은 C-FOS 단백질 면역 조직 검색 : 특정 생리적 반응에 관여 중앙 진학의 마커로서 유용한 도구<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 전의 VIVO</em

요약

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

초록

많은 연구는 특정 생리 규정과 관련된 뇌 영역을 식별 매핑 구한다. 프로토-종양 유전자 C-FOS, 즉시 초기 유전자는 다양한 자극에 반응하여 신경 세포로 표현된다. 단백질 생성물을 용이하게 그 활성의 변화를 표시 뉴런의 그룹을 매핑하는 C-FOS 검출의 사용에 이르는 면역 기술로 검출 할 수있다. 이 글에서, 우리는 저산소증 또는 탄산 혈증에 환기 적응에 관여하는 뇌간 신경 인구의 식별에 초점을 맞추었다. 두 가지 방법은 동물의 생체 내에서 관련 신경 세포 인구를 식별하기 위해 설명하고, 생체 deafferented 뇌간 준비한다. 생체 내, 동물. hypercapnic 또는 저산소 가스 혼합물에 노출 된 예 생체 내, deafferented 준비가 저산소 또는 hypercapnic 인공 뇌척수액으로 superfused했다. 두 경우 모두, 하나 제어 생체 내 동물 또는 전자에X 생체 준비가 정상 산소와 normocapnic 조건에서 유지 하였다. 이 두 가지 방법의 비교는 신경 세포의 활성화, 즉의 기원의 결정을 할 수 있습니다 주변 및 / 또는 중앙. 생체 내 및 생체 외, brainstems가 수집, 고정 및 섹션으로 분리되었다. 섹션 제조 하였다되면, C-FOS 단백질의 면역 검출을 저산소 또는 hypercapnic 자극에 의​​해 활성화 된 세포의 뇌간 그룹을 식별하기 위해 만들어졌다. 레이블이 세포는 뇌간 호흡 구조에서 계산되었다. 상기 제어 조건, 저산소증 또는 고탄 산혈증에 비해 따라서 중앙 호흡 드라이브의 적응에 관여하는 신경 전달 경로의 여러 가지 구조적 뇌간 특정 부위에서 C-FOS 표지화 된 세포의 수가 증가 하였다.

서문

C- FOS 유전자 1980 ^1,2 초에 처음 동정 및 유전자 생성물 활성제 ^특성을 갖는 ^3,4- 핵 단백질로서 1984 년에 나타내었다. 그것은 신경 자극과 관련된 장기 메커니즘에 참여하고 있습니다. 사실, 신경 활동의 변화는 전사 인자 C-FOS의 생산을 유도 즉시 초기 유전자 C-FOS의 발현을 유도 두 번째 메신저 신호 폭포로 이어집니다. 후자는 늦은 유전자의 발현을 개시함으로써 자극 ^(4)의 여러 유형의 신경 시스템의 적응 반응에 참여한다. 따라서, 1980 ^5,6- 말부터, C-FOS 단백질 검출 자주 신경 경로를 매핑하기위한 일반 ⁴ 및 중추 신경계 (CNS)의 활성을 유전자 전사에 외생 적 요인의 영향을 연구하기 위해 사용되어왔다 다른 생리에 관여알 조건.

기초 C-FOS 표현은 쥐, 쥐, 고양이, 원숭이, 인간 ⁴ 등 다양한 종에서 연구되어왔다. 이로써, 그 표현의 역학은 비교적 잘 알려져있다. 전사 활성화 (5~20 분) ^7,8 급이며 mRNA의 축적은 자극 ^(9)의 발병 후 30 및 45 분 사이에서 최대 값에 도달하고 12 분의 짧은 반감기로 감소한다. 은 C-FOS의 단백질 합성은 mRNA의 축적을 다음 20 ~ 90 분 후 자극 ^6에서 면역 조직 화학 염색에 의해 검출 될 수있다.

C-FOS 발현 분석 고전 저산소 혈증 또는 ^10-14에 환기 반응과 관련된 중추 호흡 네트워크를 식별하기 위해 생체 내 연구에 사용된다. 최근에,이 도구는 저산소증 또는 시간에 중앙 호흡 네트워크 적응을 탐구하는 생체 뇌간 준비에 사용 된ypercapnia ^15-18. 사실, 이러한 준비는 고전적인 중앙 호흡기 드라이브 ^(19)에 동화 리듬 활동을 생성합니다. 따라서, 제제의 유형이 완전히 deafferented되는 장점을 가지며, 따라서, C-FOS 발현에 관한 결과는 주변 구조물의 개입없이 중앙의 자극의 결과를 반영한다.

