La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Riepilogo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Abstract

Molti studi cercano di identificare e mappare le regioni del cervello coinvolte nella specifica normativa fisiologici. I c-fos proto-oncogene, un gene precoce immediato, è espressa nei neuroni in risposta a vari stimoli. Il prodotto proteina può essere facilmente rilevata con tecniche immunoistochimiche volti all'utilizzo di rilevamento c-FOS mappare gruppi di neuroni che mostrano cambiamenti nella loro attività. In questo articolo, ci siamo concentrati sull'individuazione di tronco cerebrale neuronale popolazioni coinvolte nell'adattamento ventilatoria all'ipossia o ipercapnia. Due approcci sono stati descritti per identificare popolazioni neuronali coinvolte in vivo negli animali e ex vivo nelle preparazioni del tronco deafferented. In vivo, gli animali sono stati esposti a miscele di gas ipercapnici o ipossia. Ex vivo, i preparativi sono stati deafferented superfused con ipossia o liquido cerebrospinale artificiale ipercapnica. In entrambi i casi, sia il controllo in animali in vivo o ex vivo i preparativi sono stati mantenuti in condizioni normossiche e normocapnica. Il confronto di questi due approcci permette di determinare l'origine del cioè attivazione neuronale, periferica e / o centrale. In vivo ed ex vivo, sono stati raccolti brainstems, fissi, e tagliati in sezioni. Una volta che le sezioni sono state preparate, rilevazione immunoistochimica della proteina c-FOS è stato fatto per identificare i gruppi tronco di cellule attivate da stimoli ipossici o ipercapnici. cellule marcate sono state contate in strutture respiratori del tronco cerebrale. Rispetto alla condizione di controllo, ipossia o ipercapnia aumentato il numero di cellule marcate c-FOS in diversi siti del tronco specifici che sono in tal modo costitutiva dei percorsi neuronali coinvolti nella adattamento del drive respiratorio centrale.

Introduzione

Il gene fos c- è stato identificato per la prima volta all'inizio del 1980 ^1,2 e il suo prodotto è stato caratterizzato nel 1984 come una proteina nucleare avente proprietà gene-attivatore ^3,4. Partecipa a meccanismi a lungo termine associati con la stimolazione dei neuroni. Infatti, cambiamenti nell'attività neuronale portano a seconda cascata di segnalazione messaggero che inducono l'espressione dei geni immediati precoce c-fos, che induce la produzione del fattore di trascrizione c-FOS. Quest'ultima avvia l'espressione dei geni tardivi e partecipa quindi in risposta adattativa del sistema nervoso a diversi tipi di stimoli ^4. Così, dalla fine del 1980 ^5,6, rilevamento proteina c-fos è stato frequentemente utilizzato per studiare gli effetti di fattori esogeni sulla trascrizione genica in generale ⁴ e sull'attività del sistema nervoso centrale (CNS) per mappatura percorsi neuronali coinvolti in diversi fisiologicacondizioni al.

Basale c-fos espressione è stata studiata in varie specie, tra cui topi, ratti, gatti, scimmie, e umano ^4. In tal modo, la cinetica della sua espressione è relativamente ben nota. L'attivazione della trascrizione è rapido (da 5 a 20 min) ^7,8, e l'accumulo di mRNA raggiunge un massimo tra 30 e 45 minuti dopo l'inizio della stimolazione ⁹ e diminuisce con una breve emivita di 12 min. La sintesi proteica c-FOS segue accumulo di mRNA e potrebbe essere rilevato mediante immunoistochimica a 20 a 90 min dopo la stimolazione ^6.

Analisi dell'espressione di c-fos è classicamente utilizzato in studi in vivo per identificare la rete dell'apparato respiratorio coinvolti nelle risposte ventilatoria all'ipossia o ipercapnia ^10-14. Più di recente, questo strumento è stato utilizzato anche in preparazioni ex vivo tronco di esplorare adattamenti rete respiratorie centrali all'ipossia o hypercapnia ^15-18. In effetti, questi preparati generano un'attività ritmica classicamente assimilata al drive respiratorio centrale ^19. Pertanto, questo tipo di preparazione ha il vantaggio di essere completamente deafferented, e quindi, i risultati riguardanti l'espressione di c-fos solo riflettono le conseguenze di una stimolazione centrale senza alcun intervento di strutture periferiche.

