Método de cuantificación del tumor bioluminiscencia-base para la progresión tumoral Monitoreo y efectos del tratamiento en modelos de ratón linfoma

Resumen

Imágenes de bioluminiscencia es una herramienta bien conocida para la localización de tumores y metástasis, pero la cuantificación de estas imágenes a menudo requiere cálculos complejos e instrumentos particulares. Se describe el método luminoscore de usar fácil, sobre la base de condiciones de adquisición precisas, que no requiere de cálculos, y que permite la carga tumoral y la respuesta al tratamiento a ser monitoreados en modelos de ratón.

Resumen

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Introducción

La detección de células tumorales Early sigue siendo un reto y es crucial para la mejora de la eficacia del tratamiento del cáncer. In vivo imágenes de bioluminiscencia (BLI) es una técnica óptica no invasivo muy sensible, ampliamente utilizado para el seguimiento de tumores en animales pequeños. Células de luciferasa que expresan la luciérnaga se usan comúnmente para tales experimentos ^1,2. Este oxigenasa oxida D-luciferina con el oxígeno molecular, pero requiere dos cofactores - Mg ²⁺ y trifosfato de adenosina ^3. La luciferasa de luciérnaga es más adecuado para formación de imágenes in vivo de la luciferasa de renilla ^4, ya que su rendimiento cuántico es mayor.

El sustrato oxidado - oxiluciferina - emite espontáneamente un fotón para volver a su estado fundamental y luego se vuelve inactiva. Los fotones emitidos tienen una longitud de onda máxima alrededor de 530 nm. Una cámara de alta sensibilidad puede detectar los fotones luminiscentes desde el interior de un pequeño animal y proporcionar imágenes que lo hacen POSSIble para localizar las células tumorales.

La capacidad de cuantificar con precisión la carga tumoral por recuentos de fotones podría servir como una herramienta poderosa y sensible para la cuantificación de la eficacia del tratamiento. Debido a que los efectos del tratamiento pueden ser detectados antes, esta sensibilidad puede hacer que sea posible determinar el momento exacto en el que un tratamiento sea efectiva.

Cuantificación absoluta de fotones total emitida es muy complejo. El número de fotones recogidos depende de la profundidad del tumor y en los órganos de los fotones son emitidos a través de. Coeficientes de corrección en base a los coeficientes de absorción de tejido pueden ser calculados ^5, pero la cuantificación absoluta del número de células tumorales requiere conocer el número de fotones emitidos por cada célula tumoral. Por otra parte, la expresión de luciferasa, como el de muchos genes informadores (por ejemplo., Proteínas fluorescentes) no es homogénea, incluso en una población celular derivada de un único clon ^6. El número de luciferproteínas ase en las células no se pueden calcular con exactitud. El establecimiento de las condiciones experimentales estandarizadas por lo tanto parece ser crucial para un análisis semi-cuantitativo fiable.

Se aplicó el método de luminoscore a dos modelos diferentes de linfoma de ratón ^7,8,9. En estos modelos, las células tumorales singénicas se inyectan en el ojo o debajo de la piel para obtener, respectivamente, un modelo primario linfoma intraocular (PIOL) y un linfoma subcutáneo modelo (SCL). En cada uno de estos modelos ortotópico, el tratamiento se administra in situ, siete días después de la inoculación del tumor para PIOL y cuando el tumor ha alcanzado 0,5 a 0,7 cm en su diámetro más grande para SCL.

Se utilizó el método luminoscore para vigilar los efectos de la terapia con CpG in situ, previamente demostrado ser eficaz ^7,10,11. CpG es una secuencia de oligonucleótidos y un ligando de TLR9, que a su vez es un receptor intracelular expresada por numerosos cells del sistema inmune, incluyendo células dendríticas, linfocitos B, monocitos y células asesinas naturales. CpG DNA es una secuencia de ADN 20-mero que contiene el CpG (CG) motivo inmunoestimulante; el control (ODN-control) es la misma secuencia de ADN 20-mer, excepto que la secuencia CG inmunoestimulador se invierte (GC). Compromiso TLR9 en el linfoma murino que estamos estudiando induce la apoptosis ^10, activa el sistema inmunológico ^12, y por lo tanto reduce significativamente la carga tumoral ^7,11.

