La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; Ex Vivo</em

Resumen

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Resumen

Muchos estudios tratan de identificar y mapear las regiones del cerebro implicadas en las regulaciones fisiológicas específicas. Los c-fos proto-oncogén, un gen temprano inmediato, se expresa en neuronas en respuesta a diversos estímulos. El producto de proteína se puede detectar fácilmente con técnicas inmunohistoquímicas que conducen a la utilización de la detección de c-FOS para mapear grupos de neuronas que muestran cambios en su actividad. En este artículo, nos hemos centrado en la identificación de poblaciones neuronales del tronco cerebral implicados en la adaptación ventilatoria a la hipoxia o hipercapnia. Se describieron dos enfoques para identificar poblaciones neuronales implicadas en vivo en animales y ex vivo en las preparaciones del tronco cerebral deafferented. En vivo, los animales fueron expuestos a mezclas de gases con hipercapnia o hipoxia. Ex vivo, preparaciones deafferented fueron perfundidas con hipoxia o hipercapnia líquido cefalorraquídeo artificial. En ambos casos, ya sea de control o en los animales in vivo ex preparaciones in vivo se mantuvieron en condiciones de normoxia y normocápnicos. La comparación de estos dos enfoques permite la determinación del origen de la activación es decir, neuronal, periférico y / o central. In vivo y ex vivo, se recogieron brainstems, se fijaron, y cortados en secciones. Una vez que se prepararon secciones, la detección inmunohistoquímica de la proteína c-FOS se hizo con el fin de identificar los grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos hipóxicos o hipercapnia. Las células marcadas se contaron en estructuras respiratorias del tronco cerebral. En comparación con la condición de control, la hipoxia o hipercapnia aumentado el número de células marcadas c-fos en varios sitios del tronco cerebral específicas que son, pues, constitutiva de las vías neuronales implicados en la adaptación de la unidad central de la respiración.

Introducción

El gen c-fos se identificó por primera vez a principios de 1980 ^1,2 y su producto se caracterizó en 1984 como una proteína nuclear que tiene propiedades de gen activador de ^3,4. Participa en los mecanismos a largo plazo asociados con la estimulación de las neuronas. De hecho, los cambios en la actividad neuronal conducen a segundo mensajero de señalización cascadas que inducen la expresión del gen temprano inmediato c-fos, que induce la producción del factor de transcripción c-FOS. Este último inicia la expresión de los genes tardíos y por lo tanto participa en las respuestas de adaptación del sistema nervioso a muchos tipos diferentes de estímulos ^4. Por lo tanto, desde el final de 1980 ^5,6, detección de la proteína c-FOS se ha utilizado con frecuencia para estudiar los efectos de factores exógenos sobre la transcripción de genes en general ⁴ y sobre la actividad del sistema nervioso central (CNS) para trazar las vías neuronales involucrados en diferentes fisiológicacondiciones al.

La expresión basal c-fos se ha estudiado en diversas especies, incluyendo ratones, rata, gato, mono, y humano ^4. De este modo, la cinética de su expresión es relativamente bien conocidos. La activación de la transcripción es rápida (5-20 min) ^7,8, y la acumulación de ARNm alcanza un máximo entre 30 y 45 min después del comienzo de la estimulación ⁹ y disminuye con una corta vida media de 12 min. La síntesis de la proteína c-FOS sigue la acumulación de ARNm y se pudo detectar mediante inmunohistoquímica en 20 a 90 minutos después de la estimulación ^6.

Análisis de la expresión de c-fos se utiliza clásicamente en estudios in vivo para identificar la red central de la respiración que participan en las respuestas ventilatorias a la hipoxia o hipercapnia ^10-14. Más recientemente, esta herramienta también se utilizó en las preparaciones del tronco cerebral ex vivo para explorar adaptaciones de red respiratorias centrales a la hipoxia o hypercapnia ^15-18. De hecho, estas preparaciones generan una actividad rítmica clásica asimilada a la unidad central de la respiración ^19. Por lo tanto, este tipo de preparación tiene la ventaja de ser completamente deafferented, y por lo tanto, los resultados con respecto a la expresión de c-fos sólo reflejan las consecuencias de una estimulación central sin ninguna intervención de las estructuras periféricas.