Il rilevamento c-FOS può essere effettuato mediante approcci immunoistochimiche o immunohistofluorescence. immunolocalizzazione indiretta richiede l'uso di un anticorpo primario contro c-FOS e un anticorpo secondario diretto contro le specie in cui è ottenuto l'anticorpo primario. Per il metodo immunoistochimica, l'anticorpo secondario è coniugato con un enzima (perossidasi, per esempio) che agisce su un substrato (H ₂ O ₂ per la perossidasi). Il prodotto della reazione enzimatica è sviluppato da un cromogeno (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobenzidinae), che colora e si osserva al microscopio ottico. La reazione potrebbe essere rafforzata con solfato di nichel ammonio. Questi metodi consentono il rilevamento di attivi neuroni durante diverse sfide fisiologici e quindi l'identificazione e / o la mappatura dei percorsi periferiche e centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche consecutivi.

Protocollo

Nota: rilevamento c-FOS è una procedura standardizzata coinvolge diversi passaggi (Figura 1). Tutti gli esperimenti sono stati condotti su ratti o topi. protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Etico in esperimenti su animali Charles Darwin (CE5 / 2011/05), fatta in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 22 Settembre 2010 (2010/63 / UE) per la cura degli animali, e condotte in conformità con le leggi francesi per la cura degli animali.

1. preparazione di soluzioni

1. Preparare tampone fosfato 0.2 M di sodio: aggiungere 6,24 g di NaH ₂ PO ₄ * 2H ₂ O e 22.56 g di Na ₂ HPO ₄ * H ₂ O a 1 L di acqua distillata e mescolare.
2. Preparare 4% paraformaldeide (PFA): aggiungere 20 g di PFA a 150 ml di acqua distillata. Riscaldare la soluzione a 80 ° C sotto agitazione. Per cancellare la soluzione, abbassare la fiamma e aggiungere 1 o 2 gocce di 1 N NaOH per aiutare la paraformaldeide sciogliere. Completa per 250 mlcon acqua distillata ed aggiungere 250 ml di 0,2 M tampone fosfato (pH 7,4). Conservare a 4 ° C. Fare attenzione appropriata quando si utilizzano questi reagenti. Maneggiare con guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza sotto una cappa chimica.
   Nota: Preparare 4% PFA, il giorno prima delle perfusioni. Determinare il volume del 4% PFA in funzione dell'età, numero e specie di animali.
3. Preparare la soluzione crioprotettiva: In 250 ml di 0,2 M tampone fosfato salino, mescolare 5 g di polivinil-pirrolidone, 150 g di saccarosio e 2,5 g di cloruro di sodio. Dopo completa dissoluzione, aggiungere 150 ml di glicole etilenico e regolare a 500 ml con acqua distillata. Conservare la soluzione crioprotettiva a 4 ° C.
4. Preparare 0,1 M tampone fosfato salino (PBS): aggiungere 18 g di NaCl all'acqua distillata 1 L agitando. Dopo completa dissoluzione, aggiungere 1 L 0,2 M di tampone fosfato di sodio.
5. Preparare tampone fosfato isotonico integrato con 0,3% Triton X100 (PBST): Aggiungere 3 ml di Triton X10Da 0 a 997 ml di PBS.
6. Preparare 0,05 M Tris-Buffer (pH 7,6): aggiungere 3,03 g di Tris-cloridrato e 0,70 g Tris-base per 500 ml di acqua distillata e mescolare.
7. Preparare 2% di siero di capra in PBST: per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 600 ml di siero di capra al 30 ml di PBST e mescolare bene. Aggiungere 2,5 ml per pozzetto.
   Nota: Il siero utilizzato deve provenire da specie utilizzate per la produzione di anticorpi secondaria
8. Preparare coniglio anticorpo policlonale contro la proteina c-FOS (1: 4000, sc-52) in PBST con albumina sierica bovina (0,25%). Per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 75 mg di albumina di siero bovino a 30 ml di PBST e mescolare bene. Quindi, aggiungere 7,5 ml di anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina c-FOS.
9. Preparare biotinilato anticorpi di capra anti-coniglio (1: 500) in PBST con albumina di siero bovino (0,25%). Per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 75 mg di albumina di siero bovino a 30 ml di PBST e mescolare bene. Poi aggiungi60 ml di capra biotinilato anticorpo anti-coniglio.
10. Preparare avidina-biotina-perossidasi (1: 250) in PBST (soluzione ABC). Per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 120 ml di reagente A e 120 ml di reagente B a 30 ml di PBST e mescolare bene.
    Nota: soluzione ABC deve essere preparata almeno 30 minuti prima dell'uso.
11. Preparare la soluzione di substrato. Immediatamente prima dell'uso, preparare la soluzione come segue (per una piastra): aggiungere 20 mg di nichel solfato di ammonio e 10 mg di 3,3-diamminobenzidina tetraidrocloruro a 50 ml di Tris-Buffer. Filtrare e proteggere dalla luce. Aggiungere 2,0 ml per pozzetto. Nella soluzione rimanente (25 ml) aggiungere 17 ml di H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ soluzione 30% in H ₂ O). Aggiungere 2,0 ml per pozzetto.
    Nota: E 'necessario prestare attenzione quando si utilizza questi reagenti. Maneggiare con guanti e camici.