Aquí se describe un método estandarizado para la cuantificación de la carga tumoral y la respuesta al tratamiento a través de imágenes bioluminiscentes. Este método se basa en diferentes aspectos del procedimiento de formación de imágenes, desde la adquisición hasta el análisis, para optimizar la fiabilidad, reproducibilidad, la dependencia no usuario, y la significación estadística. Un índice de bioluminiscencia cuantificación se atribuye a cada ratón; este valor, lo que llamamos un luminoscore, se puede comparar no sólo entre los animales, pero alpor lo que entre los experimentos.

En este trabajo, nos centramos en el procedimiento de formación de imágenes de bioluminiscencia, así como la cuantificación de imagen por el método luminoscore. Mostramos la eficacia de este método de control de la inyección, el seguimiento de la carga tumoral, y la evaluación de la eficacia de tratamiento del cáncer en situ. Cada uno de estos puntos se ilustra en los resultados representativos de experimentos utilizando diferentes modelos de ratón para resaltar la capacidad de adaptación del método luminoscore.

Protocolo

Todos los procedimientos con ratones cumplen con las directrices de la Unión Europea, la reglamentación francesa para la experimentación con animales (Ministerio de Agricultura Ley Nº 2001-464, de mayo de 2001), y las directrices de la de Santé et de la Recherche Médicale Comité Nacional de la Institut (INSERM) en Pruebas con animales, y fueron aprobados por el comité local relevante (el Comité de Ética Charles Darwin para experimentos con animales, París, Francia; Número de Permiso: P3 / 2009/004).

1. Preparación de la célula

1. Crecer B de ratón línea celular de linfoma A20.IIA-luc2 en medio RPMI-1640 Glutamax suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, piruvato de sodio 10 mM, 50 mM 2-mercaptoetanol, y 0,50 mg / ml de higromicina B.
2. Mantener el cultivo de células a 37 ° C, 5% de CO ₂ y cambio de medio cada dos a tres días. Cosecha de 5 ml de la suspensión celular con algún día pipeta después de cambiar el medio.
3. Centrifugar las células a 3005; g durante 10 min y la suspensión de las células en 3 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Repita este paso dos veces para lavar las células.
4. Mezclar 15 l de suspensión celular con 30 l etiquetado azul tripán antes de cargar una cámara de recuento Malassez. Calcular la concentración de células con la fórmula: Concentración (células / ml) = número de células en la rejilla de recuento * 3 * 1000.
5. Girar la células una vez más a 300 xg durante 10 min. Extraer el sobrenadante con una pipeta. Con C la concentración calculada en el paso 1.4), el número de células es N = C * 3.
6. Calcular el volumen de PBS estéril 1x requerido para obtener la suspensión de células A a una concentración de 5 x 10 ⁷ células / ml con la siguiente fórmula: PBS Volumen (ml) = N / (5 x 10 ^7). Suspender el sedimento de células (de la etapa 1.5)) en el volumen de PBS estéril 1x calculado en la frase anterior. Suspensión de la célula A es para ser utilizado en el modelo SCL (en volumen inyectado vivo es de 100 l: 5 x 10 ⁶ célulass).
7. Pipetear 10 l de suspensión de células A y añadir 90 l de PBS estéril en un tubo de 1,5 ml para obtener 100 l de suspensión de células B a los 5 x 10 ⁶ células por ml. Suspensión de la célula B se va a usar en el modelo PIOL (en volumen inyectado vivo es 2 l: 1 x 10 ⁴ células).

