פליטת אור מבוסס שיטת כימות גידול עבור התקדמות גידול ניטור שפעות טיפול מודלים לימפומה העכבר

Summary

הדמית פליטת אור היא כלי ידוע לאיתור גידולים וגרורים, אבל כימות של התמונות האלה לעתים קרובות דורש חישובים מורכבים ומכשירים בפרט. אנו מתארים את שיטת luminoscore הקלה לשימוש, מבוסס על תנאי רכישה מדויקים, אין צורך בחישובים, ומאפשר ניטל גידול ותגובה לטיפול כדי להיות במעקב במודלים של עכברים.

Abstract

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Introduction

זיהוי תאים סרטניים מוקדם עדיין מהווה אתגר והיא חיונית לשיפור יעילות טיפול בסרטן. הדמית פליטת אור בשנת vivo (BLI) היא טכניקה אופטית רגישה מאוד, לא פולשנית, בשימוש נרחב לניטור לגידולים בחיות קטנות. תאים בלוציפראז להביע גחלילית משמשים לניסויים כאלה ^1,2. Oxygenase זה מתחמצן D-luciferin עם חמצן מולקולרי אבל דורש שני קו-פקטורים - Mg ^{2 +} ו ³ אדנוזין אדנוזין. בלוציפראז Firefly הוא יותר מתאים הדמית in vivo מ renilla בלוציפראז ⁴ כי תשואת הקוונטים שלה היא גבוהה.

מצע החמצון - oxyluciferin - ספונטני פולט פוטון לחזור למצבו יסוד ולאחר מכן הופך להיות לא פעיל. הפוטונים הנפלטים יש אורך גל מקסימום בסביבות 530 ננומטר. מצלמת רגישות גבוהה יכולה לזהות את הפוטונים הזורחים מבפנים של חיה קטנה ולספק תמונות שהופכות אותו possible לאתר תאים סרטניים.

היכולת לכמת נטל הגידול במדויק על ידי ספירת פוטון יכול לשמש ככלי רב עוצמה ורגיש לכימות יעילות הטיפול. בגלל השפעות הטיפול ניתן לאתר מוקדם יותר, רגישות זו עלולה להפוך אותו ניתן לקבוע את הרגע המדויק שבו טיפול לתוקף.

כימות מוחלט של פוטונים נפלטים הכולל הוא מאוד מורכב. מספר הפוטונים שנאספו תלוי בעומק של הגידול על האיברים הפוטונים הנפלטים דרך. מקדמי תיקון בהתבסס על מקדם קליטת רקמות ניתן לחשב ^5, אבל כימות המוחלטת של מספרי תאים סרטניים דורשת לדעת את מספר הפוטונים הנפלטים בכל תא גידול. יתר על כן, ביטוי בלוציפראז, כמו זה של גני כתב רבים (למשל., חלבוני ניאון) אינו הומוגנית, גם באוכלוסיית תא הנגזר יחיד שיבוט ^6. המספר לוציפרחלבוני ASE בתאים לא ניתן לחשב בדיוק. הקמת תנאים סטנדרטיים ניסיוני נראה אפוא חיוני לניתוח וכמותיות אמין.

יישמנו את שיטת luminoscore לשני דגמים שונים העכבר לימפומה ^7,8,9. במודלים אלה, תאים סרטניים syngeneic מוזרקים לתוך העין או מתחת לעור כדי לקבל, בהתאמה, לימפומה תוך עיני העיקרי (PIOL) מודל לימפומה תת עורית מודל (SCL). בכל אחד הדגמים orthotopic אלה, הטיפול מנוהל באתרו, שבעה ימים לאחר חיסון הגידול עבור PIOL וכאשר הגידול ל -0.5 כדי 0.7 ס"מ קוטר הגדול ביותר שלה עבור SCL.

השתמשנו בשיטת luminoscore לפקח על השפעות בטיפול CPG באתרו, הראה בעבר כיעיל ^7,10,11. CPG הוא רצף oligonucleotide ו ליגנד של TLR9, אשר בתורו הוא קולטן תאיים שהביע ce הרבLLS של מערכת החיסון, כולל תאים דנדריטיים, לימפוציטים מסוג B, מונוציטים, ותאי הרג טבעי. CPG-DNA הוא רצף DNA 20-mer המכיל את CPG (CG) מוטיב immunostimulatory; השליטה (שליטה ODN) הוא רצף אותה 20-mer DNA, אלא רצף CG immunostimulatory הוא הפוך (GC). אירוסין TLR9 ב הלימפומה murine אנחנו לומדים גורם לאפופטוזיס ^10, מפעיל את מערכת החיסון ^12, ובכך מפחית באופן משמעותי נטל הגידול ^7,11.

