Méthode tumeur Quantification bioluminescence-Basé pour Progression Surveillance de la tumeur et les effets de traitement dans les modèles de souris lymphome

Résumé

l'imagerie par bioluminescence est un outil bien connu pour la localisation de tumeurs et les métastases, mais la quantification de ces images nécessite souvent des calculs complexes et des instruments particuliers. Nous décrivons la méthode luminoscore-utilisation facile, en fonction des conditions d'acquisition précises, ne nécessitant pas de calculs, et en permettant la charge tumorale et la réponse au traitement à surveiller dans les modèles de souris.

Résumé

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Introduction

La détection des cellules tumorales précoce reste un défi et est crucial pour l' amélioration de l' efficacité du traitement du cancer. In vivo l' imagerie par bioluminescence (BLI) est une technique optique non invasive très sensible, largement utilisé pour les tumeurs de surveillance chez les petits animaux. Cellules luciférase exprimant Firefly sont couramment utilisés pour de telles expériences ^1,2. Cette oxygénase oxydent D-luciférine avec de l' oxygène moléculaire , mais nécessite deux cofacteurs - Mg ²⁺ et adénosine triphosphate ^3. Luciole luciférase est plus appropriée pour l' imagerie in vivo que la luciférase de Renilla ⁴ parce que son rendement quantique est plus élevé.

Le substrat oxydé - oxyluciférine - émet spontanément un photon pour revenir à son état fondamental, puis devient inactif. Les photons émis ont une longueur d'onde maximale d'environ 530 nm. Une caméra à haute sensibilité permet de détecter les photons luminescents à l'intérieur d'un petit animal et fournir des images qui en font possIble pour localiser les cellules tumorales.

La capacité de quantifier la charge tumorale avec précision par comptages de photons pourrait servir comme un outil puissant et sensible pour quantifier l'efficacité du traitement. Parce que les effets du traitement peuvent être détectés plus tôt, cette sensibilité peut permettre de déterminer le moment exact où un traitement devient efficace.

quantification absolue du nombre total de photons émis est très complexe. Le nombre de photons recueillis dépend de la profondeur de la tumeur et sur les organes les photons sont émis à travers. Les coefficients de correction sur la base des coefficients d'absorption du tissu peut être calculée ^5, mais la quantification absolue du nombre de cellules tumorales nécessite de connaître le nombre de photons émis par chaque cellule tumorale. En outre, l' expression de la luciférase, comme celle de nombreux gènes rapporteurs (par exemple., Les protéines fluorescentes) n'est pas homogène, même dans une population de cellules provenant d'un seul clone ^6. Le nombre de luciferprotéines ase dans les cellules ne peuvent pas être calculées exactement. La mise en place des conditions expérimentales normalisées apparaît donc cruciale pour une analyse semi-quantitative fiable.

Nous avons appliqué la méthode de luminoscore à deux modèles différents de lymphome de souris ^7,8,9. Dans ces modèles, les cellules tumorales syngéniques sont injectées dans l'oeil ou sous la peau pour obtenir respectivement un premier modèle de lymphome intra-oculaire (PIOL) et un lymphome sous-cutané (SCL) modèle. Dans chacun de ces modèles orthotopiques, le traitement est administré in situ, sept jours après l'inoculation de la tumeur pour PIOL et quand la tumeur a atteint 0,5 à 0,7 cm dans son plus grand diamètre pour SCL.

Nous avons utilisé la méthode de luminoscore pour surveiller les effets de la thérapie in situ CpG dans, précédemment montré pour être efficace ^7,10,11. CpG est une séquence d'oligonucléotide et un ligand du TLR9, ce qui est un récepteur intracellulaire exprimé par de nombreuses CEIIs du système immunitaire, notamment les cellules dendritiques, les lymphocytes B, les monocytes et les cellules tueuses naturelles. CpG ADN est une séquence d'ADN 20-mère contenant le CpG (CG) du motif immunostimulateur; le contrôle (ODN-control) est la même séquence d'ADN 20-mer, sauf que la séquence CG immunostimulante est inversé (GC). Engagement TLR9 dans le lymphome murin nous étudions induit l' apoptose ^10, active le système immunitaire ^12, et ainsi réduit de manière significative la charge tumorale ^7,11.