2. c-fos Induction e lavorazione dei tessuti In Vivo

Nota: Gli esperimenti sono stati condotti su ratti Sprague Dawley () o topi (C57BL / 6).

1. Posizionare gli animali in un vano ermetico ventilato con una ipossica (O ₂ 8% N equilibrata ₂₎ o ipercapnica (CO ₂ 4%, O ₂ 21% N equilibrata ₂₎ miscela per 2 ore (Figura 2A).
2. Anestetizzare l'animale con iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100 mg / kg). Profumato il transcardially animale con 4% PFA ^20. Maneggiare con guanti per la cura e l'uso sotto una cappa chimica.
3. Dopo perfusione, sezionare il cervello ²⁰ ed immergerlo in 7 ml di 4% PFA in una provetta da 15 ml per 48 ore a 4 ° C. Quindi rimuovere il cervello da PFA e immergerlo completamente nella soluzione crioprotettiva. Conservare a -18 ° C (figura 3). Smaltire il resto del corpo dell'animale da parte del pa di trattamento dei rifiuti adeguatothway.
   Nota: crioprotezione è un passo tra il PFA la fissazione e il congelamento. Si riduce la formazione di cristalli di ghiaccio in cellule con una soluzione di congelamento cui sarà in forma amorfa. I campioni fissi devono essere impregnate nella soluzione crioprotettiva (preparato al punto 1.3) per almeno 24 ore a 4 ° C. Maneggiare con cura e guanti sotto cappa chimica.

3. c-fos induzione e Tissue Processing Ex Vivo

Nota: Gli esperimenti sono stati condotti nel ratto appena nati o topi solo.

1. Isolare il CNS come descritto da Suzue ^19. Mettere in una camera di registrazione e superfuse continuamente con fluido cerebro-spinale artificiale ad una velocità di 7,5 ml / min a 26 ° C ²¹ (aCSF: in mM: 130,0 NaCl, 5.4 KCl, 0,8 CaCl _2, 1.0 MgCl _2, 26,0 NaHCO _3, 30.0 D-glucosio; saturo di O ₂ e regolato a pH 7,4 con il gas con 95% O ₂ e 5% CO ₂₎ (Figura 2B).
2. Sostituire il aCSF con deossigenato aCSF (stessa composizione gorgogliare con il 95% N ₂ e 5% CO _2, pH 7,4) per ipossia o da un aCSF acidificato (standard aCSF con NaHCO ₃ ridotto a 10,0 mM, bollito con 95% O ₂ e 5% di CO ₂₎ per ipercapnia. Applicare la stimolazione per 30 min (Figura 2B).
3. Ex vivo, dopo il periodo di induzione, trasferire il SNC di topi neonati o ratti in 2.5 ml di 4% PFA in una provetta da 2,5 ml per 48 ore e conservare a -18 ° C in una soluzione crioprotettiva per un uso successivo (Figura 3).
   Nota: ex vivo, non è necessario perfusione animali. Un precedente studio suggerisce che i piccoli campioni di misura inferiore a 10 mm di diametro può essere fissata per semplice diffusione ^22. Un tasso di penetrazione indicata (distanza, in mm, per la diffusione fissativo nel tessuto) per l'aldeide è 2 o 3 mm / hr.

4. Brainstem sezionamento

Nota: Da questo punto alla fine, il protocollo è strettamente lo stesso in vivo ed ex vivo induzioni.

1. Prima di affettare, collocare un individuo ben inserire in un 12-pozzetti e aggiungere 2,5 ml di PBS in ogni pozzetto.
2. Rendere seriali sezioni coronali (40 micron) del tronco cerebrale con un criostato e raccoglierli in 12-pozzetti. Per l'intero tronco cerebrale adulta, fare circa 70 fette (Figura 3).
   Nota: È possibile tessuti sezione da diversi animali in parallelo in una piastra.

5. Procedure immunoistologiche (Tabella 1)

Nota: Durante la procedura, le sezioni rimangono negli inserti pure.

