substituir bactérias contendo meio com 100 ul / poço de, meio RPMI completo fresco.
11. Medir a fluorescência de GFP todos os dias durante 7 dias, usando um leitor de microplacas de fluorescência nos comprimentos de onda e filtros padrão de fluoresceína (~ excitação 480 nm, emissão 520 nm) ~. Evitarinterferência devido à condensação e dispersão do sinal no meio de cultura, utilizar excitação inferior e gravação das emissões com o leitor de microplacas.

4. Preparação de Amostras para Automated Aquisição de Imagem

Nota: O procedimento é para uma placa de 96 poços, dimensionar-se os volumes em conformidade. Passos de 4.2 podem tirar proveito de um lavador de placas.

1. No 7 ^° dia após a infecção, remover o meio de placa e substitui-la com 50 ul / poço de, meio completo fresco contendo um corante fluorescente permeável célula na diluição apropriada (normalmente 1: 1000, deve ser optimizado de acordo com a linha celular utilizada ). Incubar as células para 30 - 60 min a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO _2.
2. Substituir meio com 50 ul / poço de 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS, incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente (RT), em seguida, remover o tampão contendo PFA e lavar 3 vezes com PBS.
3. Remover PBS e dispense 50 ul / poço de solução (0,5% de albumina de soro bovino, 50 mM NH ₄ Cl em PBS, pH 7,4) suplementado com 0,05% de saponina de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
4. Substituir solução de bloqueio com 40 ul / poço de solução de bloqueio fresco suplementado com saponina (como acima) e com um anticorpo anti-LAMP1 a uma diluição de 1: 500. Incubar a placa durante 30 minutos à temperatura ambiente.
5. Remova a solução de bloqueio e lavar a placa de 96 poços 5 vezes com 100 ul / poço de PBS.
6. Pipetar 40 ul / poço de solução suplementada com saponina (como acima), o anticorpo secundário marcado de modo fluorescente apropriado (a uma diluição de 1: 1000) de bloqueio para revelar o anticorpo anti-LAMP1 aplicada no passo 4.4, e com Hoechst 33258 a 5 ug / ml. Incubar a placa durante 30 minutos à temperatura ambiente.
7. Remova a solução de bloqueio e lavar a placa de 96 poços 5 vezes com 100 ul / poço de PBS. Deixar o volume de PBS correspondente à última lavagem, na placa de 96 poços, como as células fixadas não deve secar.
8. Imagem da placa imediatamente ou armazenar a placa a 4 ° C, protegido da luz, para posterior análise.

5. Aquisição de Imagem

1. Adquirir imagens da GFP (488 nm, bactérias), Hoechst 33258 (350 nm, célula hospedeira núcleos), vermelho (~ 555 nm, membrana celular marcador) e vermelho distante (~ 615 nm, LAMP1) canais usando um microscópio de epifluorescência automatizado equipados com uma objectiva 20X. Adquirir 21 campos independentes por poço, a fim de imagem um mínimo de 5.000 células por amostra. Aplicar a focagem automática utilizando o canal de núcleos da célula hospedeira como uma referência. Quando se trabalha com agentes patogénicos bacterianos infectar uma percentagem baixa de células hospedeiras, os utilizadores podem ajustar o número de campos independentes fotografada por poço, a fim de obter um mínimo de 500 células infectadas a analisar.

6. Processamento de Imagem

Nota: as seguintes etapas são específicas para o uso do software de análise de imagem CellProfiler. Em todos os casos, o algorit óptimahm para segmentação deve ser definido experimentalmente e os objectos que toca a fronteira da imagem deve ser eliminado com a função apropriada.