Nous décrivons ici une méthode normalisée pour quantifier la charge tumorale et la réponse au traitement à travers des images bioluminescentes. Cette méthode repose sur différents aspects de la procédure d'imagerie, de l'acquisition à l'analyse, afin d'optimiser la fiabilité, la reproductibilité, la dépendance non-utilisateur, et la signification statistique. Un indice bioluminescence de quantification est attribué à chaque souris; cette valeur, que nous appelons un luminoscore, peut être comparé non seulement entre les animaux, mais aldonc entre les expériences.

Dans ce travail, nous nous concentrons sur la procédure d'imagerie par bioluminescence, ainsi que l'image de quantification par la méthode luminoscore. Nous montrons l'efficacité de cette méthode de contrôle de l'injection, la surveillance de la charge tumorale et l' évaluation de l'efficacité du traitement du cancer in situ. Chacun de ces points est illustré dans les résultats représentatifs des expériences en utilisant différents modèles de souris pour mettre en évidence la capacité d'adaptation de la méthode de luminoscore.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des souris respectées directives de l'Union européenne, la réglementation française pour l'expérimentation animale (Ministère de l'agriculture Loi n ° 2001-464, mai 2001), et les lignes directrices du National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Comité Institut sur animal Research, et ont été approuvés par le comité local concerné (le Comité d'éthique de Charles Darwin pour l'expérimentation animale, Paris, France; Nombre de permis: p3 / 2009/004).

1. Préparation des cellules

1. Cultiver la souris B lignée cellulaire de lymphome A20.IIA-luc2 dans le milieu RPMI-1640 Glutamax complété par 10% de sérum de veau foetal, 100 ug / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, du pyruvate de sodium 10 mM, 50 pM de 2-mercaptoéthanol et 0,50 mg / ml d'hygromycine B.
2. Maintenir la culture de cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ et changement de milieu tous les deux à trois jours. Récolte 5 ml de la suspension de cellules avec une pipette un jour après le remplacement du milieu.
3. cellules de spin à 3005; g pendant 10 minutes et les cellules en suspension dans 3 ml d'une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Répétez cette étape deux fois pour laver les cellules.
4. Mélanger 15 ul de suspension cellulaire avec 30 ul de bleu Trypan marquage avant le chargement d'une chambre de comptage de Malassez. Calculer la concentration de cellules à la formule: Concentration (cellules / ml) = nombre de cellules dans la grille de comptage * 3 * 1000.
5. Faites tourner la cellules une fois de plus à 300 xg pendant 10 min. Retirer le surnageant avec une pipette. Avec C la concentration calculée à l'étape 1.4), le nombre de cellules est N = C * 3.
6. Calculer le volume de PBS 1x stérile nécessaire pour obtenir une suspension de cellules A à une concentration de 5 x 10 ⁷ cellules / ml avec la formule suivante: PBS volume (ml) = N / (5 x 10 ^7). Suspendre le culot cellulaire (de l'étape 1.5)) dans le volume de PBS stérile 1x calculé dans la phrase précédente. Une suspension cellulaire doit être utilisée dans le modèle SCL (in vivo volume injecté est de 100 pl: 5 x 10 ⁶ celluless).
7. Introduire à la pipette 10 ul de suspension cellulaire A et ajouter 90 ul de PBS stérile dans un tube de 1,5 ml pour obtenir 100 ul de suspension de cellules B à 5 x 10 ⁶ cellules par ml. La suspension cellulaire B doit être utilisé dans le modèle PIOL (in vivo volume injecté est de 2 ul de 1 x 10 ⁴ cellules).