כאן אנו מתארים שיטה סטנדרטית לכימות נטל הגידול ותגובה לטיפול באמצעות דימויים bioluminescent. שיטה זו מסתמכת על היבטים שונים של הליך ההדמיה, מרכישת הניתוח, כדי לייעל אמינות, שחזור, תלות שאינם משתמשים ומובהקים. מדד כימות פליטת אור מיוחס כל עכבר; ערך זה, אשר אנו מכנים luminoscore, ניתן להשוות לא רק בין בעלי חיים אבל אלכך בין הניסויים.

בעבודה זו, אנו מתמקדים הליך הדמית פליטת האור וכן כימות התמונה בשיטת luminoscore. אנחנו מראים את היעילות של שיטה זו לאימות הזריקה, ניטור נטל הגידול, ולהערכת יעילות בטיפול בסרטן באתרו. כל הנקודות הללו מודגם בתוצאות נציג מניסויים באמצעות מודלים שונים של עכברים כדי להדגיש את יכולת ההתאמה של השיטה luminoscore.

Protocol

כל הנהלים הקשורים עכברים מצייתים להנחיות איחוד האירופי, תקנות צרפתיות לניסויים בבעלי חיים (משרד חקלאות חוק המס '2001-464, מאי 2001), ואת והנחיות ועדת Institut National de la Santé et de la המשוכללת והנדירה Medicale (INSERM) על Animal Research, ואושרו על ידי הוועדה המקומית הרלוונטית (ועדת האתיקה צ'רלס דרווין לניסויים בבעלי חיים, פריז, צרפת; מספר היתר: P3 / 2009/004).

1. תא הכנה

1. לגדול שורת תאים עכבר B לימפומה-luc2 A20.IIA במדיום Glutamax RPMI-1640 השלימו עם 10% נסיוב עגל עוברית, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 10 פירובט נתרן מ"מ, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 0.50 מ"ג / מ"ל ​​hygromycin B.
2. לשמור על תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ולשנות בינוני כל יומיים שלושה. קציר 5 מ"ל של ההשעיה תא עם יום פיפטה אחת לאחר שינוי המדיום.
3. ספין תאים ב 3005; גרם במשך 10 דקות ו להשעות את התאים 3 מ"ל בופר פוספט סטרילית (PBS). חזור על פעולה זו פעמיים כדי לשטוף את התאים.
4. מערבבים 15 μl של ההשעיה תא עם 30 μl תיוג Trypan כחול לפני טעינת תא לספור Malassez. חשב את הריכוז התא עם הנוסחה: ריכוז (תאים / מ"ל) = מספר התאים ברשת ספירת * 3 * 1000.
5. ספין עוד פעם אחת התאים יותר XG ב 300 במשך 10 דקות. הסר supernatant עם טפטפת. עם C הריכוז מחושב בשלב 1.4), את מספר התאים הוא N = C * 3.
6. חשב את נפח של PBS 1x סטרילי נדרש לקבל השעיה תא בריכוז של 5 x 10 ⁷ תאים / מ"ל עם הנוסחה הבאה: כרך PBS (מ"ל) = N / (5 x 10 ^7). להשעות את התא גלול (משלב 1.5)) בהיקף של 1x PBS סטרילי מחושב במשפט הקודם. ההשעיה תא היא לשמש במודל SCL (בנפח מוזרק vivo הוא 100 μl: 5 x 10 ⁶ תאיםים).
7. פיפטה 10 μl של השעיה תא ולהוסיף 90 μl של PBS סטרילי בתוך שפופרת 1.5 מ"ל להשיג 100 μl של B ההשעיה התא 5 x 10 ⁶ תאים לכל מיליליטר. B Cell ההשעיה היא לשמש במודל PIOL (בנפח vivo מוזרק הוא 2 μl: 1 x 10 ⁴ תאים).

