חלבון C-FOS איתור immunohistological: כלי שימושי כסמן של מסלולים מרכזיים המעורבים בתגובות פיסיולוגיות ספציפיות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; Ex Vivo</em

Summary

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Abstract

מחקרים רבים מבקשים לזהות ולמפות את אזורי המוח מעורבי תקנות פיסיולוגיות ספציפיות. The-פוס ג פרוטו-אונקוגן, גן ראשונים מיידי, מתבטא נוירונים בתגובה לגירויים שונים. מוצר החלבון ניתן לאתר בקלות עם טכניקות immunohistochemical המובילות לשימוש של זיהוי c-FOS למפה קבוצות של נוירונים המציגים שינויים בפעילותם. במאמר זה התמקדנו בזיהוי אוכלוסיות גזע המוח עצבי מעורבת הסתגלות נשימתית היפוקסיה או hypercapnia. שתי גישות תוארו לזהות אוכלוסיות נוירונים מעורבים vivo בחיות לשעבר vivo בהכנות גזע המוח deafferented. בשנת vivo, בעלי חיים שנחשפו תערובות גז hypercapnic או חוסר חמצן. גופיים, ההכנות deafferented היו superfused עם חוסר חמצן או מלאכותי הנוזל השדרתי hypercapnic. בשני המקרים, בין אם מלא בחי vivo או דוארx הכנות vivo נשמרו בתנאי normoxic ו normocapnic. ההשוואה של שתי גישות אלה מאפשר קביעת מקורם של קרי ההפעלה העצבית, היקפי ו / או מרכזי. בשנת vivo לשעבר vivo, brainstems נאספו, קבוע, ופרוסים למקטעים. לאחר סעיפים הוכנו, זיהוי immunohistochemical של חלבון C-FOS נעשה על מנת לזהות את קבוצות גזע המוח של תאים מופעלים על ידי גירויים היפוקסי או hypercapnic. תאים תווית נספרו במבנים הנשימה בגזע המוח. לשם השוואה למצב מלא, היפוקסיה או hypercapnia הגדיל את מספר תאי שכותרתו ג-FOS באתרי גזע מוח כמה הספציפיים מונחים ובכך מכוננים של המסלולים העצביים המעורבים בעיבוד של כונן הנשימה המרכזי.

Introduction

הגן פוס c- זוהה לראשונה בתחילת 1980 ^1,2 ו מוצריה התאפיין בשנת 1984 כחלבון גרעיני בעלי תכונות-מפעיל גנים ^3,4. והיא הועלתה מנגנוני לטווח ארוך הקשורים גירוי נוירון. ואכן, שינויים בפעילות עצבית להוביל מפלי שניית שליח איתות משרי הביטוי של C-FOS הגן מוקדם המיידי, אשר גורם ייצור של גורם שעתוק ג-FOS. האחרון יוזם את הביטוי של גנים מאוחר ובכך משתתף בתגובות הסתגלות של מערכת העצבים לסוגים רבים ושונים של ⁴ גירויים. לכן, מאז סוף 1980 ^5,6, זיהוי החלבון C-FOS נעשה בהם שימוש תכוף כדי לחקור את ההשפעות של הגורמים החיצוניים על שעתוק הגנים בכלל ⁴ ועל הפעילות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עבור מיפוי מסלולים עצביים מעורב פיזיולוגי שונהתנאי al.

C-FOS בסל הביטוי נחקר במינים שונים, כוללים עכברים, חולדות, חתולים, קופים, ואנושי ^4. ובכך, קינטיקה הביטוי שלה ידוע טוב יחסית. הפעלת השעתוק היא מהירה (5 עד 20 דקות) ^7,8, והצטברות mRNA מגיעה לשיא בין 30 ל -45 דקות לאחר תחילת גירוי ⁹ וירידה עם זמן מחצית חיים קצרים של 12 דקות. סינתזת חלבון C-FOS כדלקמן הצטברות mRNA ויכולה להיות מזוהית על ידי אימונוהיסטוכימיה ב 20 כדי 90 דקות פוסט גירוי ^6.