2. Luciferin

1. Diluer 1 g de poudre de sel de potassium de D-luciférine dans 30 ml de PBS stérile 1x dans un tube de 50 ml et agiter pendant quelques secondes pour dissoudre les agrégats.
   NOTE: Parce que luciférine est sensible à la lumière, préparer 500 aliquotes dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml sombres.
2. Conserver les aliquotes à -20 ° C.
   NOTE: Les aliquotes peuvent être stockés pendant plusieurs mois.
   Après décongélation, les aliquotes ne doivent pas être conservées plus de 1 jour à + 4 ° C. cycles de congélation-décongélation sont préférables au stockage à 4 ° C.
3. Injecter 100 ul de solution de sel de potassium de D-luciférine pour chaque voie intrapéritonéale assa d'imageriey.
   NOTE: Cette solution correspond à 3,3 mg par souris pour une dose de 150 mg / kg.

3. Mélange anesthésique et Anesthésie

1. Préparer une solution anesthésique de kétamine en mélangeant 120 mg / kg et xylazine 6 mg / kg dans du PBS 1x stérile.
2. Injecter 60 ul de mélange anesthésique intrapéritonéale pour chaque test d'imagerie avec une aiguille 25 G. Pour la chirurgie (avec ou PIOL modèle SCL), injecter 80 ul du mélange pour obtenir une anesthésie profonde. Placez la souris dans sa cage.
3. Lorsque la souris apparaît immobile, retirez-le de sa cage et presser doucement la jambe de la souris entre les doigts. Si la souris réagit avec un réflexe d'échappement, attendez plusieurs minutes. Répétez l'action jusqu'à ce que la souris ne réagit pas, ce qui confirme anesthetization satisfaisante.
4. Placez la souris sur une plaque chauffante ou sous une lumière de réchauffement.
5. Appliquer une pommade oculaire pour éviter la sécheresse oculaire pendant une anesthésie pour le dosage d'imagerie ou d'une intervention chirurgicale SCL. Appliquer lepommade oculaire après une intervention chirurgicale pour le modèle PIOL.

4. Surgery and Cell Inoculation

REMARQUE: Effectuer toutes les interventions chirurgicales sur une plaque chauffante ou sous une lumière de réchauffement, dans une enceinte de sécurité 1 microbiologique de type 2 dans une installation de niveau de biosécurité animale. Tous les instruments chirurgicaux utilisés dans cette section ont été autoclaves avant utilisation.

1. Sous - cutanée Lymphome Modèle:
   1. Préparer 100 ul de la suspension cellulaire obtenue à l'étape 1.6 dans une seringue de 1 ml avec une aiguille 25 G. Presser délicatement la peau de la souris sur le flanc entre les doigts, sur le site d'injection. Insérez l'aiguille exactement dans le pli de la peau. Pour assurer l'injection sous-cutanée, ne pas placer l'aiguille profondément dans le tissu.
      1. Injecter des cellules dans le pli cutané. Observer si une petite boule de liquide apparaît sous la peau pour confirmer que l'injection a été effectuée correctement.
2. Modèle PIOL:
   NOTE: Ce procedure nécessite 2 opérateurs, appelés ici en tant qu'opérateur 1 et exploitant 2.
   1. L'enlèvement de la conjonctive:
      1. Avoir opérateur 1 place la souris sous un microscope à dissection. Appuyez doucement avec les doigts de chaque côté de l'œil pour l'effacer. Maintenir cette position.
      2. Avoir Opérateur 2 l ook à travers le microscope de dissection. Grip la conjonctive avec une petite paire de pinces dans une main; avec l'autre main, couper la conjonctive juste en dessous de la pince avec une petite paire de ciseaux chirurgicaux.
      3. Avoir opérateur 1 libération l'œil de la souris enfoncé à l' étape 4.2.1.1)
   2. injection de cellules:
      1. Préparer un 10 pi de précision contondant seringue. Lavez par pompage d'eau déminéralisée stérile à travers elle. Répétez deux ou trois fois pour qu'il n'y ait pas de bulles dans la seringue. Préparer ensuite 2 ul de suspension cellulaire pour injection.
      2. Avoir l' opérateur 2 appuyez doucement avec les doigts de lae main de chaque côté de l'œil pour l'effacer. Maintenir cette position.
      3. Avoir opérateur 1 saisir le bord de l'œil avec une petite paire de pinces dans une main et tirez - le doucement vers l' arrière pour étirer le tissu.
      4. Avoir Opérateur 2 l ook à travers le microscope de dissection. Avec l'autre main, faire un petit trou dans le globe oculaire inférieure de la souris avec une aiguille 32 G.
      5. Demandez à l' opérateur 2 posa l'aiguille et ramasser (avec la même main) la seringue de précision et insérer l'aiguille dans le trou fait à l' étape 4.2.2.4.
      6. Avoir opérateur 1 pression sur le piston de la seringue avec l'autre main.
      7. L' opérateur dispose 2v ÉRIFIEZ avec le microscope de dissection que la suspension de cellules dans la seringue a été correctement injecté à l' intérieur du globe oculaire (l'écoulement de liquide est facilement observable).
      8. Avoir l' opérateur 2 r emove la seringue de précision.
      9. Demandez à l' opérateur 1 r depresse le bord de la uneimal oeil saisi à l'étape 4.2.2.3)
      10. Avoir l' opérateur 2 r depresse les côtés de l'œil pressé à l' étape 4.2.2.2)
      11. Appliquer la pommade oculaire immédiatement.
          NOTE: Si toutes les étapes ont été effectuées correctement, la souris ne devrait pas saigner du tout au cours de cette procédure.