1. Carregar todas as imagens em CellProfiler.
2. Utilizar o módulo "ImageMath" para subtrair o canal de GFP a partir do canal de Hoechst, para evitar a detecção de colónias Coxiella (também marcados por Hoechst) como núcleos de células hospedeiras nas seguintes etapas.
3. Use o módulo "IdentifyPrimaryObjects" a núcleos de células hospedeiras segmento a partir da imagem resultante do passo 6.2. Nomeie os objetos segmentados "núcleos".
4. Use o módulo "IdentifySecondaryObjects" a células hospedeiras segmento dos 555 imagens nm usando os núcleos detectados no passo 6.3 como sementes. Nomeie os objetos segmentados "células".
5. (Opcional) Use o módulo "IdentifyTertiaryObjects" para subtrair núcleos identificados no passo 6.3 a partir de células identificadas no passo 6.4. Nomeie os objetos segmentados "Cytoplasm221 ;.
6. Use o módulo "EnhanceOrSuppressFeatures" nas imagens nm 615 para remover o fundo e facilitar a seguinte identificação de compartimentos LAMP1-positivo.
7. Use o módulo "IdentifyPrimaryObjects" sobre a imagem obtida na etapa 6.6 para identificar compartimentos LAMP1-positivo. Nomeie os objetos segmentados "Os lisossomos".
8. Use o módulo "IdentifyPrimaryObjects" a imagem em 488 nm para identificar colónias Coxiella. Nomeie os objetos segmentados "colônias".
9. Use o módulo "IdentifySecondaryObjects" nas imagens nm 615 para identificar vacúolos contendo Coxiella usando as colônias Coxiella detectados no passo 6.8 como sementes. Nomeie os objetos segmentados "ccvs".
10. Use o módulo "MaskObjects" para selecionar ccvs detectados em células (como células tocando a borda da imagem, foram eliminados, alguns ccvs podem ser detectadas células "de fora"). Nomeie as resulting objetos "ccvs filtrados".
11. Use o módulo "MaskObjects" para selecionar colônias detectados em células (como células tocando a borda da imagem foram eliminadas, algumas colônias podem ser detectadas células "de fora"). Nomeie os objetos resultantes "colônias" filtradas.
12. Use o módulo "MaskObjects" para associar lisossomos para as células. Nomeie os objetos resultantes "Filtered lisossomos".
13. Use o módulo "MaskObjects" para selecionar as células que contêm colônias Coxiella. Nomeie os objetos resultantes "células infectadas".
14. Use o módulo "Relacionar objetos" para definir os objetos "ccvs filtradas" como filhos dos objetos pai "Células". Isto irá permitir a contagem do número de ccvs / celular.
15. Use o módulo "Relacionar objetos" para definir os objetos de "colônias" filtradas como os filhos dos objetos pai "células". Isso vaipermitir a contagem do número de colónias / celular.
16. Use o módulo "Relacionar objetos" para definir os objetos "Filtered lisossomos" como os filhos dos objetos pai "células". Isto irá permitir a contagem do número de lisossomos / celular.
17. Use o módulo "MeasureObjectSizeShape" para obter uma análise morfológica dos núcleos, células, ccvs filtrado, Colônias filtrada e filtrada lisossomos
18. Use o módulo "MeasureObjectIntensity" para quantificar a fluorescência da GFP associado com Filtered ccvs e estimar a eficiência de replicação Coxiella dentro ccvs.
19. Usando os módulos "OverlayOutlines" e "SaveImages" sobrepor os resultados de segmentação e da imagem original para controle de qualidade.
20. Use o módulo "ExportToSpreadsheet" para exportar a totalidade ou uma selecção dos resultados da análise de imagem.
21. (Opcional) Use o módulo "ExportToDatabase" para analisar os resultadosutilizando o Analyst CellProfiler software.

Análise 7. Dados

1. Para cada parâmetro obtido, identificar e eliminar os valores extremos (devido a erros de segmentação de imagem), então, calcular os valores médios por mutante.
2. Use Z-scores para identificar fenótipos significativos. Considere fenótipos com um Z-score> -2 como não significativo, fenótipos com um Z-score entre -2 e -4 como leve e fenótipos com uma ≤ Z-score -4 tão forte.
3. Combinações Lote de parâmetros de acordo com as necessidades experimentais.

Resultados

Após o isolamento de mutantes por transposões, única colónia de iniciadores de PCR é um método robusto, de alto rendimento para identificar o local de inserção de transposões para cada mutante. Esta abordagem deriva de um protocolo típico de PCR aninhada, mas aqui uma única escorva híbrida especificamente e / ou não-especificamente ao ADN molde, dependendo da severidade da temperatura de emparelhamento (Figura 1A). Os produtos de PCR típicas consistem de vários fragmentos de DNA, a maioria dos quais são específicos (Figura 1B). O uso de um iniciador de sequenciação diferentes que emparelha direito a montante da ITR de transposões, e a jusante da sequência reconhecida pelo iniciador de amplificação fornece especificidade para o passo de sequenciação (Figura 1C). Automated software para análise da sequência alinha as sequências obtidas para o genoma Coxiella proporcionando o local exacto de inserções de transposões (Figura 1C). Todas as inserções de transposões pode ser, em seguida, Annotated no genoma Coxiella (Figura 1D).