ניתוח של ביטוי c-Fos משמש קלסי במחקרי in vivo לזהות את רשת הנשימה המרכזית המעורבת בתגובות נשימתית היפוקסיה או hypercapnia ^10-14. לאחרונה, הכלי הזה שמש גם בהכנות גזע מוח vivo לשעבר לחקור עיבודי רשת נשימה מרכזיים היפוקסיה או hypercapnia ^15-18. ואכן, הכנות אלה ליצור פעילות קצבית מתבוללים קלסיים לכונן הנשימה המרכזית ^19. לכן, זה סוג של הכנה יש את היתרון של להיות deafferented לחלוטין, ולכן, תוצאות לגבי הביטוי פוס-ג רק לשקף את התוצאות של גירוי מרכזי ללא כל התערבות של מבנים היקפיים.

גילוי ג-FOS יכול להתבצע על ידי גישות immunohistochemical או immunohistofluorescence. עקיפת immunodetection מחייב שימוש נוגדן ראשוני נגד ג-FOS וכן נוגדנים משני המכוונים נגד המין שבו הנוגדן הראשוני הופק. לקבלת השיטה immunohistochemical, נוגדנים משני הוא מצומדות עם אנזים (peroxidase, למשל) שפועל על מצע (H ₂ O ₂ עבור peroxidase). המוצר של התגובה האנזימטית הוא פותח על ידי אַב צֶבַע (3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloridה), אשר מכתים אותו ניתן לראות תחת מיקרוסקופ אור. התגובה יכולה להיות מחוזקת באמצעות אמוניום סולפט ניקל. שיטות אלה מאפשרים זיהוי של נוירונים פעילים במהלך אתגרים פיסיולוגיים שונים ולכן זיהוי ו / או המיפוי של מסלולים היקפיים ומרכזי מעורב התגובות הפיזיולוגיות הרצופות.

Protocol

הערה: זיהוי c-FOS הוא הליך סטנדרטי מעורבים מספר שלבים (איור 1). כל הניסויים בוצעו על חולדות או עכברים. פרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדת אתיקת ניסויים בבעלי חי צ'רלס דרווין (Ce5 / 2011/05), נעשו בהתאם להוראת מועצת הקהילות האירופיות של 22 בספטמבר 2010 (2010/63 / EU) עבור טיפול בבעלי חיים, וכן נערכים בהתאם עם חוקים צרפתים עבור טיפול בבעלי חיים.