5. bioluminescence Imaging - Jour 0

NOTE: Tous les produits injectés dans la souris doivent être à température ambiante avant l'injection. Après la tumeur des cellules ont été inoculées, et alors que l'animal est encore anesthésiée, passez à ces étapes pour l'imagerie.

1. Allumez l'imageur et ouvrez le logiciel d'acquisition. Initialisation de la caméra, les étapes et les lentilles en cliquant sur le bouton "Initialisation". L'initialisation prendra 10 à 15 min pour être complet.
2. Injecter 100 ul de solution de sel de potassium de D-luciférine intraperitoneale avec une aiguille 25 G. Ne pas administrer par voie intraveineuse. Si intravenoul' administration s est nécessaire pour une raison quelconque, le sel de sodium de D-luciférine doit être utilisé plutôt que le sel de potassium de D-luciférine.
   NOTE: Luciferin est le réactif en excès à cette concentration; par conséquent, le signal de bioluminescence atteint un plateau au bout de 3 à 7 minutes et persiste pendant plus de 30 min.
3. 10 min après injection D-luciférine ^13, placez le sujet souris dans l'imageur. Placez la souris dans sa position naturelle, son dos vers la caméra, dans une position aussi plat que possible. Cette position est naturelle et facilement reproductible.
4. Cochez la fonction d'exposition automatique, et cliquez sur Acquire pour acquérir l'image arrière (postérieure) de l'animal, avec la fonction d'exposition automatique.
   REMARQUE: La fonction d'exposition automatique optimise le temps d'exposition en calculant à partir d'une image d'exposition de 1 seconde. Si le signal de bioluminescence de la souris est négative ou très faible, le temps d'exposition optimale pourrait êtreautomatiquement réglé à plus de 20 min. Dans ce cas, un temps d'exposition de 8 à 10 min peut être un bon compromis. Le temps d'exposition peut être réglée manuellement, mais les images ne doit pas contenir des pixels saturés.
5. Retournez la souris pour exposer la face avant de la souris à la caméra. Essayez d'aplatir la souris et la propagation de ses membres antérieurs afin qu'ils ne bloquent pas la poitrine.
6. Acquérir une image avant de l'animal. Vérifiez que la case auto-exposition est toujours cochée et cliquez à nouveau sur le bouton "Acquire".
   REMARQUE: L'image avant peut être acquis avant l'image en arrière et vice versa. Le temps d'exposition des images avant et arrière peuvent être différentes en fonction de l'intensité relative de chaque côté de la souris. Il est calculé automatiquement lorsque vous utilisez la fonction d'exposition automatique. Quantification utilise uniquement le flux de photons (photons par seconde) et ne dépend pas du temps d'exposition.
7. Placez la souris sur un plat de réchauffemente ou sous une lumière de réchauffement jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie, puis placez-le dans sa cage.