La detección c-FOS podría hacerse por métodos inmunohistoquímicos o immunohistofluorescence. inmunodetección indirecta requiere el uso de un anticuerpo primario contra c-FOS y un anticuerpo secundario dirigido contra la especie en la que se produjo el anticuerpo primario. Para el método de inmunohistoquímica, el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima (peroxidasa, por ejemplo) que actúa sobre un sustrato (H ₂ O ₂ para la peroxidasa). El producto de la reacción enzimática se desarrolla por un cromógeno (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobencidinae), que tiñe y se puede observar en el microscopio de luz. La reacción podría ser reforzado con sulfato de amonio níquel. Estos métodos permiten la detección de sustancias activas neuronas durante diferentes retos fisiológicos y, por tanto, la identificación y / o la cartografía de las vías periféricas y centrales que participan en las respuestas fisiológicas consecutivos.

Protocolo

Nota: La detección de c-fos es un procedimiento normalizado que implica varios pasos (Figura 1). Todos los experimentos se realizaron en ratas o ratones. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en el experimento con animales Charles Darwin (ce5 / 2011/05), realizado de conformidad con la Directiva del Consejo Comunidades Europeas de 22 de septiembre, 2010 (2010/63 / UE) para el cuidado de los animales, y realizarse de conformidad con las leyes francesas para el cuidado de animales.

1. Preparación de soluciones

1. Preparar tampón de fosfato de sodio 0,2 M: añadir 6,24 g de NaH ₂ PO ₄ * 2 H ₂ O y 22,56 g de Na ₂ HPO ₄ * _H2O a 1 l de agua destilada mientras se agita.
2. Preparar 4% de paraformaldehído (PFA): se añaden 20 g de PFA a 150 ml de agua destilada. Calentar la solución a 80 ° C mientras se agitaba. Para borrar la solución, reduzca el fuego y añadir 1 ó 2 gotas de NaOH 1 N para ayudar al paraformaldehído se disuelve. Completa a 250 mlcon agua destilada y añadir 250 ml de tampón fosfato 0,2 M (pH 7,4). Almacenar a 4 ° C. Tome el cuidado apropiado cuando se usan estos reactivos. Manipular con guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad a una campana química.
   Nota: Preparar PFA al 4% en el día antes de que las perfusiones. Determinar el volumen de 4% PFA como una función de la edad, el número y especies de animales.
3. Preparar la solución de crioprotector: En 250 ml de solución salina tamponada con fosfato 0,2 M, mezclar 5 g de polivinilpirrolidona, 150 g de sacarosa y 2,5 g de cloruro de sodio. Después de la disolución completa, añadir 150 ml de etilenglicol y ajustar a 500 ml con agua destilada. Almacenar la solución crioprotectora a 4 ° C.
4. Preparar solución salina 0,1 M tamponada con fosfato (PBS): añadir 18 g de NaCl a agua destilada 1 L mientras se agita. Después de la disolución completa, añadir 1 L 0,2 M de tampón de fosfato de sodio.
5. Preparar Phosphate Buffered Saline suplementado con 0,3% de Triton X100 (PBST): Añadir 3 ml de Triton X100 a 997 ml de PBS.
6. Preparar 0,05 M tampón Tris (pH 7,6): añadir 3,03 g de Tris-hidrocloruro y 0,70 g de Tris-base a 500 ml de agua destilada mientras se agitaba.
7. Preparar un 2% de suero de cabra en PBST: para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 600 l de suero de cabra al 30 ml de PBST y mezclar bien. Añadir 2,5 ml por pocillo.
   Nota: El suero utilizado debe provenir de especies utilizadas para la producción de anticuerpo secundario
8. Preparar anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-FOS (1: 4000, SC-52) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%). Para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 75 mg de albúmina de suero bovino a 30 ml PBST y mezclar bien. A continuación, añadir 7,5 l de anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-Fos.
9. Preparar anticuerpo de cabra biotinilado anti-conejo (1: 500) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%). Para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 75 mg de albúmina de suero bovino a 30 ml PBST y mezclar bien. Luego añade60 l de anticuerpo anti-conejo de cabra biotinilado.
10. Preparar avidina-biotina-peroxidasa (1: 250) en (solución ABC) PBST. Para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 120 l de reactivo A y 120 l de reactivo B y 30 ml de PBST y mezclar bien.
    Nota: La solución de ABC se debe preparar al menos 30 minutos antes de su uso.
11. Prepare la solución de sustrato. Inmediatamente antes de su uso, preparar la solución de la siguiente manera (para una placa): añadir 20 mg de sulfato de amonio níquel y 10 mg de tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina a 50 ml de tampón Tris. Filtrar y protegerlo de la luz. Añadir 2,0 ml por pocillo. En la solución restante (25 ml) añadir 17 l de H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ solución al 30% en _H2O). Añadir 2,0 ml por pocillo.
    Nota: El cuidado apropiado debe tener cuidado al utilizar estos reactivos. Manipular con guantes y batas de laboratorio.