1. הכנת פתרונות

1. הכן 0.2 חיץ פוספט M נתרן: להוסיף 6.24 גרם לאא _{2 4} PO * 2H ₂ O ו 22.56 גרם Na ₂ HPO ₄ * H ₂ O ל L 1 מים מזוקקים תוך ערבוב.
2. הכן 4% Paraformaldehyde (PFA): להוסיף 20 גרם של PFA ל -150 מ"ל מים מזוקקים. מחממים את הפתרון 80 ° C תוך ערבוב. כדי לנקות את הפתרון, מנמיכים את האש ומוסיפים 1 או 2 טיפות של 1 N NaOH לעזור paraformaldehyde לפזר. שלם 250 מיליליטרעם מים מזוקקים ולהוסיף 250 מ"ל של חיץ פוספט 0.2 M (pH 7.4). חנות ב 4 מעלות צלזיוס. אשמור על עצמך מתאים כאשר משתמש ריאגנטים אלה. ידית עם כפפות, חלוק מעבדה, ומשקפי בטיחות מתחת למכסה המנוע כימי.
   הערה: כן PFA 4% ביום לפני perfusions. לקבוע את עוצמת הקול של 4% PFA כפונקציה של גיל, מספר מינים של בעלי חיים.
3. כן פתרון cryoprotective: בשנת 250 מיליליטר של 0.2 M פוספט שנאגר מלוח, לערבב 5 גרם של-pyrrolidone פוליוויניל, 150 גרם של סוכרוז 2.5 גרם של נתרן כלורי. לאחר פירוק מוחלט, להוסיף 150 מ"ל של אתילן גליקול ולהתאים 500 מ"ל מים מזוקקים. אחסן את הפתרון cryoprotective על 4 מעלות צלזיוס.
4. כן 0.1 M שנאגר מלוח פוספט (PBS): להוסיף 18 גרם של NaCl 1 ליטר מים מזוקקים תוך ערבוב. לאחר פירוק מוחלט, להוסיף 1 ליטר 0.2 M של חיץ פוספט נתרן.
5. הכן בופר פוספט השלימו עם 0.3% טריטון X100 (PBST): להוסיף 3 מ"ל של טריטון X100 כדי 997 מ"ל של PBS.
6. הכן 0.05 מ 'טריס חיץ (pH 7.6): להוסיף 3.03 גר' טריס-Hydrochloride ו 0.70 גרם טריס בסיס ל -500 מ"ל מים מזוקקים תוך ערבוב.
7. הכן סרום עיזים 2% ב PBST: עבור צלחת אחת, להכין 30 מ"ל של תמיסת. להוסיף 600 μl של סרום עיזים 30 מ"ל PBST ומערבבים היטב. להוסיף 2.5 מ"ל לכל טוב.
   הערה: סרום המשמש חייב לבוא ממינים המשמשים לייצור נוגדנים משני
8. הכן נוגדן polyclonal ארנב נגד החלבון C-FOS (1: 4000, SC-52) ב PBST עם אלבומין בסרום שור (0.25%). עבור צלחת אחת, להכין 30 מיליליטר של תמיסה. הוסף 75 מ"ג של אלבומין בסרום שור 30 מ"ל PBST ומערבבים היטב. לאחר מכן, להוסיף 7.5 μl של נוגדן polyclonal ארנב נגד החלבון C-FOS.
9. כן biotinylated עז נוגדנים נגד ארנב (1: 500) ב PBST עם שור אלבומין (0.25%). עבור צלחת אחת, להכין 30 מיליליטר של תמיסה. הוסף 75 מ"ג של אלבומין בסרום שור 30 מ"ל PBST ומערבבים היטב. לאחר מכן, להוסיף60 μl של נוגדן נגד ארנב עז biotinylated.
10. כן המורכב avidin ביוטין-peroxidase (1: 250) ב PBST (פתרון ABC). עבור צלחת אחת, להכין 30 מיליליטר של תמיסה. להוסיף 120 μl של ריאגנט ו -120 μl של מגיב B ל -30 מ"ל PBST ומערבבים היטב.
    הערה: פתרון ABC חייב להיות מוכן לפחות 30 דקות לפני השימוש.
11. כן פתרון מצע. מיד לפני השימוש, להכין את הפתרון כדלקמן (עבור צלחת אחת): להוסיף 20 מ"ג של אמוניום סולפט ניקל 10 מ"ג של tetrahydrochloride 3.3-diaminobenzidine 50 מ"ל טריס-חוצץ. סנן ולהגן מפני אור. להוסיף 2.0 מ"ל לכל טוב. בשנת הפתרון הנותרים (25 מ"ל) להוסיף 17 μl של H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ פתרון של 30% O H _2). להוסיף 2.0 מ"ל לכל טוב.
    הערה: טיפול הולם יש לנקוט בעת שימוש ריאגנטים אלה. ידית עם כפפות ומעילים מעבדה.

2. C-FOS Induction ועיבוד רקמות in vivo

הערה: הניסויים בוצעו בחולדות (ספראג Dawley) או עכברים (C57BL / 6).

1. מניחים את החיות תיבת אטום מאוורר עם חוסר חמצן (% O ₂ 8 N ₂ מאוזן) או hypercapnic (CO ₂ 4%, O ₂ 21% N ₂ מאוזן) תערובת גז עבור שעה 2 (איור 2 א).
2. לטשטש את החיה עם זריקה intraperitoneal של pentobarbital (100 מ"ג / ק"ג). Perfuse את transcardially חיה עם 4% ²⁰ PFA. ידית עם כפפות לטיפול ולשימוש מתחת למכסה המנוע כימי.
3. לאחר זלוף, לנתח את המוח ²⁰ ו לטבול אותו 7 מ"ל של 4% PFA בתוך שפופרת 15 מ"ל במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להסיר את המוח מפני PFA לטבול אותו לחלוטין בפתרון cryoprotective. חנות ב -18 ° C (איור 3). השלך את שאר בגופה של החיה על ידי רשות פסולת העיבוד המתאימהthway.
   הערה: Cryoprotection הוא צעד בין קיבעון PFA והקפאה. זה מפחית את ההיווצרות של גבישי קרח בתאים עם שפתרונן הקפאה תהיה בצורה אמורפית. הדגימות הקבועות חייבות להיות ספוגות בתמיסת cryoprotective (המוכנה בשלב 1.3) לפחות 24 שעות ב 4 ° C. טפל בו בזהירות וכפפות מתחת למכסה המנוע כימי.

C-FOS 3. אינדוקציה רקמות עיבוד Ex Vivo

הערה: ניסויים בוצעו חולדות או עכברים היילוד בלבד.