6. bioluminescence Imaging - After Day 0

1. Allumez l'imageur, initialiser la caméra, les étapes et les lentilles comme dans l'étape 5.1).
2. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 60 ul du mélange de kétamine (120 mg / kg) / xylazine (6 mg / kg) (voir les étapes 3.1 à 3,5).
   NOTE: Cette méthode de anesthetization permet l'imagerie tous les 5 jours. Pour effectuer l'imagerie par jour, une méthode qui utilise l'isoflurane comme anesthésique et un système d'imagerie par bioluminescence approprié pour une utilisation avec cet anesthésique est nécessaire.
3. Acquérir les images avant et arrière de l'animal, en utilisant la fonction d'exposition automatique, comme dans les étapes 5.5) et 5.6). Manipulez la souris comme dans l'étape 5.7).

7. bioluminescence Quantification et analyse d'images

NOTE: La méthode de luminoscore est basée sur l'image analysis. Une fois que les images ont été acquises en suivant les étapes ci-dessus, la quantification peut être effectuée à tout moment (y compris immédiatement après l'acquisition), pour associer une luminoscore à chaque souris à chaque point temporel.

1. Afficher l'outil "Palette" en cliquant sur le menu "Affichage" puis cliquez sur "Palette d'outils" si pas déjà affiché. Cliquez sur l'onglet "ROI Tool" de la palette d'outils. Cliquez sur le bouton "Contour", puis sélectionnez "tirage gratuit".
2. Marquer manuellement la région d'intérêt (ROI) autour de la souris en suivant les bords de la souris sur la vue de face. Fermez le contour avec un clic droit sur la souris d'ordinateur.
3. Cliquez sur le menu "Affichage" puis "ROI Mesures". Assurez-vous que "Radiance (Photons)" est sélectionné dans la section «Types de mesure" menu déroulant en bas à gauche de la fenêtre "Mesures de retour sur investissement". Sinon, sélectionnez-le. Puis mesurer la fl photoniqueux (ph / s) en enregistrant la valeur dans le "Total Flux [/ s p]" boîte.
   NOTE: Ne pas utiliser Radiance ou toute autre unité qui est par rapport à la surface de retour sur investissement.
4. Répétez les étapes 7.2) et 7.3) pour la vue arrière.
5. Additionner les valeurs de flux à deux photons obtenus à partir de l'avant et arrière. Le résultat est le luminoscore.
6. Comparer les valeurs pour chaque groupe à l' aide d' un test statistique approprié (non-paramétrique à deux queues test de Mann-Whitney, par exemple) ^14.

Résultats

La méthode Luminoscore peut servir à vérifier l'injection des cellules tumorales

Dans les modèles impliquant l'injection d'un petit nombre de cellules tumorales ou lorsque le site d'injection ne permet pas un contrôle visuel de l'injection, il peut être très difficile d'assurer la qualité de l'injection. La méthode de luminoscore sert d'outil rapide et pratique pour vérifier la qualité de la procédure et de vérifier facilement et instantanément que tout allait bien. Dans les deux modèles, la tumeur est détectable dès 10 minutes après l'injection (figure 1A). Les images seules suffisent pour vérifier que les cellules tumorales sont présentes dans l'emplacement correct. Néanmoins, la quantification des images donne une idée de l'hétérogénéité de l'injection. Le tracé de points (figure 1B) montre clairement une différence entre les animaux qui ont reçu (points noirs) et n'a pas recevoir (ligne rouge) injections. Fait intéressant, le signal obtenu dans le modèle SCL est 100 fois plus élevé que dans le modèle PIOL; Ce résultat est cohérent avec le nombre de cellules injectées (5 x 10 ⁶ et 1 x 10 ⁴ cellules, respectivement).

