Bioluminescenza-Based Metodo Tumore quantificazione per il monitoraggio del tumore Progressione e gli effetti del trattamento in modelli murini linfoma

Riepilogo

l'imaging bioluminescenza è uno strumento ben noto per la localizzazione di tumori e metastasi, ma la quantificazione di queste immagini spesso richiede calcoli complessi e particolari strumenti. Descriviamo il metodo luminoscore da usare facile, in base alle condizioni di acquisizione precise, che non richiede calcoli e permette il carico tumorale e della risposta al trattamento da monitorare in modelli murini.

Abstract

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Introduzione

Rilevamento delle cellule tumorali precoce rimane una sfida ed è fondamentale per migliorare l'efficacia del trattamento del cancro. In vivo l'imaging bioluminescenza (BLI) è una tecnica non invasiva ottica molto sensibile, ampiamente utilizzato per il monitoraggio di tumori nei piccoli animali. Cellule che esprimono luciferasi Firefly sono comunemente usati per tali esperimenti ^1,2. Questo ossigenasi ossida D-luciferina con ossigeno molecolare, ma richiede due cofattori - Mg ²⁺ e adenosina trifosfato ^3. Lucciola luciferasi è più adatto per l'imaging in vivo di renilla luciferasi ⁴ perché la resa quantica è maggiore.

Il substrato ossidato - oxyluciferin - emette spontaneamente un fotone di ritornare al suo stato fondamentale e quindi diventa inattivo. I fotoni emessi hanno una lunghezza d'onda massima circa 530 nm. Una telecamera ad alta sensibilità in grado di rilevare i fotoni luminescenti dall'interno di un piccolo animale e fornire immagini che rendono possbile per individuare le cellule tumorali.

La capacità di quantificare il carico tumorale con precisione da conteggi di fotoni potrebbe servire come uno strumento potente e sensibile per quantificare l'efficacia del trattamento. Poiché gli effetti del trattamento possono essere rilevate prima, questa sensibilità potrebbe consentire di determinare il momento esatto in cui un trattamento diventa efficace.

quantificazione assoluta del totale fotoni emessi è molto complessa. Il numero di fotoni raccolti dipende dalla profondità del tumore e sugli organi fotoni vengono emessi attraverso. Coefficienti di correzione in base ai coefficienti di assorbimento dei tessuti possono essere calcolati ^5, ma la quantificazione assoluta del numero di cellule tumorali richiede conoscere il numero di fotoni emessi da ciascuna delle cellule tumorali. Inoltre, l'espressione della luciferasi, come quella di molti geni reporter (ad es., Proteine ​​fluorescenti) non è omogenea, anche in una popolazione di cellule derivate da un singolo clone ^6. Il numero di Luciferoproteine ​​ASE nelle cellule non possono essere calcolati esattamente. La creazione di condizioni sperimentali standardizzate appare quindi cruciale per una affidabile analisi semi-quantitativa.

Abbiamo applicato il metodo luminoscore a due diversi modelli di linfoma di topo ^7,8,9. In questi modelli, cellule tumorali singenici vengono iniettate nell'occhio o sotto la pelle per ottenere rispettivamente modello, un modello primario linfoma intraoculare (PIOL) e un linfoma sottocutaneo (SCL). In ciascuno di questi modelli ortotopico, il trattamento viene somministrato in situ, sette giorni dopo l'inoculazione del tumore per PIOL e quando il tumore ha raggiunto 0,5 a 0,7 cm di suo più grande diametro per SCL.

Abbiamo usato il metodo luminoscore per monitorare gli effetti della terapia in situ CpG, precedentemente dimostrato di essere efficace ^7,10,11. CpG è una sequenza oligonucleotide e un ligando di TLR9, che a sua volta è un recettore intracellulare espressa da numerosi ceLLS del sistema immunitario, comprese le cellule dendritiche, linfociti B, monociti e cellule natural killer. CpG-DNA è una sequenza di DNA di 20-mer che contiene il CpG (CG) motivo immunostimolante; il controllo (ODN-control) è la stessa sequenza di DNA 20-mer, ma la sequenza CG immunostimolante è invertita (GC). Impegno TLR9 nel linfoma murino stiamo studiando induce apoptosi ^10, attiva il sistema immunitario ^12, e quindi riduce in modo significativo tumore onere ^7,11.