1. לבודד את מערכת העצבים המרכזית כפי שתואר על ידי Suzue ^19. מניחים אותו בתא הקלטה Superfuse זה ללא הרף עם נוזל Cerebro-השדרה מלאכותית בשיעור של 7.5 מ"ל / דק 'ב 26 ° C ²¹ (aCSF: מ"מ: 130.0 NaCl, 5.4 KCl, 0.8 ₂ CaCl, 1.0 ₂ MgCl, 26.0 ₃ NaHCO, 30.0-גלוקוז D; רווי O ₂ ו- מותאם pH 7.4 באמצעות הזרמת גזים עם 95% O ₂ ו -5CO _2%) (איור 2 ב).
2. החזר את aCSF עם (הרכב אותו מבעבע עם 95% N ₂ ו 5% CO _2, pH 7.4) deoxygenated aCSF היפוקסיה או על ידי aCSF acidified (aCSF רגיל עם NaHCO ₃ מופחת 10.0 מ"מ, מבעבע עם 95% O ₂ ו 5% CO ₂₎ עבור hypercapnia. החל הגירוי למשך 30 דקות (איור 2 ב).
3. גופיים, לאחר תקופת אינדוקציה, להעביר את מערכת העצבים המרכזית של עכברים או חולדות הילוד ב 2.5 מ"ל של 4% PFA בתוך שפופרת 2.5 מ"ל במשך 48 שעות ולאחסן ב -18 ° בתמיסה cryoprotective לשימוש מאוחר יותר (איור 3).
   הערה: גופיים, זה לא הכרחי כדי perfuse חיות. מחקר קודם מצביע על כך דגימות קטנות מדידות פחות מ -10 מ"מ קוטר ניתן לתקן על ידי דיפוזיה פשוטה ^22. שיעור צטט חדירה (מרחק, במ"מ, עבור דיפוזיה מקבעת לתוך הרקמה) עבור אלדהיד הוא 2 או 3 מ"מ / שעה.

4. גזע המוח חתך

הערה: החל מ שלב זה עד הסוף, הפרוטוקול הוא זהה לחלוטין עבור in vivo ו זירוזים vivo לשעבר.

1. לפני חיתוך, להציב אדם אחד גם להכניס בצלחת 12-היטב ולהוסיף 2.5 מ"ל של PBS היטב כל אחד.
2. הפוך חלקים העטרה סדרתי (40 מיקרומטר) של גזע המוח עם cryostat ולאסוף אותם בצלחת 12 באר. עבור גזע המוח הבוגר, להפוך כ -70 פרוסות (איור 3).
   הערה: אפשר רקמות סעיף מכמה חיות במקביל צלחת אחת.

5. נהלים immunohistological (טבלה 1)

הערה: לאורך כל ההליך, בסעיפים להישאר מוסיף גם.