Cada mutante Coxiella é isolado e amplificado em culturas puras ACCM-2 antes ou meio de armazenamento ou de rastreio. A Figura 2 ilustra um exemplo de 38 mutantes por transposões em 16 pontos / genes Coxiella ICM (Figura 2A). Para avaliar a viabilidade de mutantes Coxiella, curvas de crescimento axénicos são obtidos por amostragem culturas bacterianas durante 7 dias após a inoculação e a aplicação do ensaio de concentração de bactérias descrito em 1.5 (Figurie 2B). Mutantes amplificados foram então incubadas com as células epiteliais, em triplicado em placas de 96 cavidades durante 7 dias. Todos os mutantes gerados Coxiella sendo marcado com GFP, as curvas de crescimento intracelulares são obtidos através da medição da intensidade de fluorescência da GFP de todos os poços, a cada 24 horas, e traçando os valores medidos como uma função do tempo (Figura 2C).

IntrAs curvas de crescimento acelulares fornecer uma análise quantitativa dos fenótipos associados com cada inserção de transposão no genoma Coxiella. Para adicionar informações qualitativas sobre os mesmos mutantes por transposões, optamos por aquisição de imagem automatizada e análise. Sete dias após a infecção, as placas são fixos, processado por imunofluorescência como descrito em 4 e analisados ​​utilizando um sistema automatizado, microscópio de epifluorescência, conforme descrito no 5. automatizado software de análise de imagem, tais como CellProfiler (Instituto Broad, www.cellprofiler.com ) processa os canais adquiridos de forma independente e os segmentos identificados objectos de análise comparativa (Figura 3). Isto permite a identificação e caracterização morfológica dos núcleos de células hospedeiras, os contornos celulares, lisossomas e Coxiella colónias (Figura 3 painéis superiores). Correlacionando colônias Coxiella com células e permite que os lisossomos identificatie na análise morfológica específica de Coxiella vacúolos molecular contendo (que são LAMP1 positivo, a Figura 3 painel inferior esquerdo). Correlacionando colônias Coxiella com contornos célula hospedeira permite a identificação e análise morfológica específica de células infectadas (Figura 3 painel central inferior). Finalmente, os quatro canais são mesclados para fins de controle de qualidade e ilustração (Figura 3 painel inferior direito).

Os dados obtidos a partir de análise de imagem automatizada pode ser representada graficamente contra o outro para se obter "diagramas de dispersão de multi-fenotípicas". A título de exemplo, na Figura 4A a área média (em uM ²⁾ de colónias Coxiella é representada em função do número de colónias por células (Figura 4A), a fim de identificar mutações que afectam a replicação intracelular de Coxiella (fenótipo de replicação) e / ou a capacidade das bactérias para invadir as células hospedeiras (internazação fenótipo). A análise estatística foi utilizado para definir as regiões no gráfico de dispersão resultante correspondendo a leve (-4 (Figura 4A, rosa e pontos vermelhos); mutações que afetaram internalização Coxiella em células foram agrupados na parte inferior do gráfico (Figura 4A, luz e azul escuro pontos) e, finalmente, pontos verdes no mais à direita região da trama correspondem a mutações, resultando em fenótipos não-significativos ( Z-score> -2). É importante ressaltar que os mutantes que não conseguem replicar, mas ainda são capazes de invadir as células hospedeiras, são detectados após 7 dias de infecção como bactérias individuais ou pequenas colónias adjacentes, para sediar núcleos celulares (Figura 4C, segundo painel). Assim, o tamanho de Coxiella "Colosas "será significativamente afectada, mas o número de células infectadas não irá variar, em comparação com as células infectadas pelo WT Coxiella. Pelo contrário, as mutações que afectam a capacidade de Coxiella de invadir células hospedeiras resultar numa diminuição do número de colónias / célula. Quando este número é significativamente inferior a 1, que indica que, em média, há uma diminuição no número total de células infectadas. Em alternativa, a área média (em uM ²⁾ de colónias Coxiella pode ser registada em função do número de células hospedeiras sobreviventes infecção (Figura 4B), para identificar mutações que conferem citotoxicidade para Coxiella (fenótipo citotóxico). Como acima, a análise estatística foi utilizado para definir as regiões no gráfico de dispersão resultante correspondendo a leve (-4 (Figura 3B pontos verdes). 37 mutações sobrevivência da célula hospedeira levemente afetado (Figura 3B, pontos de luz vermelha), e 7 mutações foram particularmente prejudicial para sediar a sobrevivência das células (Figura 3B, pontos vermelho escuro). Por favor note que os parâmetros adicionais obtidos pelo processo automatizado de análise de imagem pode ser usada para derivar outras tabelas, de acordo com as necessidades experimentais.