2. Luciferin

1. לדלל 1 גרם של אבקת מלח אשלגן D-luciferin ב 30 מ"ל של 1x PBS סטרילי בתוך שפופרת 50 מ"ל ולנער במשך כמה שניות כדי לפזר את אגרגטים.
   הערה: מאחר luciferin הוא רגיש לאור, להכין 500 aliquots μl צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge כהה.
2. אחסן את aliquots ב -20 מעלות צלזיוס.
   הערה: aliquots יכול להיות מאוחסן במשך מספר חודשים.
   לאחר ההפשרה, aliquots אסור להיות מאוחסן במשך יותר מ 1 יום 4 ° C. מחזורי הפשרה הקפאה עדיפים על אחסון ב 4 ° C.
3. להזריק 100 μl של תמיסת מלח אשלגן D-luciferin intraperitoneally לכל אסא הדמיהy.
   הערה: פתרון זה מתאים 3.3 מ"ג לכל עכבר עבור מנה של 150 מ"ג / ק"ג.

3. תערובת הרדמת הרדמה

1. הכן ההרדמה על ידי ערבוב קטמין 120 מ"ג / ק"ג ו xylazine 6 מ"ג / ק"ג ב 1x PBS סטרילית.
2. להזריק 60 μl של תערובת הרדמה intraperitoneally לכל assay הדמיה עם מחט 25 G. לכירורגיה (עם PIOL או מודל SCL), להזריק 80 μl של התערובת להשיג הרדמה עמוקה יותר. שים את העכבר לכלוב שלה.
3. כאשר סמן העכבר מופיע נייח, להסיר אותו מהכלוב ללחוץ בעדינות את רגלו של העכבר בין האצבעות. אם העכבר מגיב עם רפלקס בריחה, להמתין מספר דקות. חזור על הפעולה עד העכבר אינו מגיב, אשר מאשרת הרדמה משביעת רצון.
4. מניחים את העכבר על צלחת ההתחממות או מתחת למנורת חימום.
5. החל העין משחה כדי למנוע יובש בעיניים במהלך הרדמה עבור assay הדמיה או לניתוח SCL. החל אתמשחת עיניים לאחר ניתוח מודל PIOL.

כירורגיה 4. הרכבת חיסון נייד

הערה: בצע את כל הליכים כירורגיים על צלחת ההתחממות או מתחת למנורת חימום, בתוך ארון בטיחות מסוג 1 מיקרוביולוגית במתקן רמת בטיחות ביולוגית חיה 2. כל כלי כירורגיים המופיעים בפסק זו היו autoclaved לפני השימוש.

1. תת עורי לימפומה דגם:
   1. הכן 100 μl של ההשעיה תא שהושגו בשלב 1.6 בתוך מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G. יש ללחוץ בעדינות את העור העכבר על אגפו בין האצבעות, במקום ההזרקה. הכנס את המחט בדיוק לחיק העור. כדי להבטיח הזרקה תת עורית, אל תניח את המחט עמוק לתוך הרקמה.
      1. להזריק את התאים לתוך skinfold. שים לב אם כדור נוזלי מעט מופיע מתחת לעור כדי לאשר את הזריקה בוצעה כראוי.
2. מודל PIOL:
   הערה: proce זהדורה דורשת 2 מפעילים, המכונים כאן 1 מפעיל ו -2 מפעיל.
   1. הסרת הלחמית:
      1. יש מקום המפעיל 1 העכבר תחת מיקרוסקופ לנתח. לחץ בעדינות עם האצבעות בכל צד של העין כדי לנקות אותה. הישארו בתנוחה זו.
      2. יש מפעיל 2 l ook מבעד למיקרוסקופ לנתח. גריפ הלחמית עם זוג קטן של צבת ביד אחת; בעזרת היד השנייה, לחתוך את לחמית ממש מתחת הצבת עם מספריים קטנים כירורגית.
      3. יש מפעיל 1 שחרור העין של העכבר לחוץ בשלב 4.2.1.1)
   2. Cell הזרקה:
      1. הכן מזרק דיוק בוטה של ​​10 μl. לשטוף את זה על ידי שאיבת מים סטריליים deionized דרכו. חזור פעמיים או שלוש פעמים כדי לוודא שאין בועות בתוך המזרק. אז להכין 2 μl של השעית תא להזרקה.
      2. יש להקיש 2 מפעיל בעדינות עם האצבעות עלדואר יד בכל צד של העין כדי לנקות אותה. הישארו בתנוחה זו.
      3. יש אחיזת מפעיל 1 בקצה העין עם זוג קטן של צבת ביד אחת ולמשוך אותו אחורה בעדינות כדי למתוח את הרקמה.
      4. יש מפעיל 2 l ook מבעד למיקרוסקופ לנתח. עם מצד השני, לעשות חור קטן בגלגל העין הנחה של העכבר עם מחט 32 G.
      5. יש מפעיל 2 הניח את המחט ולאסוף (עם אותה היד) מזרק הדיוק להכניס את המחט לתוך החור שנעשה בשלב 4.2.2.4.
      6. יש לדחוף מפעיל 1 על הבוכנה במזרק עם מאידך גיסא.
      7. יש מפעיל 2 נ erify עם מיקרוסקופ לנתח כי השעית תא המזרק כבר הזריקה כראוי בתוך גלגל העין (זרימת הנוזל ניתן לצפות בקלות).
      8. יש סר r 2 מפעילים את מזרק הדיוק.
      9. יש r 1 מפעיל elease קצהעין imal אחז בשלב 4.2.2.3)
      10. יש elease r 2 מפעיל בצידי העין לחוץ בשלב 4.2.2.2)
      11. החל את משחת עיניים מיד.
          הערה: אם כל הצעדים בוצעו כהלכה, העכבר צריך לא לדמם כלל במהלך הליך זה.