Qui si descrive un metodo standardizzato per quantificare il carico tumorale e della risposta al trattamento attraverso le immagini bioluminescenti. Questo metodo si basa su diversi aspetti della procedura di imaging, dall'acquisizione all'analisi, per ottimizzare affidabilità, riproducibilità, la dipendenza non utente e significatività statistica. Un indice bioluminescenza quantificazione è attribuito a ogni mouse; questo valore, che noi chiamiamo un luminoscore, può essere paragonato, non solo tra gli animali, ma alcosì tra esperimenti.

In questo lavoro, grazie alla procedura di imaging bioluminescenza, nonche la quantificazione immagine dal metodo luminoscore. Mostriamo l'efficacia di questo metodo per verificare l'iniezione, monitoraggio carico tumorale, e valutare l'efficacia di un trattamento del cancro in situ. Ciascuno di questi punti è illustrato nei risultati rappresentativi da esperimenti utilizzando diversi modelli murini di evidenziare l'adattabilità del metodo luminoscore.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono i topi rispettate le linee guida dell'Unione europea, i regolamenti francesi per la sperimentazione animale (Ministero dell'Agricoltura legge n 2001-464, maggio 2001), e le linee guida del National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Commissione Institut su Test sugli animali, e sono stati approvati dal comitato locale in questione (Darwin Comitato Etico Charles per gli esperimenti animali, Parigi, Francia; numero di permesso: P3 / 2009/004).

1. Preparazione delle cellule

1. Grow topo B linea cellulare di linfoma A20.IIA-luc2 in RPMI-1640 Glutamax supplementato con 10% di siero fetale di vitello, 100 ug / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, 10 mM piruvato di sodio, 50 mM 2-mercaptoetanolo, e 0,50 mg / ml igromicina B.
2. Mantenere coltura cellulare a 37 ° C, 5% di CO ₂ e cambiarne media ogni due o tre giorni. Harvest 5 ml della sospensione cellulare con una pipetta un giorno dopo il cambio del mezzo.
3. celle Spin a 3005; g per 10 min e sospendere le cellule in 3 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Ripetere questa operazione due volte per lavare le cellule.
4. Mescolare 15 ml di sospensione cellulare con 30 microlitri Trypan Blue etichettatura prima di caricare una camera di conteggio Malassez. Calcolare la concentrazione cella con la formula: Concentrazione (cellule / ml) = Numero di cellule nella griglia conteggio * 3 * 1000.
5. Spin il cellule una volta a 300 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Con C la concentrazione calcolata nel passo 1.4), il numero di cellule è N = C * 3.
6. Calcolare il volume di PBS sterile 1x richiesto per ottenere cellule sospensione A ad una concentrazione di 5 x 10 ⁷ cellule / ml con la seguente formula: PBS Volume (ml) = N / (5 x 10 ^7). Sospendere il pellet cellulare (dal punto 1.5)) nel volume di PBS sterile 1x calcolato nella frase precedente. Sospensione cellulare A deve essere utilizzato nel modello SCL (in vivo volume iniettato è di 100 microlitri: 5 x 10 ⁶ celluleS).
7. Pipettare 10 ml di sospensione cellulare A e aggiungere 90 ml di PBS sterile in una provetta da 1,5 ml per ottenere 100 ml di cellule di sospensione B a 5 x 10 ⁶ cellule per ml. Sospensione cellulare B deve essere utilizzato nel modello PIOL (in vivo volume iniettato è 2 microlitri: 1 x 10 ⁴ cellule).

