A proteína c-Fos Detecção imuno: Uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Resumo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Resumo

Muitos estudos buscam identificar e mapear as regiões cerebrais envolvidas na regulamentação fisiológicas específicas. As c-fos proto-oncogene, um gene precoce imediato, é expresso em neurónios em resposta a vários estímulos. O produto proteico pode ser facilmente detectada com técnicas de imuno-histoquímica que levam à utilização de detecção de c-fos para mapear grupos de neurónios que exibem alterações na sua actividade. Neste artigo, nós nos concentramos na identificação de populações de tronco cerebral neuronal envolvidos na adaptação ventilatória à hipoxia ou hipercapnia. Duas abordagens foram descritas para identificar populações neuronais envolvidos in vivo em animais e ex vivo em preparações do tronco cerebral desaferentada. In vivo, os animais foram expostos a misturas de gases hipercápnicos ou hipóxicos. Ex vivo, preparações desaferentada foram superfused com hipóxica ou fluido cerebrospinal artificial hipercápnica. Em ambos os casos, tanto em animais de controlo in vivo ou ex preparações in vivo foram mantidas sob condições de normóxia e normocápnicos. A comparação destas duas abordagens permite a determinação da origem da activação neuronal ou seja, periférica e / ou central. In vivo e ex vivo, tronco cerebral foram recolhidas, fixadas e cortado em secções. Uma vez que as secções foram preparados, a detecção imuno-histoquímica da proteína de c-fos foi feito a fim de identificar os grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos de hipoxia ou hipercapnia. As células marcadas foram contadas em estruturas respiratórios no tronco cerebral. Em comparação com a condição de controle, hipoxia ou hipercapnia aumentou o número de c-fos células marcadas em vários locais do tronco cerebral específicas que são, portanto, constitutiva dos percursos neuronais envolvidas na adaptação do impulso respiratório central.

Introdução

O gene c-fos foi identificado pela primeira vez no início de 1980 ^{a 1,2} e o seu produto foi caracterizado em 1984 como uma proteína nuclear que tem propriedades do gene activador de ^3,4. Participa em mecanismos de longo prazo associados com estimulação neuronal. Com efeito, as mudanças na actividade neuronal levar ao segundo mensageiro cascatas de sinalização que induzem a expressão do gene precoce imediato c-fos, que induz a produção do factor de transcrição de c-fos. O último inicia a expressão de genes tardios e assim participa em respostas adaptativas do sistema nervoso para muitos tipos diferentes de estímulos ^4. Assim, desde o final de 1980 ^5,6, detecção de proteína c-Fos tem sido frequentemente utilizada para estudar os efeitos de factores externos sobre a transcrição de genes, em geral, e ⁴ sobre a actividade do sistema nervoso central (CNS) para o mapeamento de vias neuronais envolvido na fisiológico diferentecondições al.

A expressão de c-fos basal foi estudado em várias espécies, incluindo ratos, ratazana, gato, macaco, humano e ^4. Assim, a cinética da sua expressão é relativamente bem conhecidos. A activação da transcrição é rápida (5 a 20 min) ^7,8, e a acumulação de ARNm atinge um máximo entre 30 e 45 min após o início da estimulação ⁹ e diminui com um semi-vida curta de 12 minutos. A síntese de proteína c-Fos seguinte acumulação de ARNm e pode ser detectado por imuno-histoquímica em 20 a 90 min após a estimulação ^6.

Análise da expressão de c-fos é classicamente usado em estudos in vivo para identificar a rede respiratório central envolvida nas respostas ventilatórios a hipoxia ou hipercapnia ^10-14. Mais recentemente, esta ferramenta também foi usado em preparações do tronco cerebral ex vivo para explorar adaptações rede respiratórias centrais à hipoxia ou hypercapnia ^15-18. Com efeito, estas preparações gerar uma atividade rítmica classicamente assimilado ao comando central da respiração ^19. Assim, este tipo de preparação tem a vantagem de ser totalmente desaferentada, e, portanto, os resultados relativos a expressão de c-fos só refletem as consequências de uma estimulação central sem qualquer intervenção de estruturas periféricas.

A detecção de c-fos podem ser feitos por métodos de imuno-histoquímica ou immunohistofluorescence. imunodetecção indirecta que requer a utilização de um anticorpo primário contra o c-Fos e um anticorpo secundário dirigido contra as espécies em que foi produzido o anticorpo primário. Para o método de imuno-histoquímica, o anticorpo secundário é conjugado com uma enzima (peroxidase de, por exemplo) que actua sobre um substrato (H ₂ O ₂ para a peroxidase). O produto da reacção enzimática é desenvolvido por um cromogénio (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobenzidinae), que cora ele e pode ser observada através de microscopia óptica. A reacção pode ser reforçado usando sulfato de níquel de amónio. Estes métodos permitem a detecção de substâncias activas neurónios durante diferentes desafios fisiológicos e, por conseguinte, a identificação e / ou o mapeamento de vias periféricas e centrais envolvidos nas respostas fisiológicas consecutivos.