הדמית פליטת אור 5. - יום 0

הערה: כל המוצרים מוזרקים לתוך העכבר חייבים להיות ב RT לפני הזריקה. לאחר גידול תאים כבר מחוסנים, ובעוד החיה היא מורדמת עדיין, המשך השלבים הבאים לפתרון בעית ההדמיה.

1. הפעל את תרמי ולפתוח תוכנת הרכישה. לאתחל את המצלמה, בשלבים, ועדשות ידי לחיצה על כפתור "אתחול". האתחול ייקח 10 עד 15 דקות כדי להיות שלם.
2. להזריק 100 μl של תמיסת מלח אשלגן D-luciferin intraperitoneally עם מחט 25 G. אין לנהל אותו דרך הווריד. אם intravenouשל הממשל נדרש מכל סיבה שהיא, מלח נתרן luciferin-D יש להשתמש במקום מלח אשלגן D-luciferin.
   הערה: Luciferin הוא מגיב עודף בריכוז זה; ולכן אות פליטת האור תגיע טבלה לאחר 3 עד 7 דקות ו נמשכת יותר מ -30 דקות.
3. 10 דקות לאחר הזרקת D-luciferin ^13, הציבו את עכבר הנושא התרמי. מניח את העכבר לעמדה הטבעית שלו, גבה אל המצלמה, כ שטוחה עמדה ככל האפשר. עמדה זו היא טבעית ובקלות לשחזור.
4. סמן את תכונת Auto-חשיפה, ולחץ על לרכוש כדי לרכוש את התמונה בחזרה (האחורי) של החיה, עם תכונת Auto-חשיפה.
   הערה: התכונה האוטומטית החשיפה מייעל זמן חשיפה על ידי חישוב זה מתמונת חשיפת 1-sec. אם אות פליטת האור של העכבר היא שלילית או נמוכה מאוד, את זמן החשיפה האופטימלי עלול להיותבאופן אוטומטי מוגדר יותר מ -20 דקות. במקרה זה, זמן חשיפה של 8 עד 10 דקות עשוי להיות פשרה טובה. זמן חשיפה ניתן להגדיר באופן ידני, אך התמונות לא חייבות לכלול פיקסלים רוויים.
5. הפך את העכבר מעל לחשוף החלק הקדמי של העכבר למצלמה. נסה לשטח את העכבר ולהפיץ גפיים שלה קדמיים, כך שהם אינם חוסמים את החזה.
6. לרכוש תמונה קדמית של החיה. ודא כי תיבת הסימון אוטומטי החשיפה עדיין מסומנת ולחץ שוב על הכפתור "לרכוש".
   ההערה: התמונה הקדמית ניתן לרכוש לפני התמונה בחזרה ולהיפך. זמן החשיפה של תמונות מלפנים ומאחור יכול להיות שונה בהתאם לעוצמת היחסית של כל צד של העכבר. זה מחושב באופן אוטומטי בעת השימוש בתכונה האוטומטית החשיפה. כימות משתמשת רק שטף הפוטון (פוטונים לכל שניות) ואינו תלוי זמן חשיפה.
7. מניחים את העכבר על plat ההתחממותדואר או מתחת למנורת חימום עד שהוא מתאושש מההרדמה ולאחר מכן למקם אותו בחזרה בכלוב שלה.