2. Luciferin

1. Diluire 1 g di polvere di sale di potassio D-luciferina in 30 ml di PBS sterile 1x in un tubo da 50 ml e agitare per alcuni secondi per sciogliere gli aggregati.
   NOTA: Perché luciferina è sensibile alla luce, preparare 500 microlitri aliquote in provette da microcentrifuga da 1,5 ml scuri.
2. Conservare le aliquote a -20 ° C.
   NOTA: Le aliquote possono essere conservate per parecchi mesi.
   Dopo lo scongelamento, i aliquote non possono essere conservati per più di 1 giorno a + 4 ° C. cicli di gelo-disgelo sono preferibili alla conservazione a 4 ° C.
3. Iniettare 100 ml di soluzione di sale di potassio D-luciferina per via intraperitoneale per ogni assa l'imagingy.
   NOTA: Questa soluzione corrisponde a 3,3 mg per topo per una dose di 150 mg / kg.

3. Miscela anestetico e anesthetization

1. Preparare una soluzione di anestetico mescolando ketamina 120 mg / kg e xilazina 6 mg / kg in PBS sterile 1x.
2. Iniettare 60 ml di miscela anestetica per via intraperitoneale per ciascun test di imaging con un ago da 25 G. Per la chirurgia (con il PIOL o modello SCL), iniettare 80 ml di miscela per ottenere una anestesia profonda. Mettere il mouse avanti nella sua gabbia.
3. Quando il mouse appare immobile, rimuoverlo dalla sua gabbia e premere delicatamente la gamba del mouse tra le dita. Se il mouse reagisce con un riflesso di fuga, attendere alcuni minuti. Ripetere l'azione fino a quando il mouse non reagisce, che conferma anestesia soddisfacente.
4. Posizionare il mouse su una piastra riscaldante o sotto una luce riscaldamento.
5. Applicare una pomata oculare per evitare secchezza oculare durante anestesia per l'analisi di immagini o per la chirurgia SCL. applicare ilunguento oculare dopo l'intervento chirurgico per il modello PIOL.

4. Chirurgia e cellulare Inoculation

NOTA: Eseguire tutte le procedure chirurgiche su una piastra riscaldante o sotto una luce riscaldamento, in un tipo di cappa di sicurezza microbiologica 1 in un impianto di livello animale biosicurezza 2. Tutti gli strumenti chirurgici utilizzati in questa sezione sono stati sterilizzati in autoclave prima dell'uso.

1. Sottocutanea Linfoma Modello:
   1. Preparare 100 microlitri della sospensione cellulare ottenuta nel passaggio 1.6 in una siringa da 1 ml con un ago 25 G. Premere delicatamente la pelle del mouse sul fianco tra le dita, al sito di iniezione. Inserire l'ago esattamente nella pelle piega. Per garantire iniezione sottocutanea, non posizionare l'ago in profondità nel tessuto.
      1. Iniettare le cellule nella plica. Osservare se appare una pallina di liquido sotto la pelle per confermare che l'iniezione è stata eseguita in modo corretto.
2. Modello PIOL:
   NOTA: Questo proceDure richiede 2 operatori, di cui qui in qualità di operatore 1 e l'operatore 2.
   1. La rimozione della congiuntiva:
      1. Avere Operatore 1 posto il mouse sotto un microscopio da dissezione. Premere delicatamente con le dita su ogni lato degli occhi per cancellarlo. Mantenere questa posizione.
      2. Avere Operatore 2 l ook attraverso il microscopio da dissezione. Afferrare la congiuntiva con una piccola coppia di pinze in una mano; con l'altra mano, tagliare la congiuntiva appena sotto le pinze con un piccolo paio di forbici chirurgiche.
      3. Avere Operatore 1 rilascio l'occhio del mouse premuto al punto 4.2.1.1)
   2. iniezione di cellule:
      1. Preparare 10 ml smussato precisione siringa. Lavare pompando acqua deionizzata sterile, attraverso di essa. Ripetere due o tre volte per assicurarsi che ci siano bolle nella siringa. Quindi preparare 2 ml di sospensione cellulare iniettabile.
      2. Avere Operatore 2 Premere delicatamente con le dita di sue mano a ciascun lato dell'occhio per cancellarlo. Mantenere questa posizione.
      3. Avere operatore 1 afferrare il bordo dell'occhio con una coppia di pinze in una mano e tirarlo indietro delicatamente per allungare il tessuto.
      4. Avere Operatore 2 l ook attraverso il microscopio da dissezione. Con l'altra mano, fare un piccolo foro nel bulbo oculare inferiore del mouse con un ago 32 G.
      5. Avere Operatore 2 posò l'ago e prendere (con la stessa mano) la siringa di precisione e inserire l'ago nel foro praticato al punto 4.2.2.4.
      6. Avere operatore 1 spinta sullo stantuffo della siringa con l'altra mano.
      7. Avere Operatore 2 v erificare con il microscopio da dissezione che la sospensione cellulare nella siringa sia stata correttamente iniettato all'interno del bulbo oculare (il flusso di liquido è facilmente osservabile).
      8. Avere Operatore 2 r imuovere la siringa di precisione.
      9. Avere Operatore 1 r Elease bordo del unIMAL occhio afferrato al punto 4.2.2.3)
      10. Avere Operatore 2 r Elease ai lati degli occhi premuto al punto 4.2.2.2)
      11. Applicare immediatamente l'unguento oculare.
          NOTA: Se tutti i passi sono stati eseguiti correttamente, il mouse non deve sanguinare a tutti durante questa procedura.