Figure 1. Vérification de l' injection dans différents modèles de souris lymphome. Les luminoscores mesuré 10 min après l' inoculation des cellules tumorales dans des modèles de lymphome différents. (A) Des images représentatives des deux modèles. (B) Luminoscore de chaque animal dans les différents modèles. La ligne rouge correspond au bruit de fond moyen mesuré sur 10 animaux avant l'inoculation des cellules tumorales; les lignes en pointillé sont l'écart moyen +/- écart. Pour chaque modèle, tous les animaux peuvent être distingués des bruits de fond. Dans le modèle PIOL, 1 x 10 ⁴ cellules ont été INOCmenté dans le corps vitré de l'œil droit, et dans le modèle SCL, 5 x 10 ⁶ cellules sous - cutanée dans chaque flanc de la souris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Surveillance Tumeur Burden et la réponse au traitement

Le luminoscore est également un outil puissant pour étudier la croissance tumorale et l' efficacité du traitement. La figure 2A montre des images représentatives de la surveillance de la croissance tumorale dans le contrôle et le groupe traité CpG piol. Les souris ont été inoculées avec des cellules de 1 x 10 ⁴ tumorales chacun, et le traitement a été administré in situ au jour 7. Les images montrent que , après un temps suffisant (28 jours), les métastases ont commencé à apparaître dans le groupe de contrôle. Bien que la tumeur primaire ne semble pas sensible au traitement, moinsLes métastases ont été observées dans le groupe traité par le CpG (tableau 1). L'analyse quantitative de la charge de la tumeur dans chaque groupe (figure 2B) montre que le CpG a ralenti le développement de tumeurs, en produisant une différence statistiquement significative entre le groupe traité et le groupe témoin au bout de 28 jours (non paramétrique à deux queues test de Mann-Whitney p = 0,0079 ). Néanmoins, les tumeurs ont continué de croître chez les souris traitées, et aucun d'entre eux ont survécu (données non présentées). Cette constatation est cohérente avec les rapports précédents: CpG n'a pas d' effets significatifs sur les tumeurs oculaires primaires ^10. L'effet significatif que nous avons ici entre l'ODN et le groupe CpG provient de l'inhibition de la croissance des métastases.

Figure 2. Suivi des tumeurs de la charge et la réponse au traitement. (A) Des images représentatives des deux groupes (ODN CpG de contrôle et traité) osouris f PIOL portant. charge de la tumeur (B) de suivi avec le luminoscore. Comme on le voit sur le graphique point, l'effet de CpG sur le luminoscore est significatif au jour 28. Dans ces deux groupes, cette méthode a permis de contrôler la charge tumorale et de mesurer les faibles mais significatives (p = 0,0079) les effets de CpG ADN, qui aurait pu ne pas être détectée par les seules images. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Groupes	Souris	Présence de métastases	Emplacement	Photon flux (ph / s)
CpG	1	Non	X	X
	2	Oui	Noeud lymp Eye-drainant	9.32E + 05
	3	Non	X	X
	4	Non	X	X
	5	Oui	Eye-drainant noeud lymp	2.21E + 07
ODN	1	Oui	Eye-drainant noeud lymp	1.06E + 07
	2	Oui	Eye-drainant noeud lymp	7.25E + 07
	3	Oui	Eye-égouttage noeud lymp + controlatéral	7.64E + 08
	4	Oui	Eye-égouttage noeud lymp + controlatéral	1.74E + 09
	5	Oui	Eye-égouttage noeud lymp + controlatéral	9.76E + 07

Tableau 1. Til Luminoscore procédé peut être adapté à différentes approches

Le procédé de luminoscore ne se limite pas à un seul type de modèle de la souris. La figure 3 montre qu'il peut être adapté à différents modèles de souris. Dans le modèle SCL, deux tumeurs sont greffées sur chaque côté de la souris. Le traitement est administré in situ en un seul côté au jour 0, et la tumeur contralatérale sert de témoin (figure 3A). Par conséquent, deux ROI ont été établis par la souris: un pour chaque côté (figure 3C). Le rapport entre le luminoscore sur les côtés traités et de contrôle décrit l'évolution relative de chaque tumeur. Ce ratio a été fixé à 1 au jour 0, lorsque le traitement a été administré. Nous avons observé une diminution significative de ce rapport 13 jours après l' administration du traitement (figure 3D, non paramétrique à deux queues test de Mann-Whitney p = 0,004). Cette diminution révèle que le côté traité tumeura été résorbée, comme indiqué sur les images de bioluminescence représentatives (figure 3B).