은 C-FOS 검출은 면역 조직 화학 또는 immunohistofluorescence 방법에 의해 제조 될 수있다. 간접 면역은 C-FOS에 대한 일차 항체와 차 항체를 생성시킨 종 향한 이차 항체의 사용을 필요로한다. 면역 조직 화학적 방법의 경우, 이차 항체는 기판 (퍼 옥시다아제를위한 H ₂ O _2)에 작용하는 효소 (예 : 퍼 옥시 다제)와 결합된다. 효소 반응의 생성물은 크로 모겐 (3,3- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochlorid 의해 개발전자), 어떤을 얼룩과 광학 현미경으로 관찰 할 수있다. 반응은 니켈, 황산 암모늄을 사용하여 강화 될 수있다. 이러한 방법은 다른 생리 학적 문제 중 활성 뉴런의 검출에 따라서, 식별 및 / 또는 연속 된 생리적 반응과 관련된 주변과 중앙 통로의 맵핑을 허용한다.

프로토콜

참고 : C-FOS 검출 여러 단계 (그림 1)을 포함하는 표준화 된 절차입니다. 모든 실험은 쥐 또는 쥐에서 수행되었다. 실험 프로토콜은 동물 보호에 대한 2010년 9월 22일 (63분의 2,010 / EU)의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 수행, 동물 실험 찰스 다윈 (Charles Darwin) (/ 05 / 2011 CE5)의 윤리위원회의 승인에 따라 실시 하였다 동물 보호를위한 프랑스 법.

솔루션 1. 준비

1. 0.2 M 인산 나트륨 완충액을 준비 : 교반하면서 6.24 g의의 NaH ₂ PO ₄ * 2H ₂ O 및 22.56 g 나 ₂ HPO ₄ *의 H ₂ O 1 L의 증류수를 추가합니다.
2. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비 : 증류수 150 ml의 PFA의 20g을 추가합니다. 교반하면서 80 ℃로 용액을 가열한다. 솔루션을 지우려면 열을 감소시키고 파라 포름 알데히드가 분해하기 위해 1 N NaOH를 1 ~ 2 방울을 추가합니다. 250 mL의 완전한증류수 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.4) 250 mL로 추가한다. 4 ℃에서 보관하십시오. 이 시약을 사용할 때 적절한주의하십시오. 화학 후드 아래 장갑, 실험실 코트, 안전 고글 처리합니다.
   참고 : 관류 전날 4 % PFA를 준비합니다. 나이, 개수 및 동물의 종의 함수로서 4 % PFA의 볼륨을 결정한다.
3. cryoprotective 용액을 제조 하였다 : 0.2 M 인산 완충 식염수 250 ㎖에, 폴리 비닐 피 롤리 돈 5 g, 수크로오스 150 g 염화나트륨 2.5 g을 혼합한다. 완전히 용해 된 후, 에틸렌 글리콜 150 mL를 넣고, 정제수 500 ml의 조절. 4 °의 C에서 cryoprotective 솔루션을 저장합니다.
4. 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS)를 준비 : 교반하면서 1 L의 증류수에 염화나트륨 18g을 추가합니다. 완전히 용해 후, 인산 나트륨 완충액 중 1 M, 0.2 L를 추가한다.
5. 인산염 완충 식염수가 0.3 %로 보충를 준비 트리톤 (Triton) X100 (PBST)는 : 트리톤 X10의 3 ML을 추가PBS의 0 997 ml가.
6. 0.05 M 트리스 완충액 (pH 7.6)를 준비 : 교반하면서 증류수 500 ml의 3.03 트리스 염산염의 g 및 0.70 g 트리스베이스를 추가합니다.
7. 한 판에 대한 솔루션을 30 ml의 준비 : PBST에 2 % 염소 혈청을 준비합니다. 30 ml의 PBST에 염소 혈청 600 μl를 넣고 잘 섞는다. 물론 당 2.5 ML을 추가합니다.
   참고 : 사용 세럼은 이차 항체 생산에 사용되는 종 와야합니다
8. 소 혈청 알부민 (0.25 %)을 PBST에 (4000, SC-52 1) C-FOS 단백질에 대해 토끼 폴리 클로 날 항체를 준비한다. 한 접시를 들어, 용액 30ml를 준비합니다. 30 ml의 PBST에 소 혈청 알부민 75 mg을 추가하고 잘 섞는다. 그 후, C-FOS 단백질에 대한 토끼 다 클론 항체의 7.5 μl를 추가합니다.
9. 혈청 알부민 소 (0.25 %)을 PBST에서 : 오티 닐화 염소 항 - 토끼 항체 (500 1)을 준비한다. 한 접시를 들어, 용액 30ml를 준비합니다. 30 ml의 PBST에 소 혈청 알부민 75 mg을 추가하고 잘 섞는다. 그런 다음 추가비 오티 닐화 염소 항 - 토끼 항체 60 μL.
10. 준비 아비딘 - 비오틴 - 퍼 옥시 다제 (1 : 250) 착체 PBST (ABC 용액)이다. 한 접시를 들어, 용액 30ml를 준비합니다. 시약 A의 120 μl를 30 ml의 PBST에 시약 B의 120 μl를 넣고 잘 섞는다.
    주 : ABC 솔루션은 사용하기 전에 적어도 30 분을 준비해야합니다.
11. 기질 용액을 준비합니다. 사용 직전에, (하나의 판에 대해) 다음과 같이 용액을 제조한다 : 니켈 황산 암모늄 20 mg을 50 ㎖의 트리스 완충액 3.3 - 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride 10 ㎎을 추가한다. 필터와 빛으로부터 보호합니다. 물론 당 2.0 ML을 추가합니다. 잔류 용액 (25 mL) 중 17 μL H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ 용액 H ₂ O 30 %)을 추가한다. 물론 당 2.0 ML을 추가합니다.
    주 : 이들 시약을 사용하는 경우, 적절한주의를 기울여야한다. 장갑 및 실험실 코트와 함께 처리합니다.