Figura 1:. A sequenciação e anotação dos mutantes por transposões Coxiella (A) colónia único iniciador de PCR é utilizado para amplificar fragmentos de DNA contendo o local de inserção de transposão. Um iniciador de amplificação (AMP) é utilizado tanto como um iniciador específico e não específico, dependendo da severidade da temperatura de recozimento. (B) resultado típico da única colónia de iniciadores de PCR. Cada Reactiem produz um número de fragmentos de tamanho variável, algumas das quais contêm o local de inserção do transposão; alguns outros, são amplificados ao acaso como subprodutos do ciclo de PCR de baixa restringência. (C) O uso de um iniciador de sequenciação (Seq) que hibrida com a sequência de transposões permite a sequenciação dos fragmentos de interesse. Software (D) A análise da seqüência permite a anotação automática de inserções de transposões no genoma bacteriano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. Axenic e crescimento intracelular de Coxiella mutantes por transposões (A) Na tela de piloto, temos isolado, sequenciado e rastreados 38 mutantes por transposões em 16 g de núcleoenos o sistema de secreção de pontos / icm Coxiella (indicados a vermelho). (B) A fim de avaliar a viabilidade de cada mutante de transposão, o crescimento de cada isolado em meio de cultura axénica é monitorizado ao longo de 8 dias, utilizando um agente fluorescente intercalante com etiquetas de ADN. (C) Cada mutante é então utilizado para infectar as células epiteliais. Como o transposon possui uma cassete de GFP, o crescimento bacteriano intracelular é monitorado mais de 7 dias de infecção, seguindo as variações de fluorescência da GFP associada à replicação Coxiella, usando um leitor de microplacas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: automatizado de análise de imagem de infecções Coxiella Um auto.Acoplado microscópio de epifluorescência, é utilizado para a imagem 21 posições por poço em triplicado de placas de 96 poços. Os segmentos de software de análise de imagem objetos em cada canais adquiridos para a quantificação e análise. Em todos os casos, os objetos que tocam a fronteira das imagens são excluídos. (A) O canal Hoechst é usado para identificar os núcleos de células hospedeiras (circulado em verde). (B) Estes são utilizados como sementes para identificar os contornos da célula hospedeira no canal Cy3 (a posição dos núcleos é circulado em azul, contornos celulares estão em verde). (C) O canal Cy5 é usado para identificar os compartimentos LAMP1-positivo (circulado em verde); apenas os objetos incluídos nos contornos de células previamente identificadas (em vermelho) são retidas para análise de imagens. (D) O canal de GFP é utilizada para identificar colónias Coxiella (circulado em verde). (E) Correlacionando colônias Coxiella com compartimentos LAMP1-positivo permite a identificação de Coxiella vacúolos molecular contendo (CCVS); apenas os objetos incluídos nos contornos de células previamente identificadas (em verde) são retidas para análise de imagens. (F) correlacionar a colónias Coxiella com contornos celulares permite a identificação de células infectadas (pseudocolored). (G) Imagens adquiridos nos 4 canais de fluorescência (correspondendo a colônias Coxiella (verde), núcleos de células hospedeiras (azul), membrana plasmática da célula hospedeira (cinza), compartimentos LAMP1-positivo (vermelho)) são fundidas e usado para a ilustração e qualidade ao controle. Escala de barras 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: identificação em larga escala de fatores Coxiella envolvidas no host / interagem patógenoíons. (A) A área média (em mm ²⁾ de colônias Coxiella é plotado contra o número relativo de colônias por célula, para identificar de replicação e de internalização fenótipos de interesse. Pontos verdes representam fenótipos que se afastam do WT Coxiella por um Z-score> -2 (não significativa). Rosa e os pontos azuis representam luz de replicação e de internalização fenótipos respectivamente, com um escore Z entre -2 e -4 (fenótipos leves). Vermelho e pontos azuis escuras representam fenótipos com uma ≤ Z-score (-4 fenótipos fortes). (B) A área média (em uM ²⁾ de colónias Coxiella foi representada graficamente em função do número total de células (infectados e não infectados) que sobreviveram 7 dias após a infecção para calcular o efeito citotóxico resultante de inserções de transposões. Pontos verdes representam fenótipos que se afastam do WT Coxiella por um Z-score> -2 (não significativa). Pontos cor de rosa representam citotóxica phenotypes com um Z-score entre -2 e -4 (fenótipos leve). Pontos vermelhos representam fenótipos citotóxicos com uma ≤ Z-score (-4 fenótipos fortes). As setas indicam os mutantes ilustrados pela letra minúscula correspondente em C. (C) Imagens representativas de replicação, internalização e fenótipos citotóxicos. Em todos os casos, os núcleos de células hospedeiras estão em vermelho, Coxiella colónias estão a verde. Escala de barras de 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O estudo das interacções hospedeiro / agentes patogénicos tem provado ser um método notável compreender infecções bacterianas e desenvolver estratégias alternativas para combater doenças infecciosas. No entanto, devido à diversidade de estratégias elaboradas por diferentes agentes patogénicos bacterianos, a identificação e caracterização de factores de virulência da bactéria e do hospedeiro vias de sinalização que são alvo de infecções durante representam um verdadeiro desafio. Esta situação exige o desenvolvimento de novas abordagens para a identificação em larga escala de chave host / patógenos centros de interação. O desenvolvimento recente do inovador, de alto rendimento e técnicas de rastreio de alto conteúdo representa um recurso valioso que pode ser adaptado para o estudo de agentes patogénicos bacterianos intracelulares ^15. Aqui, usamos o zoonótica bacteriana burnetii patógeno Coxiella como um modelo para desenvolver abordagens de triagem que combinam mutagénese por transposões e ensaios baseados em fluorescência. Importantly, este método de rastreio permite o monitoramento simultâneo de várias etapas do ciclo intracelular Coxiella, proporcionando uma visão global das estratégias desenvolvidas por esta bactéria para invadir, replicar e persistir dentro das células infectadas.