5. bioluminescenza Imaging - Giorno 0

NOTA: Tutti i prodotti iniettati nel mouse devono essere a RT prima dell'iniezione. Dopo il tumore cellule sono stati inoculati, e mentre l'animale è anestetizzato ancora, procedere alla seguente procedura per l'imaging.

1. Accendere l'imager e aprire il software di acquisizione. Inizializzare la fotocamera, gli stadi, e le lenti facendo clic sul pulsante "Inizializza". L'inizializzazione sarà dai 10 ai 15 minuti per essere completata.
2. Iniettare 100 ml di soluzione di sale di potassio D-luciferina per via intraperitoneale con un ago da 25 G. Non somministrare per via endovenosa. Se intravenouè necessaria la somministrazione s per qualsiasi motivo, il sale di sodio D-luciferina deve essere utilizzato invece del sale di potassio D-luciferina.
   NOTA: Luciferin è l'eccesso di reagente a questa concentrazione; quindi il segnale di bioluminescenza raggiunge un plateau dopo 3 a 7 min e persiste per più di 30 min.
3. 10 minuti dopo l'iniezione D-luciferina ^13, posizionare il mouse soggetto nella termocamera. Posizionare il mouse nella sua posizione naturale, le spalle verso la telecamera, in piatta una posizione il più possibile. Questa posizione è naturale e facilmente riproducibile.
4. Spunta la funzione di auto-esposizione, e fare clic su Acquisisci per acquisire l'immagine posteriore (posteriore) dell'animale, con la funzione di auto-esposizione.
   NOTA: La funzione di auto-esposizione ottimizza il tempo di esposizione calcolando da un'immagine di esposizione a 1 sec. Se il segnale bioluminescenza del mouse è negativo o molto basse, il tempo di esposizione ottimale potrebbe essereimpostato automaticamente su più di 20 minuti. In questo caso, un tempo di esposizione di 8 a 10 min può essere un buon compromesso. Il tempo di esposizione può essere impostato manualmente, ma le immagini non deve contenere pixel saturi.
5. Capovolgere il mouse per esporre la parte anteriore del mouse alla telecamera. Provare per appiattire il mouse e diffondere i suoi arti anteriori in modo che non blocchino il petto.
6. Acquisire una immagine frontale dell'animale. Verificare che la casella di controllo auto-esposizione è ancora selezionata e fare clic di nuovo sul pulsante "Acquisisci".
   NOTA: L'immagine anteriore può essere acquisita prima della foto indietro e viceversa. Il tempo di esposizione di immagini anteriore e posteriore può essere differente a seconda della intensità relativa di ogni lato del mouse. Viene calcolato automaticamente quando si utilizza la funzione di auto-esposizione. Quantificazione utilizza solo il flusso di fotoni (fotoni per sec) e non dipende dal tempo di esposizione.
7. Posizionare il mouse su un plat riscaldamentoE o sotto una luce riscaldamento fino a quando non si riprende dalla anestetico e poi metterlo di nuovo nella sua gabbia.

