La protéine c-FOS détection immunohistologique: Un outil utile comme marqueur des voies centrales impliquées dans les réponses physiologiques spécifiques<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; Ex Vivo</em

Résumé

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Résumé

De nombreuses études cherchent à identifier et cartographier les régions du cerveau impliquées dans les règlements physiologiques spécifiques. Les c-fos proto-oncogène, un gène précoce immédiat, est exprimé dans les neurones en réponse à divers stimuli. Le produit protéique peut être facilement détectée par des techniques d'immunohistochimie conduisant à l'utilisation de la détection c-FOS pour cartographier des groupes de neurones qui affichent des changements dans leur activité. Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur l'identification des populations du tronc cérébral neuronales impliquées dans l'adaptation ventilatoire à l'hypoxie ou hypercapnie. Deux approches ont été décrites pour identifier les populations neuronales impliquées in vivo chez l' animal et ex vivo dans les préparations du tronc cérébral déafférenté. In vivo, les animaux ont été exposés à des mélanges de gaz hypercapniques ou hypoxiques. Ex vivo, les préparations déafférenté ont été perfusées avec hypoxiques ou liquide céphalo - rachidien artificiel hypercapnique. Dans les deux cas, soit le contrôle des animaux in vivo ou ex vivo préparations ont été maintenues dans des conditions normoxiques et normocapnie. La comparaison de ces deux méthodes permettent la détermination de l'origine de l'activation neuronale ie, périphérique et / ou central. In vivo et ex vivo, tronc cérébral ont été prélevés, fixés et découpés en sections. Une fois que les sections ont été préparées, la détection immunohistochimique de la protéine c-FOS a été faite afin d'identifier les groupes de cellules activées tronc cérébral par des stimulations hypoxiques ou hypercapnie. Les cellules marquées ont été comptées dans les structures respiratoires du tronc cérébral. Par rapport à la condition de contrôle, l'hypoxie ou hypercapnie augmenté le nombre de cellules marquées c-fos dans plusieurs sites du tronc cérébral spécifiques qui sont donc constitutive des voies neuronales impliquées dans l'adaptation de l'entraînement respiratoire centrale.

Introduction

Le gène fos c- a été identifié pour la première fois au début de 1980 ^1,2 et son produit a été caractérisé en 1984 comme une protéine nucléaire ayant des propriétés gène activateur ^3,4. Elle participe à des mécanismes à long terme associés à la stimulation des neurones. En effet, les variations de l' activité neuronale conduisent à des seconds messagers de signalisation en cascade qui induisent l'expression du gène précoce immédiat c-fos, ce qui induit la production du facteur de transcription c-fos. Ce dernier initie l'expression des gènes tardifs et participe ainsi à des réponses adaptatives du système nerveux à différents types de stimuli ^4. Ainsi, depuis la fin de 1,980 ^5,6, la détection de la protéine c-fos a été fréquemment utilisé pour étudier les effets de facteurs exogènes sur la transcription des gènes en général ⁴ et sur ​​l'activité du système nerveux central (SNC) pour cartographier les voies neuronales impliqués dans différents physiologiqueles conditions al.

Expression de c-fos Basal a été étudié dans diverses espèces , y compris les souris, le rat, le chat, le singe, et humain ^4. De ce fait, la cinétique de l'expression est relativement bien connue. L'activation de la transcription est rapide (5 à 20 min) ^7,8, et l'accumulation d'ARNm atteint un maximum entre 30 et 45 min après le début de la stimulation ⁹ et diminue avec une courte demi-vie de 12 min. La synthèse de la protéine c-fos suite à l' accumulation de l' ARNm et peut être détectée par immunohistochimie à la stimulation post 20-90 min ^6.