2. C-FOS에서 Indu생체 ction 및 조직 처리

참고 : 실험 쥐 (스프 라그 돌리) 또는 마우스 (/ 6 C57BL)에서 수행 하였다.

1. 2 시간 (그림 2A)에 대한 저산소 (O ₂ 8 % 균형 N ₂₎ 또는 hypercapnic (CO ₂ 4 %, O ₂ 21 % 균형 N ₂₎ 가스 혼합물로 환기 밀폐 된 상자에 동물을 배치합니다.
2. 펜토 바르 비탈의 복강 내 주사 (100 ㎎ / ㎏)을 가진 동물을 마취. 4 % PFA ⁽²⁰⁾ 동물로 transcardially을 관류. 화학 후드 관리 및 사용 장갑 처리합니다.
3. 재관류 후, 뇌 ^(20)를 해부하고 4 ℃에서 48 시간 동안 15 ML 튜브에 4 % PFA 7 ml의에 젖어. 그런 다음 PFA에서 뇌를 제거하고 cryoprotective 용액에 완전히 몰입. -18 ° C를 (그림 3)에서 보관하십시오. 적절한 폐기물 처리 파에 의해 동물의 신체의 나머지를 폐기thway.
   참고 : Cryoprotection는 PFA 고정 및 동결 사이의 단계입니다. 그것은 그 동결 비정질 형태 일 것이다 용액으로 세포 내 얼음 결정의 형성을 감소시킨다. 고정 된 샘플은 4 ° C에서 최소 24 시간 동안 (단계 1.3에서 준비)에 cryoprotective 용액에 함침해야합니다. 화학 후드 관리 및 장갑으로 처리합니다.

3. C-FOS 유도 및 조직 처리 전의 VIVO

참고 실험은 신생아 래트 또는 마우스에서 수행되었다.