6. bioluminescenza Imaging - Dopo Giorno 0

1. Accendere l'imager, inizializzare la macchina fotografica, gli stadi, e le lenti come al punto 5.1).
2. Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di 60 microlitri della miscela di ketamina (120 mg / kg) / xilazina (6 mg / kg) (vedere passi da 3.1 a 3.5).
   NOTA: Questo metodo di anestesia permette l'imaging ogni 5 giorni. Per eseguire l'imaging quotidiana, un metodo che utilizza isoflurano come è richiesto l'anestetico e un imager bioluminescenza adatto per l'uso con questo anestetico.
3. Acquisire le immagini anteriore e posteriore dell'animale, usando la funzione di auto-esposizione, come nei passi 5.5) e 5.6). Maneggiare il mouse come al punto 5.7).

7. bioluminescenza quantificazione e Image Analysis

NOTA: Il metodo luminoscore si basa sull'immagine analisi deS. Una volta che le immagini sono state acquisite secondo la procedura descritta sopra, la quantificazione può essere effettuata in qualsiasi momento (anche immediatamente dopo l'acquisizione), per associare una luminoscore per ciascun topo in ogni punto.

1. Visualizzare la "tavolozza degli strumenti" cliccando sul menu "Visualizza" e quindi fare clic su "tavolozza degli strumenti", se non è già visualizzata. Fare clic sulla scheda "ROI Tool" della tavolozza degli strumenti. Scegliere il pulsante "Profilo" e poi selezionare "sorteggio libero".
2. Contrassegnare manualmente la regione di interesse (ROI) intorno al mouse seguendo i bordi del mouse sulla vista frontale. Chiudere il contorno con un click destro sul mouse del computer.
3. Fare clic sul menu "Visualizza" e poi "ROI Misure". Assicurarsi che "Radiance (fotoni)" viene selezionato in "Tipi di misura" menu a tendina in basso a sinistra della finestra "ROI misure". In caso contrario, selezionarla. Quindi misurare il fl fotoneUX (ph / s) registrando il valore nel "[s p /] Total Flux" scatola.
   NOTA: Non usare Radiance o qualsiasi altra unità che è relativo alla superficie ROI.
4. Ripetere i punti 7.2) e 7.3) per la vista posteriore.
5. Sommare i valori di flusso a due fotoni ottenuti dalla parte anteriore e posteriore. Il risultato è il luminoscore.
6. Confrontare i valori per ciascun gruppo utilizzando un test statistico appropriato (non parametrico due code test di Mann-Whitney, per esempio) ^14.

Risultati

Il Metodo Luminoscore può servire per verificare l'iniezione delle cellule tumorali

Nei modelli che coinvolgono l'iniezione di un piccolo numero di cellule tumorali o quando il sito di iniezione non consente la verifica visiva della iniezione, può essere molto difficile garantire la qualità dell'iniezione. Il metodo luminoscore serve come uno strumento veloce e conveniente per verificare la qualità della procedura e accertare immediatamente e facilmente che tutto è andato a destra. In entrambi i modelli, il tumore è percettibili già 10 min dopo l'iniezione (Figura 1A). Le immagini alone sufficienti per verificare che le cellule tumorali sono presenti nella posizione corretta. Tuttavia, quantificando le immagini fornisce un'idea della eterogeneità dell'iniezione. Il dot plot (Figura 1B) mostra chiaramente una differenza tra gli animali che ha ricevuto (punti neri) e non ha ricevere (linea rossa) iniezioni. È interessante notare che il segnale ottenuto nel modello SCL è 100 volte superiore a quello del modello PIOL; Questo risultato è coerente con il numero di cellule iniettate (5 x 10 ⁶ e 1 x 10 ⁴ cellule, rispettivamente).