6. הדמיה פליטת אור - אחרי יום 0

1. הפעל את תרמי, לאתחל את המצלמה, בשלבים, ועדשות כמו בשלב 5.1).
2. להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של 60 μl של קטמין (120 מ"ג / ק"ג) / xylazine (6 מ"ג / ק"ג) תערובת (ראה צעדים 3.1 כדי 3.5).
   הערה: שיטה זו של הרדמה מאפשרת הדמיה כל 5 ימים. כדי לבצע הדמיה יומית, שיטה המשתמשת isoflurane כמו ההרדמה וחדר תרמי פליטת אור מתאים לשימוש עם הרדמה זו נדרשת.
3. לרכוש תמונות קדמיות ואחוריות של החיה, באמצעות תכונת Auto-החשיפה, כמו צעדים 5.5) ו -5.6). להתמודד עם העכבר כמו בשלב 5.7).

כימות פליטת אור 7. וניתוח תמונה

הערה: שיטת luminoscore מבוססת על תמונה לניתוחים. לאחר התמונות נרכשו על פי השלבים שלעיל, כימות יכול להתבצע בכל עת (כולל מיד לאחר הרכישה), לשייך luminoscore לכל עכבר בכל נקודת זמן.

1. הצג את "Palette Tool" על ידי לחיצה על תפריט "תצוגה" ולאחר מכן לחץ על "Palette Tool" אם כבר אינו מוצג. לחץ על כרטיסיית "כלי ROI" של צבעי הכולים. בחר בלחצן "קונטור" ולאחר מכן בחר "תיקו חינם".
2. באופן ידני לסמן את האזור של עניין (ROI) סביב העכבר על ידי ביצוע הקצוות של העכבר על התצוגה הקדמית. סגור את קווי המתאר עם קליק ימני על עכבר המחשב.
3. לחץ על התפריט "תצוגה" ולאחר מכן "מדידות ROI". ודאו "Radiance (פוטונים)" נבחר "סוגי המדידה" גלילת תפריט בפינה השמאלית התחתונה של החלון "מדידות ROI". אם לא, בחר אותה. ואז למדוד את fl פוטוןUX (ph / s) על ידי הקלטת הערך בתיבת "סה"כ השטף [p / s]".
   הערה: אל תשתמש Radiance או כל יחידה אחרת שהיא יחסית שטח הפנים ROI.
4. חזור על שלבים 7.2) ו -7.3) עבור התצוגה בחזרה.
5. לסכם את ערכי שטף שני פוטון המתקבלים במבט חזיתי ואחורי. התוצאה היא luminoscore.
6. השווה את הערכים עבור כל קבוצה באמצעות מבחן נתון מתאים (הלא פרמטרית שני זנב מבחן Mann-Whitney, למשל) ^14.

תוצאות

שיטת Luminoscore יכול מגישה כדי לאמת את הזרקת התאים הסרטניים

במודלים מעורבים הזריקה של מספר קטן של תאים סרטניים או כאשר ההזרקה אינה מאפשרת אימות ויזואלי של הזריקה, זה יכול להיות מאוד קשה על מנת להבטיח את איכות הזריקה. שיטת luminoscore משמשת ככלי מהיר ונוח לאימות האיכות של ההליך ולברר בקלות מיידית כי הכל עלה יפה. בשני המודלים, הגידול ניתן לזהות מוקדם ככל 10 דקות לאחר (איור 1 א) ההזרקה. התמונות לבד יספיק כדי לוודא כי תאים סרטניים נמצאים במיקום הנכון. אף על פי כן, קשה לכמת את התמונות מספק רעיון של ההטרוגניות של הזריקה. העלילה נקודה (איור 1B) מראה בבירור את ההבדל בין לחיות שקיבלו (נקודות שחורות) ולא מחדשceive (קו אדום) זריקות. מעניין לציין, כי האות המתקבל במודל SCL הוא 100 פעמים גבוהה יותר מאשר מודל PIOL; ממצא זה עולה בקנה אחד עם מספר התאים המוזרקים (5 x 10 ⁶ ו 1 x 10 ⁴ תאים, בהתאמה).