2. La luciferina

1. Diluir 1 g de polvo de sal de potasio de D-luciferina en 30 ml de PBS estéril 1x en un tubo de 50 ml y agitar durante unos pocos segundos para disolver los agregados.
   NOTA: Debido a la luciferina es sensible a la luz, preparar 500 ml de alícuotas en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml oscuros.
2. Almacenar las alícuotas a -20 ° C.
   NOTA: Las alícuotas se pueden almacenar durante varios meses.
   Después de la descongelación, las alícuotas no deben almacenarse durante más de 1 día a + 4 ° C. ciclos hielo-deshielo son preferibles a almacenamiento a 4 ° C.
3. Se inyectan 100 l de solución de sal de potasio de D-luciferina por vía intraperitoneal para cada imagen ASSAy.
   NOTA: Esta solución corresponde a 3,3 mg por ratón para una dosis de 150 mg / kg.

3. Mezcla anestésica y anestesia

1. Preparar una solución anestésica mediante la mezcla de ketamina 120 mg / kg y xilazina 6 mg / kg en PBS estéril 1x.
2. Inyectar 60 l de mezcla anestésica intraperitoneal para cada ensayo de formación de imágenes con una aguja de 25 G. Para la cirugía (con el PIOL o modelo SCL), inyectar 80 l de la mezcla para obtener una anestesia más profunda. Ponga el ratón de nuevo en su jaula.
3. Cuando aparezca el ratón inmóvil, sacarlo de su jaula y apretar suavemente la pierna del ratón entre los dedos. Si el ratón reacciona con un reflejo de escape, esperar varios minutos. Repita la acción hasta que el ratón no reacciona, lo que confirma la anestesia satisfactoria.
4. Coloca el ratón sobre una placa de calentamiento o bajo una luz calentamiento.
5. Aplicar ungüento para los ojos para evitar la sequedad del ojo durante la anestesia para el ensayo de formación de imágenes o para la cirugía SCL. Aplica elungüento para los ojos después de la cirugía para el modelo LIOP.

4. La cirugía y la inoculación de las células

NOTA: Realizar todos los procedimientos quirúrgicos en una placa de calentamiento o bajo una luz calentamiento, en una cabina de seguridad microbiológica 1 tipo en un centro de nivel 2 de bioseguridad de los animales. Todos los instrumentos quirúrgicos utilizados en esta sección se trataron en autoclave antes de su uso.

1. Subcutánea linfoma Modelo:
   1. Preparar 100 l de la suspensión celular obtenida en la etapa 1.6 en una jeringa de 1 ml con una aguja de 25 G. Apriete suavemente la piel del ratón en el flanco entre los dedos, en el lugar de la inyección. Insertar la aguja exactamente en el pliegue de la piel. Para asegurar una inyección subcutánea, no coloque la aguja profundamente en el tejido.
      1. Inyectar las células en el pliegue de la piel. Observe si una bola líquida poco aparece bajo la piel para confirmar que la inyección se realizó correctamente.
2. LIOP modelo:
   NOTA: Este procemiento requiere 2 operadores, a que se refiere aquí como operador 1 y el operador 2.
   1. La eliminación de la conjuntiva:
      1. Operador tiene 1 lugar del ratón bajo un microscopio de disección. Presione suavemente con los dedos a cada lado del ojo para desactivarla. Mantener esta posición.
      2. Tener operador 2 l ook a través del microscopio de disección. Agarre la conjuntiva con un pequeño par de pinzas en una mano; con la otra mano, corte la conjuntiva justo por debajo de las pinzas con un pequeño par de tijeras quirúrgicas.
      3. Tener operador 1 liberación del ojo del ratón pulsado en el paso 4.2.1.1)
   2. Inyección de la célula:
      1. Preparar una jeringa de 10 l contundente precisión. Lavarlo mediante el bombeo de agua desionizada estéril a través de él. Repetir dos veces o tres veces para asegurarse de que no haya burbujas en la jeringa. A continuación, preparar 2 l de suspensión celular inyectable.
      2. Tener operador 2 presione suavemente con los dedos de ene mano en cada lado del ojo para desactivarla. Mantener esta posición.
      3. Tener operador 1 agarre el borde del ojo con un pequeño par de pinzas en una mano y tire de ella suavemente hacia atrás para estirar el tejido.
      4. Tener operador 2 l ook a través del microscopio de disección. Con la otra mano, hacer un pequeño agujero en el globo ocular inferior del ratón con una aguja de 32 G.
      5. Operador tiene 2 dejó la aguja y recoger (con la misma mano) de la jeringa de precisión e inserte la aguja en el agujero hecho en el paso 4.2.2.4.
      6. Tener operador 1 empuje en el émbolo de la jeringa con la otra mano.
      7. Tiene operador 2 v erificar con el microscopio de disección que la suspensión de células en la jeringa se ha inyectado correctamente dentro del globo ocular (el flujo de líquido es fácilmente observable).
      8. Tener operador 2 r etire la jeringa de precisión.
      9. Operador tiene 1 r Elease el borde de la unatremo ojo agarró en el paso 4.2.2.3)
      10. Tener operador 2 r Elease los lados del ojo prensadas en la etapa 4.2.2.2)
      11. Aplicar el ungüento oftálmico inmediatamente.
          NOTA: Si todos los pasos se realizan correctamente, el ratón no debe sangrar en absoluto durante este procedimiento.