Figura 1. Verifica di iniezione in diversi modelli di linfoma di topo. I luminoscores misurata 10 minuti dopo l'inoculazione delle cellule tumorali in diversi modelli di linfoma. (A) Immagini rappresentative di entrambi i modelli. (B) Luminoscore di ogni animale nei diversi modelli. La linea rossa corrisponde al rumore di fondo media misurata su 10 animali prima inoculazione delle cellule tumorali; le linee tratteggiate sono la deviazione media +/- standard. Per ogni modello, tutti gli animali possono essere distinte dal rumore di fondo. Nel modello PIOL, 1 x 10 ⁴ cellule sono state INOCulated nel vitreo dell'occhio destro, e nel modello SCL, 5 x 10 ⁶ cellule per via sottocutanea in ogni fianco del mouse. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Monitoraggio carico tumorale e risposta al trattamento

La luminoscore è anche un potente strumento per studiare la crescita del tumore e l'efficacia del trattamento. La figura 2a mostra immagini rappresentative del monitoraggio della crescita tumorale nel controllo e CPG trattata gruppi Piol. I topi sono stati inoculati con 1 x 10 ⁴ cellule tumorali ciascuno, e il trattamento è stato somministrato in situ nel giorno 7. Le immagini mostrano che dopo un tempo sufficiente (28 giorni), metastasi cominciarono ad apparire nel gruppo di controllo. Sebbene il tumore primario non sembra sensibili al trattamento, menometastasi sono state osservate nel gruppo trattato con CpG (Tabella 1). L'analisi quantitativa della massa tumorale in ciascun gruppo (Figura 2B) mostra che CpG rallentato lo sviluppo del tumore, producendo una differenza statisticamente significativa tra il trattamento e il gruppo di controllo dopo 28 giorni (non parametrico due code test di Mann-Whitney p = 0,0079 ). Tuttavia, i tumori ancora cresciuti in topi trattati, e nessuno di loro sopravvissero (dati non mostrati). Questo risultato è coerente con le precedenti relazioni: CPG non ha effetti significativi sui tumori oculari primarie ^10. L'effetto significativo che abbiamo qui tra il ODN e il gruppo CpG proviene dalla inibizione della crescita delle metastasi.

Figura 2. Monitoraggio carico tumorale e risposta al trattamento. (A) Immagini rappresentative dei due gruppi (ODN-controllo e CpG-trattati) otopi f PIOL-cuscinetto. carico tumorale (B) Monitoraggio con il luminoscore. Come visto sulla trama dot, l'effetto di CpG sul luminoscore è significativo al giorno 28. In questi due gruppi, questo metodo ha permesso di monitorare carico tumorale e misurare le lievi ma significative (p = 0,0079) effetti CpG- DNA, che non poteva essere scoperto dal sole immagini. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

gruppi	Topo	Presenza di metastasi	luogo	Flusso di fotoni (ph / s)
CpG	1	No	X	X
	2	sì	Nodo lymp Eye-drenante	9.32E + 05
	3	No	X	X
	4	No	X	X
	5	sì	Eye-drenante nodo lymp	2.21E + 07
ODN	1	sì	Eye-drenante nodo lymp	1.06E + 07
	2	sì	Eye-drenante nodo lymp	7.25E + 07
	3	sì	Eye-drenante nodo lymp + controlaterale	7.64E + 08
	4	sì	Eye-drenante nodo lymp + controlaterale	1.74E + 09
	5	sì	Eye-drenante nodo lymp + controlaterale	9.76E + 07

Tabella 1. Tegli Metodo Luminoscore può essere adattato a diversi approcci

Il metodo luminoscore non è limitato ad un solo tipo di modello di topo. Figura 3 mostra che può essere adattato a diversi modelli murini. Nel modello SCL, due tumori sono innestate su ciascun lato del mouse. Il trattamento viene somministrato in situ su una singola facciata il giorno 0, e il tumore controlaterale funge da controllo (Figura 3A). Pertanto, due ROI sono stati disegnati per topo: uno per ciascun lato (Figura 3C). Il rapporto tra la luminoscore sui lati trattati e di controllo descrive il corso relativo di ciascun tumore. Questo parametro è stato impostato a 1 giorno 0, quando il trattamento è stato somministrato. Abbiamo osservato una significativa diminuzione di tale rapporto di 13 giorni dopo la somministrazione del trattamento (Figura 3D; non parametrico a due code Mann-Whitney prova p = 0,004). Questa diminuzione rivela che il lato trattato del tumoreè stato riassorbito, come mostrato nelle immagini bioluminescenza rappresentative (Figura 3B).