איור 1. אימות של הזרקה בעכברי מודל לימפומה שונה. Luminoscores נמדד 10 דקות לאחר חיסון תאים סרטניים במודלים לימפומה שונים. (א) נציג תמונות של שני הדגמים. (ב) Luminoscore של כל חיה במודלים השונים. הקו האדום תואם את רעשי רקע הממוצעים נמדדו על 10 חיות לפני חיסון תאים סרטניים; הקווים המקווקווים הם הסטייה הממוצעת +/- סטנדרטי. עבור כל דגם, כל החיות ניתן להבחין בין רעש רקע. במודל PIOL, 1 x 10 ⁴ תאים היו inoculated ב הזגוגית של העין הימנית, ואת במודל SCL, 5 x 10 ⁶ תאים מתחת לעור לתוך כל אגף של העכבר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניטור נטל הגידול ואת התגובה לטיפול

Luminoscore הוא גם כלי רב עצמה ללימוד צמיחת גידול יעיל טיפול. איור 2A מראה תמונות נציג של הניטור של גידול בבקרה ואת CPG מטופלי קבוצות PIOL. העכברים היו מחוסנים עם 1 x 10 ⁴ תאים סרטניים כל, והטיפול היה מנוהל באתרו ביום 7. התמונות מראות כי לאחר זמן מספיק (28 ימים), גרורות החלו להופיע בקבוצת הביקורת. למרות הגידול הראשוני לא נראה רגיש לטיפול, פחותגרורות נצפו בקבוצה שטופלה-CPG (טבלה 1). הניתוח הכמותי של נטל הגידול בכל קבוצה (תרשים 2B) מראה כי CPG האט התפתחות גידולים, ייצור הבדל מובהק סטטיסטית בין מטופלים לבין קבוצת הביקורת לאחר 28 ימים (הלא פרמטרית שני זנב מבחן Mann-Whitney p = 0.0079 ). עם זאת, הגידולים עדיין גדלו עכברים שטופלו, ואף אחד מהם לא שרד (מידע לא מוצג). ממצא זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים: CPG אין השפעה משמעותית על גידולים עיניים עיקריים ^10. ההשפעה המשמעותית שיש לנו כאן בין ODN וקבוצת CPG מקורו עיכוב הצמיחה הגרורה.

ניטור איור 2. נטל הגידול ואת התגובה לטיפול. (א) נציג תמונות של שתי הקבוצות (ODN-מלא CPG שטופלה) of PIOL נושאות עכברים. (ב) ניטור נטל הגידול עם luminoscore. כפי שניתן לראות על המגרש נקודה, השפעת CPG על luminoscore הוא משמעותי ביום 28. שתי קבוצות אלו, שיטה זו איפשרה לפקח נטל הגידול וכדי למדוד את קלה אך משמעותית (p = 0.0079) ההשפעות של CpG- DNA, אשר לא ניתן היה לאתרם באמצעות תמונות בלבד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קבוצות	עכבר	נוכחות של גרורות	מקום	שטף פוטון (ph / s)
CPG	1	לא	איקס	איקס
	2	כן	צומת lymp Eye-ניקוז	9.32E + 05
	3	לא	איקס	איקס
	4	לא	איקס	איקס
	5	כן	Eye-ניקוז צומת lymp	2.21E + 07
ODN	1	כן	Eye-ניקוז צומת lymp	1.06E + 07
	2	כן	Eye-ניקוז צומת lymp	7.25E + 07
	3	כן	Eye-ניקוז צומת lymp + נגדית	7.64E + 08
	4	כן	Eye-ניקוז צומת lymp + נגדית	1.74E + 09
	5	כן	Eye-ניקוז צומת lymp + נגדית	9.76E + 07

טבלה 1. Tהוא Luminoscore שיטה ניתן להתאים גישות שונות

שיטת luminoscore אינה מוגבלת לסוג אחד של מודל עכבר. איור 3 מראה כי זה יכול להיות מותאם במודלים של עכברים שונים. במודל SCL, שני גידולים מורכבים בכל צד של העכבר. הטיפול מנוהל באתרו גבי צד אחד ביום 0, ואת הגידול הנגדי משמש שליטתה (איור 3 א). לכן, שני ROI נמשך לכל עכבר: אחד לכל צד (איור 3 ג). היחס בין luminoscore בצדדים המטופלים ובקרה מתאר את המהלך היחסי של כל גידול. יחס זה נקבע ל -1 ביום 0, כאשר היה מנוהל הטיפול. צפינו ירידה משמעותית של יחס זה 13 ימים לאחר מתן הטיפול (3D איור; הלא פרמטרית שני זנב p מבחן Mann-Whitney = 0.004). ירידה זו מגלה שגידול הצד שטופלכבר resorbed, כפי שמוצג על תמונות פליטת אור נציג (איור 3 ב).