5. La bioluminiscencia de imágenes - Día 0

NOTA: Todos los productos inyectados en el ratón deben estar a temperatura ambiente antes de la inyección. Después de que el tumor se ha inoculado células, y mientras el animal aún está anestesiado, continúe con estos pasos para la formación de imágenes.

1. Encienda el reproductor de imágenes y abrir el software de adquisición. Inicialice la cámara, las etapas, y las lentes haciendo clic en el botón "Inicializar". La inicialización es de 10 a 15 minutos para ser completado.
2. Se inyectan 100 l de solución de sal de potasio de D-luciferina por vía intraperitoneal con una aguja de 25 G. No administrar por vía intravenosa. Si intravenouse requiere la administración s por cualquier razón, la sal de sodio de D-luciferina debe ser utilizado en lugar de sal de potasio de D-luciferina.
   NOTA: La luciferina es el reactivo en exceso a esta concentración; por lo tanto, la señal de bioluminiscencia alcanza una meseta después de 3-7 min y persiste durante más de 30 min.
3. 10 min después de la inyección de D-luciferina ^13, coloque el ratón sujeto en el generador de imágenes. Coloque el ratón en su posición natural, su espalda hacia la cámara, en una posición lo más plana posible. Esta posición es natural y fácilmente reproducible.
4. Marque la función de auto-exposición, y haga clic en Adquirir para adquirir la imagen trasera (posterior) del animal, con la función de auto-exposición.
   NOTA: La función de auto-exposición optimiza el tiempo de exposición mediante el cálculo en una imagen de la exposición de 1 segundo de. Si la señal de bioluminiscencia del ratón es negativo o muy bajo, el tiempo de exposición óptimo podría serajustarán automáticamente a más de 20 min. En este caso, un tiempo de exposición de 8 a 10 min puede ser un buen compromiso. El tiempo de exposición puede ajustarse manualmente, pero las imágenes no debe contener píxeles saturados.
5. Ponga el ratón para dejar al descubierto la parte delantera del ratón a la cámara. Tratar de aplanar el ratón y extender sus extremidades anteriores para que no bloqueen el pecho.
6. Adquirir una imagen delantera del animal. Compruebe que la casilla de verificación automática de la exposición todavía está marcada y haga clic de nuevo en el botón "Adquirir".
   NOTA: La imagen frontal puede ser adquirido con anterioridad a la imagen de nuevo y viceversa. El tiempo de exposición de imagen frontal y posterior puede ser diferente dependiendo de la intensidad relativa de cada lado del ratón. Se calcula automáticamente cuando se utiliza la función de auto-exposición. Cuantificación utiliza sólo el flujo de fotones (fotones por segundo) y no depende del tiempo de exposición.
7. Coloque el ratón sobre una plataforma calentamientocorreo o bajo una luz calentamiento hasta que se recupere de la anestesia y luego se coloca de nuevo en su jaula.