1. Suzue ¹⁹ 바와 같은 CNS 격리. 의 MgCl _2, 26.0을 130.0 염화나트륨, 5.4의 KCl, 0.8 염화칼슘 _2, 1.0 : 기록 챔버에 배치하고 26 ° C ⁽²¹⁾ (ACSF에서 7.5 ml / 분의 속도로 인공 뇌 - 척수와 지속적으로 superfuse : MM에서 _NaHCO3을 30.0 D-글루코스, 95 % O _{2 및도} 5의 가스 배출에 의해 _O이 포화하여 pH 7.4로 조정%의 CO ₂₎ (그림 2B).
2. 95 % O _2로 버블 저산소증 또는 10.0 mm로 감소 _{된 NaHCO3와} 산성화 ACSF (표준 ACSF하여 탈산 소화 ACSF (95 % N ₂ 및 5 % CO _2, pH를 7.4로 버블 동일한 조성)와 ACSF 교체 탄산 혈증에 대한 5 % CO _2). 30 분 (그림 2B)에 대한 자극을 적용합니다.
3. 생체는 유도 기간 후, 나중에 사용하기 (그림 3)에 대한 cryoprotective 용액에 -18 ℃에서 48 시간 저장을위한 2.5 ML 튜브에 2.5 ml의 4 % PFA에 신생아 쥐 또는 쥐의 CNS를 전송합니다.
   참고 : 예 생체 내, 동물을 관류 할 필요가 없습니다. 이전의 연구는 작은 표본은 직경 10mm 이하는 단순 확산 ^(22)에 의해 고정 될 수있다 측정하는 것이 좋습니다. 알데히드에 대한 (조직에 정착 확산 mm의 거리) 침투의 인용 율은 2 ~ 3 mm / 시간입니다.

4. 뇌간 단면

참고 : 끝으로이 단계에서 프로토콜이 엄격하게 생체 내 및 생체 입회식에 대해 동일합니다.

1. 슬라이스 전에, 한 개인이 아니라 12 웰 플레이트에 삽입하고 각 웰에 PBS 2.5 ml의 추가 배치합니다.
2. 그라 이오 스탯과 뇌간의 직렬 관상 섹션 (40 μm의)를 확인하고 12 웰 플레이트에서 그들을 수집합니다. 전체 성인 뇌간의 경우, 약 70 조각 (그림 3)를 확인합니다.
   참고 : 하나의 판에 병렬로 여러 동물 섹션 조직 할 수있다.

5. 면역 조직 절차 (표 1)

참고 : 절차 전반에 걸쳐 섹션은 잘 삽입에 남아 있습니다.