Analyse de c-fos expression est classiquement utilisé dans des études in vivo pour identifier le réseau respiratoire central impliqué dans les réponses ventilatoire à l' hypoxie ou hypercapnie ^10-14. Plus récemment, cet outil a également été utilisé dans des préparations ex vivo du tronc cérébral pour explorer centrales adaptations du réseau des voies respiratoires à l' hypoxie ou hypercapnia ^15-18. En effet, ces préparations génèrent une activité rythmique classique assimilé à l'entraînement respiratoire centrale ^19. Ainsi, ce type de préparation a l'avantage d'être complètement déafférenté et, par conséquent, les résultats concernant l' expression de c-fos ne reflètent que les conséquences d'une stimulation centrale sans aucune intervention des structures périphériques.

La détection c-FOS pourrait être faite par des approches immunohistochimiques ou immunohistofluorescence. immunodétection indirect nécessite l'utilisation d'un anticorps primaire contre le c-fos et un anticorps secondaire dirigé contre l'espèce dans laquelle l'anticorps primaire a été produit. Pour la méthode immunohistochimique, l'anticorps secondaire est conjugué à une enzyme (peroxydase, par exemple) qui agit sur ​​un substrat (H ₂ O ₂ pour la peroxydase). Le produit de la réaction enzymatique est développée par un chromogène (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride), qui colore et on peut l'observer en microscopie optique. La réaction pourrait être renforcé en utilisant du sulfate de nickel d'ammonium. Ces méthodes permettent la détection des neurones actif au cours des différentes difficultés physiologiques et donc l'identification et / ou la mise en correspondance des voies périphériques et centraux impliqués dans les réponses physiologiques consécutifs.

Protocole

Remarque: la détection c-FOS est une procédure normalisée comportant plusieurs étapes (figure 1). Toutes les expériences ont été réalisées sur des rats ou des souris. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d'éthique de l'expérience animale Charles Darwin (CE5 / 2011/05), fait conformément aux Communautés européennes Directive du Conseil du 22 Septembre, 2010 (2010/63 / UE) pour les soins aux animaux, et conduites en accord avec les lois françaises pour les soins aux animaux.

1. Préparation des solutions

1. Préparer un tampon de phosphate de sodium 0,2 M: ajouter 6,24 g de NaH ₂ PO ₄ * 2H ₂ O et 22,56 g de Na ₂ HPO ₄ * H ₂ O pour 1 litre d' eau distillée tout en agitant.
2. Préparer 4% paraformaldéhyde (PFA): ajouter 20 g de PFA à 150 ml d'eau distillée. Chauffer la solution à 80 ° C tout en agitant. Pour effacer la solution, réduire le feu et ajouter 1 ou 2 gouttes de 1 N NaOH pour aider le paraformaldehyde dissoudre. Complète à 250 mLavec de l'eau distillée et on ajoute 250 ml de 0,2 M de tampon phosphate (pH 7,4). Conserver à 4 ° C. Prendre les mesures adéquates pour l'utilisation de ces réactifs. Manipuler avec des gants, une blouse de laboratoire, et des lunettes de sécurité sous une hotte chimique.
   Note: Préparer 4% PFA le jour avant que les perfusions. Déterminer le volume de PFA à 4% en fonction de l'âge, le nombre et les espèces d'animaux.
3. Préparer une solution cryoprotectrice: Dans 250 ml de 0,2 M de tampon phosphate salin, mélanger 5 g de polyvinylpyrrolidone, 150 g de saccharose et 2,5 g de chlorure de sodium. Après dissolution complète, ajouter 150 ml d'éthylène glycol et d'ajuster à 500 ml avec de l'eau distillée. Conserver la solution cryoprotectrice à 4 ° C.
4. Préparer 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS): ajouter 18 g de NaCl dans l'eau distillée 1 litre sous agitation. Après dissolution complète, ajouter 1 L 0,2 M de tampon de phosphate de sodium.
5. Préparer Phosphate Buffered Saline complété avec 0,3% de Triton X100 (PBST): Ajouter 3 ml de Triton X100 à 997 ml de PBS.
6. Préparer 0,05 M de tampon Tris (pH 7,6): ajouter 3,03 g de chlorhydrate de Tris et 0,70 g de Tris base dans 500 ml d'eau distillée tout en agitant.
7. Préparer le sérum de chèvre 2% dans PBST: pour une plaque, de préparer 30 ml de solution. Ajouter 600 pi de sérum de chèvre à 30 ml de PBST et bien mélanger. Ajouter 2,5 ml par puits.
   Remarque: Le sérum utilisé doit provenir d'espèces utilisées pour la production d'anticorps secondaire
8. Préparation de l'anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la protéine c-fos (1: 4000, sc-52) dans du PBST avec de l'albumine de sérum bovin (0,25%). Pour une plaque, de préparer 30 ml de solution. Ajouter 75 mg de sérum-albumine bovine à 30 ml de PBST et bien mélanger. Puis, ajouter 7,5 ul de l'anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la protéine c-fos.
9. Préparer chèvre biotinylé anticorps anti-lapin (1: 500) dans du PBST avec de l'albumine sérique bovine (0,25%). Pour une plaque, de préparer 30 ml de solution. Ajouter 75 mg de sérum-albumine bovine à 30 ml de PBST et bien mélanger. Puis ajouter60 pi de chèvre biotinylé anticorps anti-lapin.
10. Préparer avidine-biotine-peroxydase complexe (1: 250) dans PBST (solution ABC). Pour une plaque, de préparer 30 ml de solution. Ajouter 120 ul de réactif A et 120 ul de réactif B à 30 ml de PBST et bien mélanger.
    Remarque: la solution ABC doit être préparé au moins 30 min avant utilisation.
11. Préparer la solution de substrat. Immédiatement avant utilisation, préparer la solution de la manière suivante (pour une assiette): ajouter 20 mg de sulfate d'ammonium de nickel et de 10 mg de 3,3-diaminobenzidine à 50 ml de tampon Tris. Filtrer et protéger de la lumière. Ajouter 2,0 ml par puits. Dans la solution restante (25 ml) , ajouter 17 pl de H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ à 30% en H ₂ O). Ajouter 2,0 ml par puits.
    Remarque: Des soins appropriés doivent être prises lors de l'utilisation de ces réactifs. Manipuler avec des gants et des blouses de laboratoire.