6. La bioluminiscencia de imágenes - Después del Día 0

1. Encienda el reproductor de imágenes, inicializar la cámara, las etapas, y las lentes como en el paso 5.1).
2. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 60 l de la mezcla de ketamina (120 mg / kg) / xilazina (6 mg / kg) (consulte los pasos 3.1 a 3.5).
   NOTA: Este método de anestesia permite obtener imágenes cada 5 días. Para realizar las imágenes de todos los días, un método que utiliza isoflurano como se requiere el anestésico y un generador de imágenes de bioluminiscencia adecuado para su uso con este anestésico.
3. Adquirir imagen frontal y posterior del animal, utilizando la función de auto-exposición, como en los pasos 5.5) y 5.6). Manejar el ratón como en el paso 5.7).

7. La bioluminiscencia Cuantificación y Análisis de Imágenes

NOTA: El método se basa en luminoscore imagen analysis. Una vez que las imágenes han sido adquiridos de acuerdo con los pasos anteriores, la cuantificación se puede realizar en cualquier momento (incluyendo inmediatamente después de la adquisición), para asociar un luminoscore a cada ratón en cada punto de tiempo.

1. Mostrar la "paleta de herramientas" haciendo clic en el menú "Ver" y luego haga clic en "paleta de herramientas" si no está visible. Haga clic en la pestaña "Herramienta de retorno de la inversión" de la paleta de herramientas. Elija el botón "Contorno" y luego seleccione "sorteo gratuito".
2. Marcar manualmente la zona de interés (ROI) alrededor del ratón siguiendo los bordes del ratón en la vista frontal. Cerrar el contorno con un clic derecho en el ratón de la computadora.
3. Haga clic en el menú "Ver" y luego "Medición del rendimiento de la inversión". Asegúrese de que "Radiance (fotones)" está seleccionado en los "tipos de medición" menú desplegable en la parte inferior izquierda de la ventana "Las mediciones de ROI". Si no es así, seleccionarla. A continuación, medir el fl fotónUX (ph / s) registrando el valor en el cuadro "Total Flux [p / s]".
   NOTA: No utilice Resplandor o cualquier otra unidad que está en relación con el área de superficie ROI.
4. Repita los pasos 7.2) y 7.3) para la vista atrás.
5. Sumar los valores de flujo de dos fotones obtenidos de vista frontal y posterior. El resultado es la luminoscore.
6. Comparación de los valores de cada grupo mediante una prueba estadística apropiada (no paramétrico de dos colas prueba de Mann-Whitney, por ejemplo) ^14.

Resultados

El Método Luminoscore puede servir para comprobar la inyección de células tumorales

En los modelos que implican la inyección de un pequeño número de células tumorales o cuando el sitio de inyección no permite la verificación visual de la inyección, que puede ser muy difícil garantizar la calidad de la inyección. El método luminoscore sirve como una herramienta rápida y conveniente para verificar la calidad del procedimiento y determinar fácilmente y de forma instantánea que todo ha ido bien. En ambos modelos, el tumor es detectable tan pronto como 10 min después de la inyección (Figura 1A). Las imágenes por sí sola suficiente para verificar que las células tumorales están presentes en la ubicación correcta. Sin embargo, la cuantificación de las imágenes proporciona una idea de la heterogeneidad de la inyección. El diagrama de puntos (Figura 1B) muestra claramente una diferencia entre los animales que recibieron (puntos negros) y no volviócibir (línea roja) inyecciones. Curiosamente, la señal obtenida en el modelo SCL es 100 veces mayor que en el modelo PIOL; este hallazgo es consistente con el número de células inyectadas (5 x 10 ⁶ y 1 x 10 ⁴ células, respectivamente).