1. 1 일차 - 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 파괴, 비특이적 결합 부위를 차단하고, 차 항체와 항온 처리 (도 4)
   1. 빨래RT에서 0.1 M PBS로 10 분간 섹션 (웰당 2.5 mL)을 첨가 하였다. 3 번 반복합니다.
   2. 과산화수소 H로 RT에서 30 분 동안 관상 섹션을 배양하여 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 억제하는 ₂ O _2, 3 %, 0.1 M PBS (웰당 2.5 mL)으로한다.
   3. 실온에서 0.1 M PBS로 10 분 (물론 당 2.5 ㎖)에 대한 섹션을 씻으십시오. 3 번 반복합니다.
   4. PBST의 염소 혈청 (2 %)로 실온에서 1 시간 동안 관상 섹션을 배양하여 비 특이 결합 부위를 차단합니다.
   5. 소 혈청 알부민 (0.25 %) (웰 당 2.5 ㎖)와 PBST에서 (4000, SC-52, 1) C-FOS 단백질에 대한 토끼 다 클론 항체로 4 ℃에서 48 시간 동안 관상 섹션을 품어.
2. 3 일 - 이차 항체와 색상 반응의 개발과 배양 (그림 4)
   1. RT에서 PBS 0.1 M 10 분 (물론 당 2.5 ㎖)에 대한 섹션을 씻으십시오. 3 번 반복합니다.
   2. 품어소 혈청 알부민 (0.25 %) (웰당 2.5 mL)로 PBST에서 : 오티 닐화 염소 항 - 토끼 항체 (500 1)와 RT에서 1 시간 동안 관상 섹션.
      주 : 조사자는 또한이 단계에서 형광 프로브에 결합 된 이차 항체를 사용할 수있다. 이 경우,이 단계에서 프로토콜을 중지하고, 형광 현미경을 이용하여 직접적으로 조사한다.
   3. RT에서 PBST 10 분 (물론 당 2.5 ㎖)에 대한 섹션을 씻으십시오. 3 번 반복합니다.
   4. 로 1 시간 동안 관상 섹션을 품어 아비딘 - 비오틴 - 퍼 옥시 다제 (1 : 250) 복합 (물론 당 2.5 ml)을 PBST있다.
   5. RT에서 PBST 10 분 (물론 당 2.5 ㎖)에 대한 섹션을 씻으십시오. 2 번 반복합니다.
   6. 실온에서 0.05 M 트리스 버퍼와 10 분 (물론 당 2.5 ㎖)에 대한 섹션을 씻으십시오. 2 번 반복합니다.
   7. 0.05 M 트리스 완충액에 0.02 % 3.3 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride 0.04 % 니켈, 황산 암모늄 0.01 % 과산화수소와 관상 부 부화 (PH 7.6)를t RT (웰당 2.0 mL)을 첨가 하였다. 잔류 용액 (25 ㎖)을 추가 17 μL를 H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ 용액 H ₂ O 30 %) (웰 당 2.0 ㎖).
      주 : 조사 광 현미경 개발 시간을 결정해야한다. 그러나, 5 ~ 10 분 좋은 염색 강도를 제공합니다.
   8. 강도를 염색하는 것이 최적 일 때 실온에서 0.1 M PBS로 10 분 (물론 당 2.5 ㎖)에 대한 부분을 세척하여 반응을 정지 (광학 현미경의 규제, 그림 5, 그림 6 참조). 4 번 반복합니다. 그런 다음, 증류수로 섹션을 씻으십시오.
3. 샘플링 장착 (화학 후드 관리 및 장갑 처리)
   1. 직렬 슬라이드와 공기 건조에 마운트 부분. 이를 위해 조심스럽게 슬라이드 브러쉬 rostro - 꼬리 순서로 섹션을 확산. 분명히 샘플에 따라 슬라이드 레이블을 붙입니다.
   2. 절대 알과 탈수cohol는 : 절대 알코올 목욕 RT에서 30 초 동안 슬라이드를 담가. 두 번 반복합니다.
   3. 자일 렌과 클리어 : RT에서 3 분 동안 크실렌 욕조에 슬라이드를 담가. 두 번 반복합니다.
   4. 매체 마운팅 슬라이드 커버 슬립. 이를 위해 슬라이드 매체 장착 5 방울을 적용하고 기포를 구동함으로써 덮개 유리를 적용한다. 공기 건조 48 시간 동안.

6. 데이터 및 통계 분석

1. 광학 현미경 아래 부분을 검사합니다. 시각 표준 랜드 마크 ^{(23, 24)를} 사용하여 고배율 (200 배)에서 FLI 뉴런을 계산합니다. 은 C-에 Fos의 punctiform 염색은 신경 세포의 핵에 지역화됩니다.
2. 각 분석 영역의 경우, 섹션 당 C-FOS 양성 세포의 수를 계산 및 제어하고 자극 조건 사이의 평균 수를 비교합니다. 데이터의 정상에 따라 부대 학생의 t 테스트 또는 맨 - 휘트니 시험을 사용한다. 차이는 P의 경우 유의하다고 하였다0 0.05. 도면 튜브 현미경에 부착 된 디지털 카메라로 촬영했다 (도 5)를 사용하여 드로잉 (배율 100 배) 상 FLI 뉴런의 분포를 플롯.

결과

은 C-FOS 검출은 생체 내 (그림 2A)에서 저산소증과 탄산 혈증이나 이러한 조건 생체 외 (그림 2B)를 모방 상황에서 특정 조건에서 활성화 된 세포의 식별 그룹을 할 수있는 유용한 도구입니다. 생체 내, 신생아, 젊은 또는 성인 설치류는 기상 환경이 지속적 정확하게 30 내지 180 분 ^13,25,26 (도 2A)에 대해 ?...

토론

C-FOS 즉각적인 초기 유전자와 그 산물의 검출은 상기 C-FOS 단백질, 고전 생체 ^11,13,25,28 특정 호흡기 반응에 관여하는 신경 세포 집단을 식별하는 데 사용되며, 생체 ^{16-18 27,32,33.}

프로토콜 내에서 중요한 단계

재관류 단계에서주의해야합니다. 4 % PFA 솔루션은 잘 준비되어야하며 고정 및 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture plate 12-well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153