2. c-fos Inducción y procesamiento de tejidos in vivo

Nota: Los experimentos se realizaron en ratas (Sprague Dawley) o ratones (C57BL / 6).

1. Colocar los animales en una caja hermética ventilado con un hipóxica (O ₂ 8% N equilibrado ₂₎ o hipercápnica (CO ₂ 4%, O ₂ 21% N equilibrado ₂₎ mezcla de gas durante 2 horas (Figura 2A).
2. Anestesiar al animal con inyección intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg). Perfundir el transcardially animal con PFA al 4% ^20. Manipular con guantes de uso y cuidado a una campana química.
3. Después de la perfusión, diseccionar el cerebro ²⁰ y sumergirlo en 7 ml de PFA al 4% en un tubo de 15 ml durante 48 horas a 4 ° C. A continuación, retire el cerebro de la PFA y sumergirse por completo en la solución de crioprotector. Almacenar a -18 ° C (Figura 3). Desechar el resto del cuerpo del animal por el PA de residuos de procesamiento apropiadoThway.
   Nota: crioprotección es un paso entre la fijación de PFA y la congelación. Se reduce la formación de cristales de hielo en las células con una solución cuya congelación será en forma amorfa. Las muestras fijas deben ser impregnadas en la solución crioprotectora (preparado en la etapa 1.3) durante al menos 24 horas a 4 ° C. Manipular con cuidado y guantes bajo el capó química.

3. inducción de c-fos y Tejidos de procesamiento Ex Vivo

Nota: Los experimentos se realizaron en ratas recién nacidas o ratones solamente.

1. Aislar el SNC como se describe por Suzue ^19. Colocar en una cámara de registro y superfuse continuamente con fluido cerebroespinal artificial a una velocidad de 7,5 ml / min a 26 ° C ²¹ (LCRa: en mM: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl _2, 1,0 MgCl _2, 26,0 NaHCO _3, 30,0 D-glucosa; saturada con O ₂ y se ajustó a pH 7,4 por gaseamiento con 95% O ₂ y 5% De CO ₂₎ (Figura 2B).
2. Sustituir el LCRa con un LCRa (misma composición burbujeado con 95% N ₂ y 5% de CO _2, pH 7,4) desoxigenada por hipoxia o por un LCRa acidificada (estándar LCRa con _NaHCO3 reducido a 10,0 mM, burbujeado con 95% de O ₂ y 5% de CO ₂₎ para la hipercapnia. Aplicar la estimulación de 30 min (Figura 2B).
3. Ex vivo, después de que el período de inducción, transfiera el SNC de ratones o ratas recién nacidas en 2,5 ml de PFA al 4% en un tubo de 2,5 ml durante 48 horas y se almacena a -18 ° C en una solución crioprotectora para su uso posterior (Figura 3).
   Nota: Ex vivo, no es necesario para perfundir los animales. Un estudio anterior sugiere que las pequeñas muestras que miden menos de 10 mm de diámetro puede ser fijado por simple difusión ^22. Una tasa de cotización de penetración (distancia, en mm, para la difusión fijador en el tejido) para aldehído es 2 o 3 mm / hr.

4. Tallo Cerebral Seccionamiento

Nota: A partir de este paso a la final, el protocolo es estrictamente el mismo para in vivo y ex vivo inducciones.

1. Antes de cortar, coloque un individuo bien insertar en una placa de 12 pocillos y añadir 2,5 ml de PBS en cada pocillo.
2. Hacer secciones coronales seriadas (40 micras) del tronco cerebral con un criostato y recogerlas en la placa de 12 pocillos. Para todo el tronco cerebral de adultos, que cerca de 70 rebanadas (Figura 3).
   Nota: Es posible sección de tejido de varios animales en paralelo en un plato.

5. Procedimientos inmunohistológicos (Tabla 1)

Nota: Durante todo el procedimiento, las secciones se mantienen en los insertos así.