איור 3. התאמת שיטת Luminoscore על דגם עם שני אתרי גידול ראשוניים. (א) עיצוב ניסיוני של assay SCL. העכברים הוזרקו שני גידולים ראשוניים בכל אגף. צד אחד מוזרק עם או CPG-DNA או ODN שליטה, ואת הצד השני עם PBS, לשמש שליטתה. (ב) נציג תמונות של CPG שטופלו ובקרה עכברים ביום 0 ויום 13. הטיפול היה מנוהל ביום 0. צמיחת גידול הייתה עצורה בצד שטופל CPG של העכבר. (ג) באזורים מסומנים באופן ידני של עניין לכל חיה לשני אתרי גידול ראשוני. (ד) היחס בין luminoscores של שטופל CPG או ODN שליטת הצד שלו והצד המלא PBS הוא מדדמשקף את הגידול היחסי של כל גידול בתוך החיה אותו. יחס זה נקבע ל -1 ביום 0. ביום 13, היחס בין קבוצת CPG שטופלה ירד משמעותי (p = 0.004), חושף עיכוב של צמיחת גידול על ידי במנהל באתרו של CPG-DNA. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

קליטת אור על ידי איברים ורקמות נשארת מגבלה של הדמית פליטת אור, למרות מגבלה זו היא מהותית לכל שיטת הדמיה אופטית. בהקשר של גישתנו, את ההשפעות של מבנים אנטומיים על luminoscore צפויים יש השתנות נמוכות ובלבד המחקרים מתבצעים מודל נתון (מיקום גדיל עכבר), המאפשרים אז השוואות. פליטת אור לא צריך אור עירור ובכך הוא יותר מותאמת כל גוף in vivo הדמיה מאשר קרינה.

רזולוציה מרחבית בנוסף לכך קיימת הגבלה של הדמיה פליטת אור, ואת המיקום המדויק של האיבר שממנו פוטונים פליטת אור נפלטים עדיין קשה. עם זאת, ידע טוב של המודל יכול לעזור במיקום האיכותי של אתרי גידול. התפוקה רק בשיטה המבוססת על פליטת אור זה הוא luminoscore. מיקום אינו משפיע על luminoscore כיוון שאזור mark-up הידני של interest (ROI) מכסה את העכבר כולו. לבסוף, גחלילית בלוציפראז דורש חמצן. לפיכך, הדמיה פליטת אור בדרך כלל אינו מעריך נכון גידולים נמקי. שוב, ידע טוב של היבט זה של המודל נדרש.

במאמר זה, אנחנו לא מכוונים בהערכת היעילות של CPG כתרופה נגד סרטן (שכבר הודגמה ^7,9,11) אלא לתאר שיטה שמאפשרת השוואה של מערכי נתוני פליטת אור. אנחנו אכן מתארים שיטה לכמת ניטל גידול נועד לסייע לתקנן את פרוטוקול הרכישה להשוואת מבחנים שונים במקומות שונים בזמנים שונים שאינו דורש חישובי מחשב. כדי להבטיח שחזור וכימותי שטף פוטון נכון, מכשיר ההדמיה חייב להיות מכויל עם הפנית אור למכשירי תוצרת בית או כפי שהומלץ על ידי הספק עבור מכשירים מסחריים.

הפרוטוקול שלנו צריך להיעשות בזהירות רבה לכמה p הקריטיoints: (i) ראשית, איכות הרדמת העכבר היא קריטית להשגת תמונות ברורות, במיוחד במקרים עם זמני חשיפה ארוכים. (Ii) יחידת הכימות חייבת להיות תמיד להיות שטף הפוטון כי זוהר תלוי את שטח הפנים של כל עכבר ועשוי להיות רלוונטי להשוואת עכברים שונים. (Iii) תמונות פליטת האור אסור להכיל פיקסלים רוויים, כי אלה עלולים להביא להטיית luminoscore. (iv) חזרה ורכישה מול נדרשים לאסוף את כל הפוטונים נפלטים מאתר הגידול (כלומר, רכישה מול לא בהכרח לזהות פוטונים מהחלק האחורי של הגידול). ציורי ROI שונים נבחנו במהלך הפיתוח של שיטת luminoscore. רק mark-up הידנית הניבה תוצאות משביעות רצון כי יש סיכוי גבוה יותר להיות בעלי משמעות סטטיסטית (מידע לא מוצג).