Figura 3. adattamento del metodo Luminoscore di un modello con due siti tumore primario. (A) disegno sperimentale di un test SCL. I topi sono stati iniettati con due tumori primari in ogni fianco. Un lato viene iniettato sia con CpG DNA o ODN di controllo, e l'altro lato con PBS, per servire come suo controllo. (B) Immagini rappresentative dei topi CpG-trattati e di controllo al giorno 0 e al giorno 13. Il trattamento è stato somministrato al giorno 0. la crescita tumorale è stata inibita sul lato CpG-trattata del mouse. (C) la contrassegnato manualmente regioni di interesse per animale per due siti tumorali primario. (D) il rapporto tra le luminoscores del CpG-trattati o lato ODN-controllo e il lato di controllo PBS è un indice cheriflette la crescita relativa di ogni tumore all'interno dello stesso animale. Questo parametro è stato impostato a 1 il giorno 0. Il giorno 13, il rapporto tra il gruppo trattato con CpG era diminuito in modo significativo (p = 0,004), rivelando l'inibizione della crescita tumorale nella gestione in situ di CpG-DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'assorbimento della luce da organi e tessuti rimane una limitazione di imaging bioluminescenza, anche se questa limitazione è intrinseco a qualsiasi modalità di imaging ottico. Nel contesto del nostro approccio, gli effetti delle strutture anatomiche sulla luminoscore dovrebbero avere bassa variabilità a condizione che gli studi sono effettuati in un dato modello (posizione e strand mouse), consentendo quindi il confronto. Bioluminescenza non ha bisogno di luce di eccitazione e quindi è più adatta a tutto il corpo imaging in vivo di fluorescenza.

La risoluzione spaziale è anche una limitazione delle immagini bioluminescenza, e la posizione precisa dell'organo da cui vengono emessi i fotoni bioluminescenza rimane difficile. Tuttavia, una buona conoscenza del modello può aiutare nella posizione qualitativa dei siti tumorali. L'unica uscita in questo metodo bioluminescenza basata è la luminoscore. Posizione non influenza il luminoscore perché il mark-up manuale Regione di Interest (ROI) copre l'intera mouse. Infine, lucciola luciferasi richiede ossigeno. Di conseguenza, l'imaging bioluminescenza di solito sottovaluta tumori necrotici. Ancora una volta, è richiesta una buona conoscenza di questo aspetto del modello.

In questo lavoro, non stiamo volto a valutare l'efficacia di CpG come un farmaco anti-tumorale (che è già stato dimostrato ^7,9,11), ma per descrivere un metodo che permette il confronto dei dataset bioluminescenza. Abbiamo infatti descrive un metodo per quantificare il carico tumorale destinato ad aiutare standardizzare il protocollo di acquisizione per il confronto di diversi saggi in luoghi diversi in momenti diversi e che non richiede calcoli del computer. Per garantire la riproducibilità e la corretta quantificazione flusso di fotoni, il dispositivo di imaging deve essere calibrato con un riferimento chiaro per i dispositivi fatti in casa o come raccomandato dal fornitore per i dispositivi commerciali.

Il nostro protocollo richiede attenzione a diversi p criticaoints: (i) In primo luogo, la qualità dell'anestesia mouse è fondamentale per ottenere immagini nitide, specialmente nei casi con lunghi tempi di esposizione. (Ii) L'unità quantificazione deve essere sempre il flusso di fotoni perché radianza dipende dalla superficie di ciascun topo e potrebbe essere irrilevante per confrontare topi differenti. (Iii) Le immagini bioluminescenza non devono contenere pixel saturi, perché questi avrebbe polarizzare il luminoscore. (iv) Di nuovo ed acquisizione anteriore sono tenuti a raccogliere tutti i fotoni emessi dal sito tumorale (cioè, l'acquisizione anteriore non può necessariamente rilevare fotoni dal retro del tumore). Vari disegni ROI diversi stati testati durante lo sviluppo del metodo luminoscore. Solo l'uso mark-up dato risultati soddisfacenti che hanno maggiori probabilità di essere statisticamente significativo (dati non mostrati).