1. Día 1 - destrucción endógena actividad de la peroxidasa, no específica bloqueo sitio de unión, y la incubación con el anticuerpo primario (Figura 4)
   1. lavarlas secciones durante 10 minutos con 0,1 M PBS a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces.
   2. Suprimir la actividad peroxidasa endógena por incubación de las secciones coronales de 30 min a TA con peróxido de hidrógeno H ₂ O _2, 3% en PBS 0,1 M (2,5 ml por pocillo).
   3. Lavar las secciones durante 10 minutos con 0,1 M PBS a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces.
   4. Bloquear el sitio de unión no específica mediante la incubación de las secciones coronales de 1 hr a RT con suero de cabra (2%) en PBST.
   5. Incubar las secciones coronales de 48 horas a 4 ° C con un anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-FOS (1: 4000, sc-52,) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%) (2,5 ml por pocillo).
2. Día 3 - incubación con el anticuerpo y el desarrollo de una reacción de color secundaria (Figura 4)
   1. Lavar las secciones durante 10 minutos con PBS 0,1 M a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces.
   2. incubar lasecciones coronales de 1 hora a TA con un anticuerpo biotinilado de cabra anti-conejo (1: 500) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%) (2,5 ml por pocillo).
      Nota: El investigador también puede utilizar un anticuerpo secundario acoplado a una sonda fluorescente en esta etapa. En este caso, detenga el protocolo en esta etapa y examinar directamente usando un microscopio de fluorescencia.
   3. Lavar las secciones durante 10 min con PBST a TA (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces.
   4. Incubar las secciones coronales de 1 hr con una avidina-biotina-peroxidasa (1: 250) en PBST (2,5 ml por pocillo).
   5. Lavar las secciones durante 10 min con PBST a TA (2,5 ml por pocillo). Repetir 2 veces.
   6. Lavar las secciones durante 10 min con 0,05 M Tris-tampón a RT (2,5 ml por pocillo). Repetir 2 veces.
   7. Incubar las secciones coronales con 0,02% tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina, sulfato de amonio níquel 0,04% y peróxido de hidrógeno 0,01% en M tampón Tris 0,05 (pH 7,6) unat RT (2,0 ml por pocillo). En la solución restante (25 ml) añadir 17 l _de H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ solución al 30% en _H2O) (2,0 ml por pocillo).
      Nota: El investigador debe determinar los tiempos de desarrollo bajo microscopio de luz. Sin embargo, de 5 a 10 minutos proporciona una buena intensidad de la tinción.
   8. Cuando la intensidad de la tinción es óptima (controlada bajo microscopio de luz, véase la Figura 5 y la Figura 6), se detiene la reacción por lavado de las secciones durante 10 minutos con PBS 0,1 M a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 4 veces. A continuación, lavar las secciones con agua destilada.
3. Muestreo de montaje (manejar con cuidado y guantes bajo el capó química)
   1. secciones de montaje en serie de diapositivas y secar al aire. Para ello, se extendió cuidadosamente las secciones con el fin rostro-caudal con los cepillos en las diapositivas. etiquetar claramente las diapositivas de acuerdo a las muestras.
   2. Deshidratar con Al absolutahol: sumergir los portaobjetos durante 30 segundos a temperatura ambiente en un baño de alcohol absoluto. Repetir dos veces.
   3. Claro con xileno: sumergir los portaobjetos en baño de xileno durante 3 minutos a temperatura ambiente. Repetir dos veces.
   4. Cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje. Para ello, aplicar 5 gotas de medio de montaje de la diapositiva y luego aplicar el cristal de la cubierta por la expulsión de las burbujas de aire. Deje secar al aire durante 48 horas.

6. datos y análisis estadístico

1. Examinar secciones bajo un microscopio de luz. Contar visualmente neuronas FLI a gran aumento (200x) utilizando puntos de referencia estándar de ^23,24. La tinción puntiforme c-Fos se localiza en los núcleos de neuronas.
2. Para cada área analizada, contar el número de células c-fos-positivo por sección y comparar el número promedio entre las condiciones de control y estimulados. Dependiendo de la normalidad de los datos, usar la prueba t de Student para datos independientes o la prueba de Mann-Whitney. Las diferencias se consideraron significativas si P0; 0,05. Trazar la distribución de las neuronas FLI en un dibujo (100 aumentos) utilizando un tubo dibujo adjunto al microscopio y se fotografiaron con una cámara digital (Figura 5).

Resultados

La detección de c-fos es una herramienta útil que permite la identificación de grupos de células activadas en condiciones específicas, tales como la hipoxia e hipercapnia vivo (Figura 2A) en o en situaciones que imitan estas condiciones ex vivo (Figura 2 B). En vivo, recién nacido, joven , o roedores adultos se colocaron en una caja hermética en que el medio gaseoso es continuamente renovada por una mezcla de ga...

Discusión

C-fos es un gen temprano inmediato, y la detección de su producto, la proteína c-FOS, se utiliza clásicamente para identificar poblaciones neuronales implicados en las respuestas respiratorias específicas in vivo y ex vivo ^{11,13,25,28 16-18, 27,32,33.}

Los pasos críticos dentro del protocolo

Tenga cuidado durante la etapa de perfusión. La solución PFA 4% debe estar bien prep...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture plate 12-well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153