Inoue et al. ממליצים על מינון luciferin של 75 מ"ג / ק"ג ^13. על ידי שימוש במינון של 150 מ"ג / ק"ג במקום, התזמון של הדמיה לאחרממשל luciferin נותר ללא שינוי ואנחנו להבטיח כי הרמה נמשכת לאורך רכישת חשיפה ארוכה. Luciferin חייב להיות מגיב העודף לאורך כל תהליך הרכישה. בהתאם לדגם, האזור של עניין יכול להיות מותאם, כפי שהראינו במודל SCL שבו שהסקנו שני ROI לכל בעלי החיים. במודל SCL, הטיפול מוזרק כאשר הגידול מגיע 0.5 ס"מ קוטר הגדול ביותר שלה להגביל השתנות של engraftment. בהתאם העכברים, הגידול עלול גדל בצורה שונה. כדי לתקנן ולהשוות עכברים, החלטנו להשתמש יחס בין מטופלים בצד הלא מטופלים החושף את הצמיחה היחסית של גידולי החביות שניהם.

אם אין אות הוא ציין של העכבר מוזרק צפוי להיות חיובי, (i) את מספר התאים מאוד נמוך האות מתחת לסף הגילוי; או (ii) העכבר חסר חמצן ודורש טיפול מיידי.

כמה מן bioluminesc כמותיence הניתוחי שתואר על ידי מחברים שונים דורשים חישובים ומכשירים מורכבים (למשל, טומוגרפיה פליטת אור 3D) להתקרב כימות המוחלטת של פוטוני פליטת אור נפלט ^5-15. אין הסכמה על שיטה לכימות פליטת אור reproducibly, במיוחד במודלים הגידול, עם תרמי פליטת אור 2D. מטרתנו הייתה ליצור אחידות פרוטוקול רכישת התמונה להגביל-תלות משתמש.

הזרקה של CPG באתרו לאחר חיסון הגידול מופחת נטל הגידול בשני המודלים. השיטה luminoscore יכול לשמש ככלי לניטור נטל הגידול במודלים אחרים של immunotherapies הגידול. ניטור נטל הגידול מספק שיטה לא פולשנית שיכולה לשפר את ההבנה שלנו של הגידול ומנגנונים גרורות מבלי להפריע במיקרו-סביבה של הגידול. זיהוי של בעלי חיים עושים ולא מגיבים לטיפול בשיטה זו מקבל חיזוק על ידי האימות של היםהזרקת תאים סרטניים uccessful בתחילת הניסוי.

אנחנו כאן הראינו את יכולת ההתאמה של שיטת luminoscore במודל SCL באמצעות תאי A20.IIA-luc2. עם זאת, ניתן להתאים שיטה זו לכל מודל גידול אחר באמצעות שורות תאים אחרות ובלבד שהם מבטאים בלוציפראז, או בהקשר של מחקרי T-cell (גידולים ספציפיים ציטוטוקסיות T- תאים, רגולציה מתאי T, וכו '). הניטור של העברת גנים in vivo בהקשר של ריפוי גנטי של מחלה נדירה גם יכול להיעשות בשיטת luminoscore.

לבסוף הנתונים מראים כי שיטת luminoscore מבוסס פליטת האור מאפשרת השוואות בין ניסויים, מציעה גמישות והתאמה לצרכימים ספציפיים הניסיונות, הוא כלי שימושי עבור מחקרים פרה אורך לא פולשנית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CpG 1826	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826
ODN 1826 control	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c
D-luciferin potassium salt	Interchim	Catalog number: FP-M1224D
Ketamin	Virbac, France
Xylazin	Bayer Healthcare	Rompun 2%
A20.IIA-luc2 cell line		A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310)
Mice	Balb/cByj	Six-weeks old females from Charles River
IVIS lumina Biolumienscence imager	Perkin Elmer
Living Image software	Perkin Elmer	Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs
R software (opensource)	R-project	Used for statistic tests
Hamilton Precision Serynge 10 µl	Hamilton	Product number 7642-01100
Eye ointment	Lacrinorm
Dissecting microscope	ZEISS	Stemi 305