Figure 3. Adaptation de la méthode Luminoscore à un modèle avec deux sites de la tumeur primitive. (A) de conception expérimentale d'un essai SCL. Les souris ont été injectées avec deux tumeurs primaires dans chaque flanc. Un côté est injecté soit avec CpG ODN ADN ou de contrôle, et l'autre côté avec du PBS, pour servir de son contrôle. (B) images représentatives de souris CpG-traités et de contrôle au jour 0 et le jour 13. Le traitement a été administré au jour 0. la croissance tumorale a été inhibée sur le côté CpG traité de souris. (C) marqué manuellement des régions d'intérêt par animal pour les deux sites de la tumeur primaire. (D) le rapport entre les luminoscores du CpG traité ou côté ODN-contrôle et le côté de contrôle PBS est un indice quireflète l'augmentation relative de chaque tumeur dans le même animal. Ce ratio a été fixé à 1 au jour 0. Au jour 13, le rapport du groupe CpG traités avait diminué de façon significative (p = 0,004), révélant une inhibition de la croissance tumorale par l' administration in situ de CpG-ADN. S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

absorption de la lumière par les organes et les tissus reste une limitation de l'imagerie par bioluminescence, bien que cette limitation est intrinsèque à toute modalité d'imagerie optique. Dans le cadre de notre approche, les effets des structures anatomiques sur le luminoscore devraient avoir une faible variabilité à condition que les études sont réalisées dans un modèle donné (emplacement et brin de la souris), ce qui permet ensuite des comparaisons. Bioluminescence n'a pas besoin de lumière d'excitation et est donc plus adapté à tout le corps dans l' imagerie in vivo de la fluorescence.

La résolution spatiale est également une limitation de l'imagerie par bioluminescence, et l'emplacement précis de l'organe à partir de laquelle les photons sont émis bioluminescence reste difficile. Cependant, une bonne connaissance du modèle peut aider à la localisation qualitative des sites tumoraux. La seule sortie de cette méthode basée bioluminescence-est le luminoscore. Lieu n'influence pas la luminoscore parce que la majoration manuelle Région de Interest (ROI) couvre toute la souris. Enfin, la luciférase de luciole a besoin d'oxygène. En conséquence, l'imagerie par bioluminescence sous-estime généralement des tumeurs nécrosées. Encore une fois, une bonne connaissance de cet aspect du modèle est nécessaire.

Dans cet article, nous ne cherchons pas à évaluer l'efficacité des CpG comme un médicament anti-tumoral (qui a déjà été démontré ^7,9,11) , mais de décrire une méthode permettant de comparer les ensembles de données de bioluminescence. Nous décrivons en effet une méthode pour quantifier la charge tumorale destiné à aider normaliser le protocole d'acquisition pour comparer différents dosages dans des endroits différents à des moments différents et qui ne nécessite pas de calculs informatiques. Pour assurer la reproductibilité et la quantification correcte du flux de photons, le dispositif d'imagerie doit être étalonné avec une lumière de référence pour les appareils faits maison ou comme recommandé par le fournisseur pour les appareils commerciaux.

Notre protocole exige une attention particulière à plusieurs p critiquesoints: (i) d'abord, la qualité de l'anesthésie de la souris est cruciale pour obtenir des images claires, en particulier dans les cas de longues durées d'exposition. (Ii) L'unité de quantification doit être toujours le flux de photons, car le rayonnement dépend de la surface spécifique de chaque souris, et peut-être pas pertinent pour comparer les différentes souris. (Iii) Les images de bioluminescence ne doivent pas contenir des pixels saturés, car ceux-ci fausserait le luminoscore. (iv) Retour et l' acquisition avant sont tenus de recueillir tous les photons émis par le site de la tumeur (ie, l' acquisition avant peut ne pas détecter nécessairement photons à l'arrière de la tumeur). Divers différents dessins de retour sur investissement ont été testés lors de l'élaboration de la méthode de luminoscore. Seul le manuel mark-up a donné des résultats satisfaisants qui sont plus susceptibles d'être statistiquement significative (données non présentées).