2. c-fos Induction et traitement des tissus in vivo

Nota: Les expériences ont été réalisées chez des rats (Sprague-Dawley) ou des souris (C57BL / 6).

1. Placer les animaux dans une boîte étanche à l' air ventilé avec un hypoxique (O ₂ 8% équilibré N ₂₎ ou hypercapnie (CO ₂ à 4%, O ₂ 21% équilibré N ₂₎ mélange gazeux pendant 2 h (figure 2A).
2. Anesthésier l'animal avec une injection intraperitoneale de pentobarbital (100 mg / kg). Perfuser l'transcardiaque animal avec 4% PFA ^20. Manipuler avec précaution et utiliser des gants sous une hotte chimique.
3. Après perfusion, disséquer le cerveau ²⁰ et le plonger dans 7 ml de 4% PFA dans un tube de 15 ml pendant 48 heures à 4 ° C. Ensuite, retirer le cerveau de PFA et le plonger complètement dans la solution cryoprotectrice. Conserver à -18 ° C (Figure 3). Éliminer le reste du corps de l'animal par le traitement des déchets pa appropriéethway.
   Note: Cryoprotection est une étape entre PFA fixation et le gel. Il réduit la formation de cristaux de glace dans les cellules avec une solution dont la congélation sera sous forme amorphe. Les échantillons fixes doivent être imprégnés dans la solution cryoprotectrice (préparé à l'étape 1.3) pendant au moins 24 heures à 4 ° C. Manipuler avec soin et des gants sous hotte chimique.

3. c-fos induction et le traitement des tissus ex vivo

Note: Des expériences ont été réalisées chez des rats nouveau-nés ou des souris seulement.