Figura 1. Verificación de inyección en diferentes modelos de linfoma de ratón. Los luminoscores mide 10 minutos después de la inoculación de células tumorales en diferentes modelos de linfoma. (A) Imágenes representativas de ambos modelos. (B) Luminoscore de cada animal en los diferentes modelos. La línea roja corresponde al ruido de fondo medio medido en 10 animales antes de la inoculación de células tumorales; las líneas de puntos son la desviación estándar de la media +/-. Para cada modelo, todos los animales se pueden distinguir del ruido de fondo. En el modelo LIOP, 1 x 10 ⁴ células fueron INOCulated en el humor vítreo del ojo derecho y, en el modelo SCL, 5 x 10 ⁶ células por vía subcutánea en cada costado del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Monitoreo de la carga tumoral y la respuesta al tratamiento

El luminoscore es también una poderosa herramienta para el estudio de crecimiento del tumor y eficacia del tratamiento. La Figura 2A muestra imágenes representativas de la vigilancia del crecimiento tumoral en el control y la tratada CpG grupos Piol. Los ratones fueron inoculados con 1 x 10 ⁴ células tumorales cada uno, y el tratamiento se administró in situ en el día 7. Las imágenes muestran que después de un tiempo suficiente (28 días), las metástasis comenzaron a aparecer en el grupo de control. Aunque el tumor primario no apareció sensibles al tratamiento, menosse observaron metástasis en el grupo tratado con CpG (Tabla 1). El análisis cuantitativo de la carga tumoral en cada grupo (Figura 2B) muestra que CpG se redujo el desarrollo de tumores, produciendo una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo tratado y el grupo de control después de 28 días (no paramétrico de dos colas de Mann-Whitney p = 0.0079 ). Sin embargo, los tumores todavía crecieron en los ratones tratados, y ninguno de ellos sobrevivieron (datos no mostrados). Este hallazgo es consistente con los informes anteriores: CpG no tiene efectos significativos sobre tumores oculares primarias ^10. El efecto significativo que tenemos aquí entre el ODN y el grupo CpG proviene de la inhibición del crecimiento de la metástasis.

Figura 2. El seguimiento de la carga tumoral y la respuesta al tratamiento. (A) Imágenes representativas de los dos grupos (ODN-control y tratado-CpG) of ratones portadores de LIOP. carga tumoral (B) Seguimiento con el luminoscore. Como se ve en el gráfico de puntos, el efecto de CpG en la luminoscore es significativo en el día 28. En los dos grupos, este método hace posible el seguimiento de la carga tumoral y para medir los (p = 0.0079) efectos leves pero significativas de CpG ADN, lo que podría no haber sido detectados por imágenes por sí solas. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

grupos	Ratón	La presencia de metástasis	Ubicación	Flujo de fotones (ph / s)
CpG	1	No	x	x
	2	Sí	Nodo lymp Ojo de drenaje	9.32E + 05
	3	No	x	x
	4	No	x	x
	5	Sí	Ojo de drenaje nodo lymp	2.21E + 07
ODN	1	Sí	Ojo de drenaje nodo lymp	1.06E + 07
	2	Sí	Ojo de drenaje nodo lymp	7.25E + 07
	3	Sí	Ojo de drenaje nodo lymp + contralateral	7.64E + 08
	4	Sí	Ojo de drenaje nodo lymp + contralateral	1.74E + 09
	5	Sí	Ojo de drenaje nodo lymp + contralateral	9.76E + 07

Tabla 1. TMétodo que Luminoscore se puede adaptar a diferentes enfoques

El método luminoscore no se limita a un solo tipo de modelo de ratón. La figura 3 muestra que se puede adaptar a diferentes modelos de ratón. En el modelo SCL, dos tumores se injertan en cada lado del ratón. El tratamiento se administra in situ a un solo lado en el día 0, y el tumor contralateral sirve como su control (Figura 3A). Por lo tanto, dos ROI se elaboraron por ratón: uno para cada lado (Figura 3C). La relación entre el luminoscore en los lados tratados y de control describe el curso relativa de cada tumor. Esta relación se establece en 1 en el Día 0, cuando se administró el tratamiento. Se observó una disminución significativa en esta relación de 13 días después de la administración del tratamiento (Figura 3D; no paramétrico de dos colas prueba de Mann-Whitney p = 0,004). Esta disminución revela que el tumor tratado con ladose ha reabsorbido, como se muestra en las imágenes de bioluminiscencia representativos (Figura 3B).