Protocolo

Nota: A detecção de c-fos é um procedimento normalizado que envolve vários passos (Figura 1). Todas as experiências foram realizadas em ratos ou ratinhos. protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal Charles Darwin (CE5 / 2011/05), feito de acordo com a directiva de 22 de setembro de 2010 (2010/63 / UE) para o cuidado animal, Conselho das Comunidades Europeias e conduzida de acordo com as leis francesas para o cuidado animal.

1. Preparação de Soluções

1. Preparar tampão fosfato de sódio 0,2 M: adicionar 6,24 g de NaH ₂ PO ₄ * 2H ₂ O e 22,56 g de Na ₂ HPO ₄ * H ₂ O a 1 L de água destilada com agitação.
2. Prepare a 4% de paraformaldeído (PFA): adiciona-se 20 g de PFA a 150 ml de água destilada. Aquece-se a solução para 80 ° C enquanto se agitava. Para clarificar a solução, reduzem o calor e adicionar 1 ou 2 gotas de NaOH 1 N para ajudar a dissolver o paraf ormaldeído. Completar a 250 mlcom água destilada e adicionar 250 mL de tampão fosfato 0,2 M (pH 7,4). Armazenar a 4 ° C. Tome cuidado apropriado ao usar esses reagentes. Manusear com luvas, jaleco e óculos de segurança sob um capuz químico.
   Nota: Prepare 4% PFA no dia antes das perfusões. Determinar o volume de PFA a 4% como uma função da idade, do número e espécies de animais.
3. Preparar a solução de crioprotector: Em 250 ml de 0,2 M de solução salina tamponada com fosfato, mistura 5 g de polivinil-pirrolidona, 150 g de sacarose e 2,5 g de cloreto de sódio. Após dissolução completa, adicionar 150 ml de etileno glicol e ajustar a 500 ml com água destilada. Guardar a solução crioprotectora a 4 ° C.
4. Prepare a 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS): adicionar 18 g de NaCl para 1 L de água destilada com agitação. Após dissolução completa, adicionar 1 L de 0,2 M de tampão de fosfato de sódio.
5. Prepare salina tamponada com fosfato suplementada com 0,3% de Triton X100 (PBST): Adicionar 3 ml de Triton X100 a 997 mL de PBS.
6. Prepare 0,05 M de tampão Tris (pH 7,6): adicionar 3,03 g de Tris-cloridrato e 0,70 g de base Tris em 500 ml de água destilada, enquanto se agitava.
7. Prepare soro de cabra a 2% em PBST: para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 600 ul de soro de cabra a 30 mL de PBST e misturar bem. Adicionar 2,5 ml por poço.
   Nota: Os soros utilizados devem ser provenientes de espécies utilizadas para a produção de anticorpo secundário
8. Prepare anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de c-fos (1: 4000, SC-52) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%). Para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 75 mg de albumina de soro de bovino e 30 mL de PBST e misturar bem. Em seguida, adicionar 7,5 mL de anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de c-fos.
9. Prepare anticorpo de cabra biotinilado anti-coelho (1: 500) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%). Para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 75 mg de albumina de soro de bovino e 30 mL de PBST e misturar bem. Em seguida, adicione60 ul de anticorpo anti-coelho de cabra biotinilado.
10. Prepara-avidina-biotina peroxidase de complexo (1: 250) em PBST (solução ABC). Para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 120 ul de reagente A e 120 ul de reagente B em 30 mL de PBST e misturar bem.
    Nota: ABC solução deve ser preparada, pelo menos, 30 min antes da utilização.
11. Preparar a solução de substrato. Imediatamente antes da utilização, preparação da solução como se segue (para uma placa): adiciona-se 20 mg de sulfato de amónio de níquel e 10 mg de tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina a 50 ml de tampão Tris. Filtrar e proteger da luz. Adicionar 2,0 ml por poço. Na solução restante (25 ml) adicionar 17 ul de H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ solução a 30% em H ₂ O). Adicionar 2,0 ml por poço.
    Nota: Cuidados adequados devem ser tomados ao usar esses reagentes. Manusear com luvas e jalecos.