Inoue et al. recommande une dose de luciférine de 75 mg / kg ^13. En utilisant une dose de 150 mg / kg au lieu, le moment de l'imagerie après lel'administration de luciférine reste inchangé et nous assurer que le plateau dure toute une acquisition d'exposition à long. Luciferin doit être réactif en excès tout au long du processus d'acquisition. Selon le modèle, la région d'intérêt peut être adapté, comme nous l' avons montré dans le modèle SCL où nous avons tiré deux ROI par animal. Dans le modèle SCL, le traitement est injecté lorsque la tumeur atteint 0,5 cm dans son plus grand diamètre pour limiter la variabilité la prise de greffe. Selon les souris, la tumeur aurait grandi différemment. Afin d'uniformiser et de comparer les souris, nous avons décidé d'utiliser un rapport entre le côté traité et non traité qui révèle la croissance relative des deux tumeurs des flancs.

Si aucun signal est observé à partir d'une souris injectée devrait être positif, soit (i) le nombre de cellules est très faible et le signal est en dessous du seuil de détection; ou (ii) la souris manque d'oxygène et nécessite des soins immédiats.

Plusieurs des bioluminesc quantitativerence analyses décrit par divers auteurs exigent des calculs complexes et les instruments (par exemple, la tomographie par bioluminescence 3D) pour approcher la quantification absolue des photons de bioluminescence émis ^5,15. Il n'y a pas de consensus sur une méthode de quantification bioluminescence reproductible, en particulier dans les modèles de tumeurs, avec une bioluminescence imageur 2D. Notre objectif était de normaliser le protocole d'acquisition d'image pour limiter l'utilisateur dépendance.

L'injection de CpG in situ après l' inoculation de la tumeur réduit la charge tumorale dans les deux modèles. La méthode de luminoscore peut servir d'outil pour surveiller la charge tumorale dans d'autres modèles de immunothérapies tumorales. La surveillance de la charge tumorale fournit une méthode non invasive qui peut améliorer notre compréhension de la croissance tumorale et les mécanismes métastatiques sans interférer avec le microenvironnement de la tumeur. L'identification des animaux qui ne sont et ne répondent pas au traitement par cette méthode est renforcée par la vérification de l'artl'injection de cellules tumorales uccessful au début de l'expérience.

Nous ici montré la capacité d'adaptation de la méthode de luminoscore dans un modèle SCL en utilisant des cellules A20.IIA-luc2. Cependant, cette méthode peut être adaptée à n'importe quel autre modèle de tumeur à l' aide d' autres lignées cellulaires à condition qu'elles expriment la luciférase, ou dans le cadre d'études de lymphocytes T (cellules T cytotoxiques spécifiques d'une tumeur, cellules T régulatrices, etc.). La surveillance in vivo de transfert de gènes in dans le contexte de la thérapie génique d' une maladie rare peut également être effectuée en utilisant la méthode de luminoscore.

Enfin, les données montrent que la méthode de luminoscore basée bioluminescence-permet des comparaisons entre les expériences, offre la flexibilité et l'adaptabilité aux besoins expérimentaux spécifiques, et est un outil utile pour les études précliniques longitudinales non invasives.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CpG 1826	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826
ODN 1826 control	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c
D-luciferin potassium salt	Interchim	Catalog number: FP-M1224D
Ketamin	Virbac, France
Xylazin	Bayer Healthcare	Rompun 2%
A20.IIA-luc2 cell line		A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310)
Mice	Balb/cByj	Six-weeks old females from Charles River
IVIS lumina Biolumienscence imager	Perkin Elmer
Living Image software	Perkin Elmer	Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs
R software (opensource)	R-project	Used for statistic tests
Hamilton Precision Serynge 10 µl	Hamilton	Product number 7642-01100
Eye ointment	Lacrinorm
Dissecting microscope	ZEISS	Stemi 305