1. יום 1 - הרס פעילות peroxidase אנדוגני, הלא ספציפית מצור אתר קישור, ו דגירה עם הנוגדן הראשוני (איור 4)
   1. לִשְׁטוֹףהסעיפים במשך 10 דקות עם 0.1 M PBS ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 3 פעמים.
   2. לדכא את פעילות peroxidase אנדוגני ידי דוגרים חלקים העטרה למשך 30 דקות ב RT עם מי חמצן H ₂ O _2, 3% ב 0.1 M PBS (2.5 מ"ל לכל טוב).
   3. שטפו את הסעיפים במשך 10 דקות עם 0.1 M PBS ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 3 פעמים.
   4. חסום את אתר קישור מקשים שאינם ספציפי על ידי דוגרי חלקי עטרה עבור שעה 1 ב RT עם סרום עיזים (2%) ב PBST.
   5. דגירה חלקים העטרה במשך 48 שעות ב 4 ° C עם נוגדן polyclonal ארנב נגד החלבון C-FOS (1: 4000, SC-52,) ב PBST עם אלבומין בסרום שור (0.25%) (2.5 מ"ל לכל טוב).
2. יום 3 - דגירה עם נוגדנים משני ופיתוח של תגובת צבע (איור 4)
   1. שטפו את הסעיפים במשך 10 דקות עם PBS 0.1 M ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 3 פעמים.
   2. דגירהחלקים העטרה עבור שעה 1 ב RT עם נוגדן נגד ארנב עז biotinylated (1: 500) ב PBST עם אלבומין בסרום שור (0.25%) (2.5 מ"ל לכל טוב).
      הערה: החוקר יכול גם להשתמש נוגדנים משני מצמידים בדיקה ניאון בשלב זה. במקרה זה, להפסיק את הפרוטוקול בשלב זה ולבחון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישירות.
   3. שטפו את הסעיפים במשך 10 דקות עם PBST ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 3 פעמים.
   4. דגירה חלקים העטרה עבור שעה 1 עם תסביך avidin ביוטין-peroxidase (1: 250) ב PBST (2.5 מ"ל לכל טוב).
   5. שטפו את הסעיפים במשך 10 דקות עם PBST ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור על 2 פעמים.
   6. שטוף את הסעיפים במשך 10 דקות עם 0.05 מ 'טריס-הצפה ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור על 2 פעמים.
   7. דגירת חלקי העטרה עם tetrahydrochloride 0.02% 3.3-diaminobenzidine, אמוניום סולפט ניקל 0.04% ואת מי חמצן 0.01% 0.05 M טריס חיץ (pH 7.6) אt RT (2.0 מ"ל לכל טוב). בשנת הפתרון הנותרים (25 מ"ל) להוסיף 17 μl H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ פתרון של 30% H ₂ O) (2.0 מ"ל לכל טוב).
      הערה: החוקר צריך לקבוע את זמני פיתוח תחת מיקרוסקופ אור. עם זאת, 5 עד 10 דקות מספקות עוצמת מכתים טובה.
   8. כאשר המכתים עוצם הוא אופטימלי (מבוקר תחת מיקרוסקופ אור, ראה איור 5 ואיור 6), לעצור את התגובה על ידי שטיפת החלקים במשך 10 דקות עם 0.1 M PBS ב RT (2.5 מ"ל לכל טוב). חזור 4 פעמים. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם מים מזוקקים.
3. דגימה הרכבה (להישמר מהם וכפפות מתחת למכסה המנוע כימי)
   1. סעיפי הר סדר בשקופיות ו-אוויר יבש. לשם כך, להפיץ את הסעיפים בזהירות כדי rostro- הזנב עם מברשות בשקופיות. ברור לתייג את השקופיות על פי דגימות.
   2. מייבשים עם אל המוחלטcohol: לטבול את השקופיות עבור 30 שניות ב RT באמבט אלכוהול מוחלט. חזור פעמיים.
   3. בהיר עם קסילן: לטבול את השקופיות אמבטיה קסילן במשך 3 דקות ב RT. חזור פעמיים.
   4. Coverslip את השקופיות עם הרכבה בינונית. לשם כך, להחיל 5 טיפות של הרכבה בינונית בשקופית ולאחר מכן להחיל את הזכוכית המכסה מבריחים את בועות האוויר. אוויר יבש במשך 48 שעות.

6. נתונים וניתוח סטטיסטי

1. בדוק חלקים תחת מיקרוסקופ אור. חזותי לספור נוירונים FLI בהגדלה גבוהה (200x) באמצעות ציוני דרך סטנדרטיות ^23,24. מכתים punctiform c-Fos מותאמת גרעינים של נוירונים.
2. עבור כל אזור נתח, לספור את מספר תאי ג-FOS החיובי לכל סעיף ולהשוות את המספר הממוצע בין תנאים המלאים המגורים. בהתאם הנורמליות של נתונים, להשתמש במבחן t של סטודנט מזווג או מבחן מאן-וויטני. הבדלים נחשבו משמעותי אם P0; 0.05. מגרש את ההפצה של נוירונים FLI גבי (100x גדלה) ציור באמצעות צינור ציור מצורף המיקרוסקופ וצלם עם מצלמה דיגיטלית (איור 5).

תוצאות

גילוי ג-FOS הוא כלי שימושי המאפשר קבוצות זיהוי של תאים מופעלים בתנאים מסוימים כגון היפוקסיה ו hypercapnia in vivo (איור 2 א) או במצבי המחקים תנאים אלה לשעבר vivo (איור 2 ב). בשנת vivo, שזה עתה נולד, צעיר , או מכרסמים מבוגרים הושמו תיבת א...

Discussion

C-Fos הוא גן מוקדם מיידי, ואת זיהוי המוצרים שלה, חלבון C-FOS, משמש קלסי לזהות אוכלוסיות נוירונים המעורבים בתגובות נשימה ספציפיות in vivo ^11,13,25,28 לשעבר vivo ^{16-18, 27,32,33.}

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture plate 12-well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153