1. Isoler le CNS comme décrit par Suzue ^19. Placer dans une chambre d'enregistrement et superfuse en continu avec du liquide céphalorachidien artificiel à un débit de 7,5 ml / min à 26 ° C ²¹ (aCSF: en mM: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 _CaCl2, 1,0 _MgCl2, 26,0 NaHCO _3, 30,0 D-glucose, saturé avec O ₂ et ajusté à pH 7,4 par gazage avec 95% O ₂ et 5% De CO ₂₎ (figure 2B).
2. Remplacer le LCRa avec un LCRa (même composition barboter avec 95% de N ₂ et 5% de CO _2, pH 7,4) désoxygénation de l' hypoxie ou par un LCRa acidifiée (standard LCRa avec _NaHCO3 réduite à 10,0 mM, du fait barboter avec 95% de O ₂ et 5% de CO ₂₎ pour l' hypercapnie. Appliquer la stimulation pendant 30 minutes (figure 2B).
3. Ex vivo, après la période d'induction, transférer le système nerveux central de souris ou de rats nouveau - nés dans 2,5 ml de PFA à 4% dans un tube de 2,5 ml , pendant 48 heures , et conserver à -18 ° C dans une solution cryoprotectrice pour une utilisation ultérieure (figure 3).
   Note: Ex vivo, il ne faut pas pour perfuser les animaux. Une précédente étude suggère que les petits spécimens mesurant moins de 10 mm de diamètre peut être fixé par simple diffusion ^22. Un taux de pénétration cité (distance, en millimètres, pour la diffusion fixatif dans le tissu) pour l'aldéhyde est égal à 2 ou 3 mm / h.

4. Brainstem Sectionnement

Remarque: A partir de cette étape à la fin, le protocole est strictement la même in vivo et ex vivo inductions.

1. Avant de trancher, placez un individu bien insérer dans une plaque de 12 puits et ajouter 2,5 ml de PBS dans chaque puits.
2. Faire des coupes coronales série (40 um) du tronc cérébral avec un cryostat et les recueillir dans la plaque de 12 puits. Pour le tronc cérébral adulte, faire environ 70 tranches (figure 3).
   Remarque: Il est possible de la section des tissus de plusieurs animaux en parallèle dans une plaque.

5. Les procédures immunohistologiques (tableau 1)

Remarque: Au cours de la procédure, les sections restent dans les inserts de puits.