2. c-fos Induction e Processamento de tecido in vivo

Nota: As experiências foram realizadas em ratos (Sprague Dawley) ou ratinhos (C57BL / 6).

1. Colocar os animais numa caixa estanque ao ar ventilado com uma mistura de gás hipóxico (O ₂ 8% N equilibrada ₂₎ ou hipercápnico (CO ₂ a 4%, O ₂ 21% N equilibrada ₂₎ durante 2 h (figura 2A).
2. Anestesiar os animais com injecção intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg). Perfundir a transcardialmente animal com PFA a 4% ^20. Manusear com cuidado e use luvas sob um capuz químico.
3. Após a perfusão, dissecar o cérebro ²⁰ e mergulhá-lo em 7 ml de 4% de PFA em um tubo de 15 ml durante 48 h a 4 ° C. Em seguida, retire o cérebro de PFA e mergulhar completamente na solução de crioprotector. Armazenar a -18 ° C (Figura 3). Elimine o resto do corpo do animal pelo pa-processamento adequado de lixothway.
   Nota: crioproteção é um passo entre PFA fixação e congelamento. Isso reduz a formação de cristais de gelo nas células com uma solução cujo congelamento irá estar em forma amorfa. As amostras fixadas deve ser impregnado na solução de crioprotector (preparado no passo 1.3) durante pelo menos 24 horas a 4 ° C. Manusear com cuidado e luvas sob o capô química.

3. indução e Tissue c-fos Processamento Ex Vivo

Nota: Os experimentos foram realizados em apenas ratos ou camundongos recém-nascidos.

1. Isolar o SNC, tal como descrito por Suzue ^19. Colocá-lo numa câmara de registo e superfuse-lo continuamente com fluido cérebro-espinal artificial, a uma taxa de 7,5 ml / min a 26 ° C ²¹ (aCSF: em mM: 130.0 NaCl, 5,4 de KCl, 0,8 _{de CaCl2,} 1,0 _{de MgCl2,} 26,0 _NaHCO3, 30,0 D-glucose, saturada com _O2 e ajustada para pH 7,4 por gaseificação com 95% de _O2 e 5% De CO ₂₎ (Figura 2B).
2. Substituir o aCSF com aCSF (mesma composição borbulhado com 95% de _N2 e 5% de CO _2, pH 7,4) oxigenado por hipoxia, ou por um aCSF acidificada (padrão aCSF com _NaHCO3 reduzida para 10,0 mM, borbulhado com 95% de O ₂ e 5% de CO ₂₎ para hipercapnia. Aplicar a estimulação durante 30 min (Figura 2B).
3. Ex vivo, após o período de indução, a transferência do SNC de ratos recém-nascidos ou ratos em 2,5 ml de 4% de PFA em um tubo de 2,5 ml, durante 48 h e armazenar a -18 ° C numa solução de crioprotector a uma utilização posterior (Figura 3).
   Nota: Ex vivo, não é necessário para perfundir animais. Um estudo anterior sugere que pequenas amostras medindo menos de 10 mm de diâmetro pode ser fixado por simples difusão ^22. Uma taxa de penetração citado (distância, em mm, para a difusão fixador no tecido) para aldeído é 2 ou 3 mm / h.

4. tronco cerebral Seccionamento

Nota: A partir deste passo para o fim, o protocolo é estritamente o mesmo para induções in vivo e ex vivo.

1. Antes de cortar, colocar um poço individual inserir numa placa de 12 poços e adicionar 2,5 ml de PBS em cada poço.
2. Faça cortes coronais em série (40 pm) do tronco cerebral com um criostato e recolhê-las na placa de 12 poços. Para todo o tronco cerebral adulto, fazer cerca de 70 fatias (Figura 3).
   Nota: É possível tecido secção a partir de vários animais em paralelo em uma placa.

5. Procedimentos imuno-histológicos (Tabela 1)

Nota: Durante todo o procedimento, as secções permanecem nas inserções bem.