Inoue et al. raccomanda una dose luciferina di 75 mg / kg ^13. Usando una dose di 150 mg / kg, invece, la tempistica delle immagini dopo laamministrazione luciferina rimane invariato e si assicurano che l'altopiano dura per tutta una acquisizione esposizione a lungo. Luciferin deve essere il reagente in eccesso durante il processo di acquisizione. A seconda del modello, la regione di interesse può essere adattato, come abbiamo mostrato nel modello SCL dove abbiamo disegnato due ROI per animale. Nel modello SCL, il trattamento viene iniettato quando il tumore raggiunge 0,5 cm nella sua grande diametro per limitare variabilità di attecchimento. A seconda dei topi, il tumore potrebbe aver cresciuto diverso. Per uniformare e confrontare i topi, abbiamo deciso di utilizzare un rapporto tra lato trattato e non trattato che rivela la crescita relativa di entrambi i tumori fianchi.

Se nessun segnale viene osservato da un mouse iniettato dovrebbe essere positivo, (i) il numero di cellule è molto basso e il segnale è al di sotto della soglia di rilevamento; o (ii) il mouse manca di ossigeno e richiede cure immediate.

Molti dei bioluminesc quantitativaza analisi descritto da vari autori richiedono calcoli complessi e strumenti (ad esempio, 3D bioluminescenza tomografia) per avvicinarsi alla quantificazione assoluta dei fotoni emessi bioluminescenza ^5,15. Non c'è consenso su un metodo per quantificare bioluminescenza riproducibile, soprattutto nei modelli di tumore, con un imager 2D bioluminescenza. Il nostro obiettivo era quello di standardizzare il protocollo di acquisizione delle immagini per limitare user-dipendenza.

L'iniezione di CpG in situ dopo l'inoculazione del tumore riduce il carico tumorale in entrambi i modelli. Il metodo luminoscore può servire come strumento per monitorare il carico tumorale in altri modelli di immunoterapie tumorali. Monitoraggio carico tumorale fornisce un metodo non invasivo che può migliorare la nostra comprensione della crescita tumorale e metastasi meccanismi senza interferire con il microambiente tumorale. L'identificazione degli animali che fanno e non rispondono al trattamento con questo metodo è rafforzata dalla verifica della siniezione di cellule tumorali uccessful all'inizio dell'esperimento.

Abbiamo qui mostrato la capacità di adattamento del metodo luminoscore in un modello SCL utilizzando cellule A20.IIA-luc2. Tuttavia, questo metodo può essere adattato a qualsiasi altro modello di tumore usando altre linee cellulari condizione che esprimono luciferasi, o nell'ambito di studi cellule T (tumore specifica cellule T citotossiche, cellule T regolatorie, ecc). Il monitoraggio in vivo trasferimento genico nel contesto della terapia genica delle malattie rare potrebbe anche essere fatta usando il metodo luminoscore.

Infine i dati mostrano che il metodo luminoscore bioluminescenza-based permette il confronto tra esperimenti, offre flessibilità e adattabilità alle specifiche esigenze sperimentali, ed è uno strumento utile per non invasivi studi preclinici longitudinali.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CpG 1826	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826
ODN 1826 control	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c
D-luciferin potassium salt	Interchim	Catalog number: FP-M1224D
Ketamin	Virbac, France
Xylazin	Bayer Healthcare	Rompun 2%
A20.IIA-luc2 cell line		A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310)
Mice	Balb/cByj	Six-weeks old females from Charles River
IVIS lumina Biolumienscence imager	Perkin Elmer
Living Image software	Perkin Elmer	Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs
R software (opensource)	R-project	Used for statistic tests
Hamilton Precision Serynge 10 µl	Hamilton	Product number 7642-01100
Eye ointment	Lacrinorm
Dissecting microscope	ZEISS	Stemi 305