1. Jour 1 - La destruction endogène d' une activité peroxydasique, le site blocage de liaison non spécifique, et l' incubation avec l'anticorps primaire (figure 4)
   1. lavageles sections pendant 10 minutes avec du PBS 0,1 M à la température ambiante (2,5 ml par puits). Répétez 3 fois.
   2. Inhiber l'activité de peroxydase endogène par incubation des coupes coronales de 30 min à température ambiante avec du peroxyde d'hydrogène H ₂ O _2, de 3% en PBS 0,1 M (2,5 ml par puits).
   3. Laver les sections pendant 10 minutes avec du PBS 0,1 M à la température ambiante (2,5 ml par puits). Répétez 3 fois.
   4. Bloquer le site de liaison non spécifique par incubation des coupes coronales pendant 1 heure à température ambiante avec du sérum de chèvre (2%) dans du PBST.
   5. Incuber les coupes coronales de 48 heures à 4 ° C avec un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la protéine c-fos (1: 4000, sc-52) dans du PBST avec de l'albumine de sérum bovin (0,25%) (2,5 ml par puits).
2. Jour 3 - L' incubation avec l' anticorps secondaire et le développement d'une réaction colorée (figure 4)
   1. Laver les coupes pendant 10 minutes avec du PBS 0,1 M à la température ambiante (2,5 ml par puits). Répétez 3 fois.
   2. incuber lacoupes coronales pendant 1 heure à température ambiante avec un anticorps de chèvre biotinylé anti-lapin (1: 500) dans du PBST avec de l'albumine de sérum bovin (0,25%) (2,5 ml par puits).
      Note: L'enquêteur peut également utiliser un anticorps secondaire couplé à une sonde fluorescente à ce stade. Dans ce cas, arrêtez le protocole à ce stade et d'examiner directement en utilisant un microscope à fluorescence.
   3. Laver les coupes pendant 10 minutes avec du PBST à la température ambiante (2,5 ml par puits). Répétez 3 fois.
   4. Incuber les coupes coronales pendant 1 heure avec un complexe avidine-biotine-peroxydase du complexe (1: 250) dans du PBST (2,5 ml par puits).
   5. Laver les coupes pendant 10 minutes avec du PBST à la température ambiante (2,5 ml par puits). Répétez 2 fois.
   6. Laver les sections pendant 10 minutes avec 0,05 M de tampon Tris à la température ambiante (2,5 ml par puits). Répétez 2 fois.
   7. Incuber les coupes coronales avec 0,02% de tétrachlorhydrate de 3,3-diaminobenzidine, 0,04% de sulfate d'ammonium de nickel et 0,01% de peroxyde d'hydrogène dans 0,05 M de tampon Tris (pH 7,6) at RT (2,0 ml par puits). Dans la solution restante (25 ml) , ajouter 17 ul de H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ à 30% en H ₂ O) (2,0 ml par puits).
      Note: L'enquêteur doit déterminer les temps de développement au microscope optique. Cependant, 5 à 10 min fournit une bonne intensité de coloration.
   8. Lorsque l' intensité de coloration est optimale (contrôlée au microscope optique, voir la figure 5 et la figure 6), arrêter la réaction en lavant les sections pendant 10 minutes avec 0,1 M de PBS à la température ambiante (2,5 ml par puits). Répétez 4 fois. Ensuite, lavez les sections avec de l'eau distillée.
3. Échantillonnage de montage (manipuler avec soin et des gants sous le capot chimique)
   1. sections de montage en série sur des lames et l'air sec. Pour cela, écartez avec précaution les sections pour rostro-caudale avec des brosses sur les lames. étiqueter clairement les diapositives selon les échantillons.
   2. Déshydrater avec al absolueCohol: immerger les lames pendant 30 secondes à la température ambiante dans un bain d'alcool absolu. Répéter deux fois.
   3. Effacer avec du xylène: immerger les lames dans un bain de xylène pendant 3 min à température ambiante. Répéter deux fois.
   4. Coverslip les lames avec un milieu de montage. Pour cela, appliquez 5 gouttes de milieu de montage sur la lame puis appliquer le couvercle en verre en chassant les bulles d'air. Sécher à l'air pendant 48 heures.

6. Les données et l'analyse statistique

1. Examiner les sections sous un microscope optique. Visuellement compter les neurones FLI à fort grossissement (200x) en utilisant des repères standards ^23,24. La coloration ponctuelle de c-Fos est localisée dans les noyaux des neurones.
2. Pour chaque zone analysée, compter le nombre de cellules c-FOS-positif par section et de comparer le nombre moyen entre les conditions de contrôle et stimulées. En fonction de la normalité des données, utilisez le test t de Student non apparié ou test de Mann-Whitney. Les différences ont été considérées comme significatives si P0, 0,05. Tracer la distribution des neurones FLI sur un dessin (grossissement 100x) en utilisant un tube de prélèvement fixée au microscope et photographiés avec un appareil photo numérique (figure 5).

Résultats

La détection c-FOS est un outil utile qui permet d' identifier des groupes de cellules activées dans des conditions spécifiques , telles que l' hypoxie et l' hypercapnie in vivo (figure 2A) ou dans des situations qui imitent ces conditions ex vivo (figure 2B). In vivo, nouveau - né, jeune ou des rongeurs adultes ont été placés dans une boîte étanche à l' air , dans lequel le milieu gazeux est continuel...

Discussion

C-fos est un gène précoce immédiat, et la détection de son produit, la protéine c-fos, sont classiquement utilisés pour identifier les populations de neurones impliqués dans la réponse des voies respiratoires spécifiques in vivo et ex vivo ^{11,13,25,28 16-18, 27,32,33.}

Étapes critiques Dans le Protocole

Soyez prudent lors de l'étape de perfusion. La solution PFA 4% d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture plate 12-well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153