Figura 3. Adaptación del método Luminoscore a un modelo con dos sitios de tumor primario. (A) Diseño experimental de un ensayo SCL. Los ratones fueron inyectados con dos tumores primarios en cada flanco. Un lado se inyecta, ya sea con CpG-ADN o ODN-control, y el otro lado con PBS, para servir como su control. (B) se administró Imágenes representativas de los ratones tratados con CpG y control a día 0 y día 13. El tratamiento en el día 0. el crecimiento tumoral se inhibió en el lado tratado con CpG del ratón. (C) el marcado manualmente las regiones de interés por animal por dos sitios de tumor primario. (D) la relación entre los luminoscores de la GPC-tratada o side-ODN de control y la parte de control de PBS es un índice querefleja el crecimiento relativo de cada tumor dentro del mismo animal. Esta relación se establece en 1 en el día 0. En el día 13, la proporción entre el grupo tratado con CpG había disminuido significativamente (p = 0,004), revelando la inhibición del crecimiento tumoral mediante la administración in situ de ADN CpG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

absorción de la luz por los órganos y tejidos sigue siendo una limitación de imágenes de bioluminiscencia, a pesar de esta limitación es inherente a cualquier técnica de imagen óptica. En el contexto de nuestro enfoque, se espera que los efectos de las estructuras anatómicas en el luminoscore tener baja variabilidad siempre que los estudios se realizan en un modelo dado (lugar y la hebra de ratón), lo que permite entonces las comparaciones. La bioluminiscencia no necesita luz de excitación y por lo tanto se adapta más a todo el cuerpo de imágenes in vivo de fluorescencia.

La resolución espacial es también una limitación de imágenes de bioluminiscencia, y la ubicación precisa del órgano del que se emiten fotones de bioluminiscencia sigue siendo difícil. Sin embargo, un buen conocimiento del modelo puede ayudar en la localización cualitativa de los sitios de tumor. La única salida de este método basado en la bioluminiscencia es la luminoscore. Ubicación no influye en la luminoscore porque el margen de ganancia manual de Región de Interest (ROI) cubre todo el ratón. Por último, la luciferasa de luciérnaga requiere oxígeno. En consecuencia, imágenes de bioluminiscencia generalmente subestima tumores necróticos. Una vez más, se requiere un buen conocimiento de este aspecto del modelo.

En este trabajo, nuestra intención no es evaluar la eficacia de CpG como un fármaco antitumoral (que ya ha sido demostrado ^7,9,11), pero para describir un método que permite la comparación de datos de bioluminiscencia. Hemos hecho describe un método para cuantificar la carga tumoral destinado a ayudar a estandarizar el protocolo de adquisición para comparar diferentes ensayos en diferentes lugares en diferentes momentos y que no requiere de cálculos por ordenador. Para asegurar la reproducibilidad y la correcta cuantificación de flujo de fotones, el dispositivo de imagen debe ser calibrado con una referencia de la luz para los dispositivos de fabricación casera o según lo recomendado por el proveedor de dispositivos comerciales.

Nuestro protocolo requiere una cuidadosa atención a varios p críticaUNTOS: (i) En primer lugar, la calidad de la anestesia ratón es crucial para la obtención de imágenes claras, especialmente en los casos con tiempos de exposición largos. (Ii) La unidad de cuantificación debe ser siempre sea el flujo de fotones debido a radiación depende de la superficie de cada ratón y podría ser irrelevante para la comparación de diferentes ratones. (Iii) Las imágenes de bioluminiscencia no deben contener píxeles saturados, ya que estos podrían sesgar la luminoscore. (iv) hacia atrás y delante adquisición se requieren para recoger todos los fotones emitidos desde el sitio del tumor (es decir, la adquisición de frente no necesariamente puede detectar fotones de la parte posterior del tumor). Varios diferentes dibujos de ROI se ensayaron durante el desarrollo del método luminoscore. Sólo el manual del margen de beneficio dado resultados satisfactorios que son más propensos a ser estadísticamente significativa (datos no mostrados).