A abordagem aqui descrita baseia-se em duas técnicas bem estabelecidas, mutagénese por transposões e ensaios baseados em fluorescência, que têm sido aplicados com sucesso para o estudo de agentes patogénicos bacterianos. Combinando estas técnicas no âmbito das telas de elevado rendimento / alto conteúdo permite-nos avaliar o efeito de um grande número de mutações bacterianas por meio da análise um número muito elevado de eventos (normalmente 15.000 células infectadas por mutações bacterianas são fotografados e analisados). Isso fornece uma análise estatística importante de eventos tais como a invasão bacteriana de células hospedeiras e replicação intracelular, que são, por natureza, sujeito a alta variabilidade. É importante notar que as outras linhas celulares que EPithelial pode ser utilizado para este tipo de rastreio. No entanto, as células epiteliais e planas grandes são adequados para a análise de imagem como organelos celulares hospedeiras são mais fáceis de detectar. Porque a maioria dos microscópios automatizados pode lidar automaticamente um grande número de placas, praticamente não há limites para o número de mutantes que podem ser rastreados simultaneamente. Dependendo do agente patogénico, o utilizador pode privilegiar a utilização de um epifluorescência ou um microscópio confocal. O tempo de aquisição de imagem irá principalmente depender da sensibilidade da câmara do microscópio, com o número de campos adquiridos por poço e sobre o número de canais adquiridos por campo de visão. O usuário pode decidir como ajustar esses fatores para otimizar o protocolo de triagem. Como um exemplo, que trabalhada uma placa de 96 poços / h utilizando as condições indicadas no ponto 5.1. A análise de imagem depende em grande parte da máquina (ou um conjunto de máquinas) utilizado. Nós usamos um 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB RAM estação de trabalho. Esta máquina exige aproximadamente 40 min para analisar imagens obtidas a partir de uma placa.