1. Giorno 1 - endogena distruzione perossidasi, non specifico sito di legame blocco, e l'incubazione con l'anticorpo primario (figura 4)
   1. lavaggiole sezioni per 10 minuti con 0,1 M PBS a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte.
   2. Sopprimere l'attività perossidasica endogena incubando le sezioni coronali di 30 minuti a temperatura ambiente con acqua ossigenata H ₂ O _2, 3% in PBS 0,1 M (2,5 ml per pozzetto).
   3. Lavare le sezioni per 10 minuti con 0,1 M PBS a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte.
   4. Bloccare il sito di legame non specifico incubando le sezioni coronali per 1 ora a RT con siero di capra (2%) in PBST.
   5. Incubare le sezioni coronali di 48 ore a 4 ° C con un anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina c-FOS (1: 4000, sc-52,) in PBST con albumina sierica bovina (0,25%) (2,5 ml per pozzetto).
2. Day 3 - incubazione con l'anticorpo e lo sviluppo di una reazione colore secondario (figura 4)
   1. Lavare le sezioni per 10 minuti con PBS 0,1 M a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte.
   2. incubare ilSezioni coronali per 1 ora a RT con un anticorpo biotinilato di capra anti-coniglio (1: 500) in PBST con albumina sierica bovina (0,25%) (2,5 ml per pozzetto).
      Nota: L'investigatore può anche utilizzare un anticorpo secondario accoppiato ad una sonda fluorescente in questa fase. In questo caso, interrompere il protocollo in questa fase ed esaminare direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza.
   3. Lavare le sezioni per 10 min con PBST a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte.
   4. Incubare le sezioni coronali per 1 ora con avidina-biotina-perossidasi (1: 250) in PBST (2,5 ml per pozzetto).
   5. Lavare le sezioni per 10 min con PBST a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 2 volte.
   6. Lavare le sezioni per 10 min con 0,05 M Tris-Buffer a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 2 volte.
   7. Incubare le sezioni coronali con 0,02% tetraidrocloride 3,3-diaminobenzidina, 0,04% solfato di nichel ammonio e perossido di idrogeno 0,01% in 0,05 M Tris-tampone (pH 7,6) at RT (2,0 ml per bene). Nella soluzione rimanente (25 ml) aggiungere 17 ml _di H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ soluzione 30% in H ₂ O) (2,0 ml per pozzetto).
      Nota: L'investigatore deve stabilire i tempi di sviluppo sotto microscopio ottico. Tuttavia, da 5 a 10 minuti fornisce buona intensità di colorazione.
   8. Quando intensità di colorazione è ottimale (controllata al microscopio luce, vedi Figura 5 e Figura 6), arrestare la reazione lavando sezioni per 10 minuti con 0,1 M PBS a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripeti 4 volte. Poi, lavare sezioni con acqua distillata.
3. Campionamento di montaggio (maneggiare con cura e guanti sotto cappa chimica)
   1. sezioni di montaggio in serie di diapositive e asciugare all'aria. Per questo, si sviluppa con attenzione le sezioni in modo rostro-caudale con spazzole su diapositive. Chiaramente etichettare i vetrini secondo i campioni.
   2. Disidratare con al assolutacohol: immergere i vetrini per 30 secondi a temperatura ambiente in bagno d'alcol assoluto. Ripetere due volte.
   3. Trasparente con xilene: immergere le diapositive in bagno xilene per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere due volte.
   4. Coprioggetti i vetrini con mezzo di montaggio. Per questo, applicare 5 gocce di mezzo di montaggio sul vetrino e quindi applicare il vetro di copertura guidando le bolle d'aria. Asciugare per 48 ore.

6. I dati e l'analisi statistica

1. Esaminare sezioni sotto un microscopio ottico. Visivamente contare i neuroni FLI ad alto ingrandimento (200x) utilizzando punti di riferimento standard di ^23,24. Il puntiforme colorazione c-Fos è localizzata nei nuclei di neuroni.
2. Per ogni area analizzata, contare il numero di cellule c-FOS-positive per sezione e confrontare il numero medio tra le condizioni di controllo e stimolati. Secondo la normalità dei dati, utilizzare il test t di Student per dati non appaiati o test di Mann-Whitney. Le differenze sono state considerate significative se P0; 0,05. Tracciare la distribuzione dei neuroni FLI su un disegno (ingrandimento 100x) utilizzando un tubo disegno allegato al microscopio e fotografato con una fotocamera digitale (Figura 5).

Risultati

Il rilevamento c-FOS è un utile strumento che consente a gruppi identificativi di cellule attivate in condizioni specifiche come ipossia e ipercapnia in vivo (Figura 2A) o in situazioni che imitano queste condizioni ex vivo (Figura 2B). In vivo, neonato, giovane o roditori adulti sono stati posti in un contenitore ermetico in cui l'ambiente gassoso viene continuamente rinnovata da una miscela di gas con una composizione de...

Discussione

C-fos è un gene precoce immediato, e il rilevamento del suo prodotto, la proteina c-FOS, viene classicamente utilizzati per identificare popolazioni neuronali coinvolti nelle risposte respiratorie specifici in vivo ed ex vivo ^{11,13,25,28 16-18, 27,32,33.}

I passaggi critici all'interno del protocollo

Fare attenzione durante la fase di perfusione. La soluzione PFA 4% deve esser...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture plate 12-well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153