Inoue et al. recomiendan una dosis luciferina de 75 mg / kg ^13. Mediante el uso de una dosis de 150 mg / kg en vez, el momento de formación de imágenes después de laadministración luciferina no ha cambiado y nos aseguramos de que la meseta dura toda una adquisición larga exposición. Luciferina debe ser el reactivo en exceso durante todo el proceso de adquisición. Dependiendo del modelo, la región de interés se puede adaptar, como se demostró en el modelo SCL donde dibujamos dos ROI por animal. En el modelo SCL, se inyecta el tratamiento cuando el tumor alcanza 0,5 cm en su diámetro más grande para limitar la variabilidad de injerto. Dependiendo de los ratones, el tumor podría haber crecido de manera diferente. Para estandarizar y comparar los ratones, se decidió utilizar una relación entre el lado tratado y no tratado que revela el crecimiento relativo de ambos tumores flancos.

Si no se observa ninguna señal de un ratón inyectado espera que sea positivo, o bien (i) el número de células es muy baja y la señal está por debajo del umbral de detección; o (ii) el ratón carece de oxígeno y requiere atención inmediata.

Varios de los bioluminesc cuantitativaLos análisis cia descrita por varios autores requieren cálculos complejos e instrumentos (por ejemplo, tomografía bioluminiscencia 3D) para acercarse a la cuantificación absoluta de los fotones emitidos bioluminiscencia ^5,15. No hay consenso sobre un método para la cuantificación de la bioluminiscencia de forma reproducible, especialmente en modelos de tumores, con una cámara 2D bioluminiscencia. Nuestro objetivo era estandarizar el protocolo de adquisición de imágenes para limitar la dependencia del usuario.

La inyección de CpG in situ después de la inoculación del tumor redujo la carga tumoral en ambos modelos. El método luminoscore puede servir como una herramienta para monitorear la carga tumoral en otros modelos de inmunoterapias tumorales. Monitoreo de la carga tumoral proporciona un método no invasivo que puede mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de crecimiento del tumor y metástasis sin interferir con el microambiente tumoral. La identificación de los animales que hacen y que no responden al tratamiento con este método se ve reforzada por la verificación de sinyección de células tumorales Uccessful al comienzo del experimento.

Nosotros mostramos aquí la capacidad de adaptación del método luminoscore en un modelo SCL utilizando células A20.IIA-luc2. Sin embargo, este método puede ser adaptado a cualquier otro modelo de tumor usando otras líneas celulares siempre que expresan luciferasa, o en el contexto de los estudios de células T (citotóxicas tumor específico de células T, células T reguladoras, etc.). El seguimiento de la transferencia de genes in vivo en el contexto de la terapia génica de enfermedades raras también se podría hacer utilizando el método luminoscore.

Por último, los datos muestran que el método basado en la bioluminiscencia luminoscore permite hacer comparaciones entre los experimentos, ofrece flexibilidad y capacidad de adaptación a las necesidades específicas de experimentación, y es una herramienta útil para los estudios preclínicos longitudinales no invasivos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CpG 1826	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826
ODN 1826 control	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c
D-luciferin potassium salt	Interchim	Catalog number: FP-M1224D
Ketamin	Virbac, France
Xylazin	Bayer Healthcare	Rompun 2%
A20.IIA-luc2 cell line		A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310)
Mice	Balb/cByj	Six-weeks old females from Charles River
IVIS lumina Biolumienscence imager	Perkin Elmer
Living Image software	Perkin Elmer	Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs
R software (opensource)	R-project	Used for statistic tests
Hamilton Precision Serynge 10 µl	Hamilton	Product number 7642-01100
Eye ointment	Lacrinorm
Dissecting microscope	ZEISS	Stemi 305