Um aspecto importante a ter em conta no desenvolvimento destes ensaios é a criação de novo (ou a optimização de protocolos existentes) para permitir a manipulação e processamento de um grande número de amostras. Um exemplo típico é o desenvolvimento da colónia única abordagem de PCR primário, o que nos permitiu amplificar rapidamente e fragmentos de sequência de ADN Coxiella contendo o local de inserção de transposão cada, a partir de amostras muito pequenas. Com base na nossa experiência, a polimerase de alta fidelidade tem de ser cuidadosamente seleccionados e testados a fim de obter resultados reprodutíveis. A única limitação desta abordagem podem esconder-se na observação de que, na maioria dos casos, cerca de 30% das amostras processadas não são exploráveis, quer devido ao PCR ou as etapas de sequenciação. No entanto, considerando que o isolamento de novos mutantes por transposões Coxiella não é um passo limitante da velocidade, isto não represenenviou uma questão importante. Do mesmo modo, o desenvolvimento de um ensaio fiável para a quantificação da concentração bacteriana de existências mutantes tem sido a chave para esta abordagem. Devido à tendência de Coxiella para agregar quando em suspensão, a utilização das leituras da densidade óptica não é aplicável para calcular a concentração de culturas e Coxiella a única alternativa existente foi de PCR quantitativa (qPCR). Aqui, a utilização de um agente intercalante de ADN fluorescente etiquetado acelerou significativamente bactérias quantificação.

Esta abordagem também pode tomar vantagem da utilização de linhas de células estáveis ​​que expressam marcadores fluorescentes para vários compartimentos intracelulares, dependendo do agente patogénico utilizada. Outro aspecto importante é a utilização de meios de cultura celular isento de vermelho de fenol. Observou-se que este indicador de pH tem uma fluorescência natural que mede o espectro vermelho e verde que satura o sinal gravado no leitor de fluorescência automatizado.

Tele estratégia aqui apresentada baseia-se na mutagénese de transposão aleatório. Para os mutantes de interesse, recomendamos validar transposições únicas (e clonalidade) utilizando transferência de Southern e amplificações de PCR do local de inserção do transposão.

Além dos equipamentos descritos na seção de protocolo, equipes interessadas em usar a abordagem de triagem aqui apresentado, terá grande vantagem no set up de um banco de dados relacional para coleta de dados, um servidor para armazenamento de dados e uma estação de trabalho para análise de imagem rápida.

Mais importante, o método aqui descrito é adequado para o estudo de outros agentes patogénicos bacterianos intracelulares proporcionado um método de mutagénese aleatória existe para o agente patogénico, as linhas celulares podem ser infectadas pelo agente patogénico e este exibe um fenótipo específico durante a infecção.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citric acid	Sigma	C0759-500G	ACCM-2 medium component
Sodium citrate	Sigma	S4641-500G	ACCM-2 medium component
Potassium phosphate	Sigma	60218-100G	ACCM-2 medium component
Magnesium chloride	Sigma	M2670-100G	ACCM-2 medium component
Calcium chloride	Sigma	C5080-500G	ACCM-2 medium component
Iron sulfate	Sigma	F8633-250G	ACCM-2 medium component
Sodium chloride	Sigma	S9625-500G	ACCM-2 medium component
L-cysteine	Sigma	C6852-25G	ACCM-2 medium component
Bacto Neopeptone	BD (Beckton-Dickinson)	211681	ACCM-2 medium component
Casamino acids	BD (Beckton-Dickinson)	223050	ACCM-2 medium component
Methyl-B-cyclodextrin	Sigma	C4555-10G	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax	Gibco	61870-010	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax, without phenol red	Gibco	32404-014	For cell culture and infection
Fetal bovine serum	GE healthcare	SH30071	For cell culture
Trypsin EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056	For cell culture
Saponin	Sigma	47036	For immunofluorescence staining
Ammonium chloride	Sigma	A9434	For immunofluorescence staining
Bovine serum albumin	Sigma	A2153	For immunofluorescence staining
Electroporation cuvette 0.1 cm	Eurogentec	ce0001-50	For Coxiella transformation
Trackmates screw top tubes with caps	Thermo Scientific	3741	2D barcoded screwcap
96-well microplate with black walls and bottom	Greiner	655076	Flat dark bottom, for dsDNA quantitation
96-well PCR microplate	Biorad	2239441	DNAse/RNAse free
96-well plate, deepwell	Labcon	949481	For Coxiella mutants infections
PicoGreen	Life Technologies	P7581	For dsDNA quantitation
Triton X-100	Sigma	T9284-500ML	For dsDNA quantitation
Phusion high fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530L	For single primer colony PCR
Celltracker Red CMTPX	Life Technologies	C34552	For imaging
Anti-LAMP1 antibody	Sigma	94403-1ML	For immunofluorescence staining
Hoechst 33258	Sigma	L1418	For imaging
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro	Tecan
Epifluorescence automated microscope Cellomics	Thermo Scientific