1. Dia 1 - destruição endógena actividade de peroxidase, local do bloqueio da ligação não-específica, e a incubação com o anticorpo primário (Figura 4)
   1. lavaras secções durante 10 min com 0,1 M de PBS à temperatura ambiente (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes.
   2. Suprimir a actividade da peroxidase endógena por incubação das secções coronais de 30 min à temperatura ambiente com peróxido de hidrogénio H ₂ O _2, 3% em PBS 0,1 M (2,5 ml por poço).
   3. Lavam-se as secções durante 10 min com 0,1 M de PBS à temperatura ambiente (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes.
   4. Bloquear o sítio de ligação não específica por incubação das secções coronais de 1 h à temperatura ambiente com soro de cabra (2%) em PBST.
   5. Incubar as secções coronais de 48 h a 4 ° C com um anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de c-fos (1: 4000, SC-52,) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%) (2,5 ml por poço).
2. Dia 3 - Incubação com anticorpo e o desenvolvimento de uma reacção de cor secundária (Figura 4)
   1. Lavam-se as secções durante 10 min com PBS 0,1 M, à TA (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes.
   2. incubar asecções coronais de 1 h à RT com um anticorpo de cabra biotinilado anti-coelho (1: 500) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%) (2,5 ml por poço).
      Nota: O investigador pode também utilizar um anticorpo secundário acoplado a uma sonda fluorescente, nesta fase. Neste caso, o protocolo de parar nesta fase e examinar directamente utilizando um microscópio de fluorescência.
   3. Lavam-se as secções durante 10 minutos com PBST à TA (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes.
   4. Incubar as secções coronais de 1 h com uma biotina-avidina-peroxidase de complexo (1: 250) em PBST (2,5 ml por poço).
   5. Lavam-se as secções durante 10 minutos com PBST à TA (2,5 ml por poço). Repita 2 vezes.
   6. Lavam-se as secções durante 10 minutos com 0,05 M de tampão Tris à TA (2,5 ml por poço). Repita 2 vezes.
   7. Incubar as secções coronais com 0,02% de tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina, sulfato de níquel de amónio a 0,04% e 0,01% de peróxido de hidrogénio em Tris-tampão 0,05 (pH 7,6) umat RT (2,0 ml por poço). Na solução restante (25 ml) adicionar 17 ul de H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ solução a 30% em _H2O) (2,0 ml por poço).
      Nota: O investigador deve determinar o tempo de desenvolvimento em microscópio de luz. No entanto, de 5 a 10 min proporciona uma boa intensidade de coloração.
   8. Quando intensidade de coloração é o ideal (controlada sob microscópio de luz, ver Figura 5 e Figura 6), parar a reacção por lavagem das secções durante 10 min com 0,1 M de PBS à temperatura ambiente (2,5 ml por poço). Repita 4 vezes. Em seguida, as secções lavar com água destilada.
3. Amostragem de montagem (manusear com cuidado e luvas sob o capô química)
   1. seções de montagem em série de slides e ar seco. Para isso, espalhou cuidadosamente as seções, a fim rostro-caudal com escovas nos slides. Identificam as lâminas de acordo com as amostras.
   2. Desidratam com al absolutacohol: mergulhe as lâminas durante 30 segundos à temperatura ambiente no banho de álcool absoluto. Repita duas vezes.
   3. Limpar com xileno: mergulhe as lâminas em banho de xileno por 3 min a RT. Repita duas vezes.
   4. Lamela as lâminas com meio de montagem. Para isso, aplique 5 gotas de meio de montagem no slide e, em seguida, aplicar a tampa de vidro por expulsar as bolhas de ar. Ar seco por 48 horas.

6. Dados e Análise Estatística

1. Examine seções sob um microscópio de luz. Visualmente contagem dos neurônios FLI em grande aumento (200x), utilizando pontos de referência padrão ^23,24. A coloração pontual de c-fos é localizada nos núcleos de neurónios.
2. Para cada zona analisada, contar o número de células de c-fos-positiva por secção e comparar o número médio entre as condições de controlo e estimuladas. Dependendo da normalidade dos dados, usar o teste t de Student desemparelhado ou o teste de Mann-Whitney. As diferenças foram consideradas significativas se P0; 0,05. Traça-se a distribuição de neurónios FLI num desenho (100x), utilizando um tubo de desenho anexado ao microscópio e fotografados com uma câmara digital (Figura 5).

Resultados

A detecção de c-fos é uma ferramenta útil que permite que os grupos de identificação de células activadas sob condições específicas, tais como a hipoxia e hipercapnia in vivo (Figura 2A) ou em situações que mimetizam estas condições ex vivo (Figura 2B). In vivo, o recém-nascido, jovem ou roedores adultos foram colocados numa caixa estanque ao ar, em que o meio gasoso é continuamente renovada por uma mistura gaso...

Discussão

C-fos é um gene precoce imediato, e a detecção do seu produto, a proteína c-Fos, é classicamente usado para identificar populações neuronais envolvidas em respostas respiratórias específicas in vivo e ex vivo ^{11,13,25,28 16-18, 27,32,33.}

Passos críticos dentro do protocolo

Tenha cuidado durante a etapa de perfusão. A solução PFA 4% deve ser bem preparado e os passos d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture plate 12-well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153