Un método rápido y eficiente para la purificación de células del endodermo generada a partir de células madre embrionarias humanas

Resumen

A continuación, se describe un método para la purificación de células madre embrionarias humanas diferenciadas que están comprometidas hacia el endodermo definitivo para la mejora de las aplicaciones posteriores y otras diferenciaciones.

Resumen

Las capacidades de diferenciación de las células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias (CES) permiten que una aplicación terapéutica potencial para las terapias de reemplazo celular. Terminal tipos de células diferenciadas se podrían utilizar para el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas. Diferenciación in vitro de estas células hacia los tejidos del pulmón, hígado y páncreas requiere como primera etapa de la generación de células endodérmicas definitivas. Este paso es limitante de la velocidad para su posterior diferenciación hacia tipos de células maduras terminal tales como las células beta productoras de insulina, hepatocitos u otros tipos celulares derivados del endodermo. Las células que se han comprometido hacia el linaje endodermo altamente expresan una multitud de factores de transcripción como FOXA2, SOX17, HNF1B, los miembros de la familia GATA, y el receptor CXCR4 superficie. Sin embargo, rara vez son protocolos de diferenciación 100% de eficiencia. A continuación, describimos un método para la purificación de una población de células CXCR4 + después de la diferenciaciónen la DE mediante el uso de microperlas magnéticas. Esta purificación elimina, además, las células de los linajes no deseados. El método de purificación suave es rápido y fiable, y puede ser utilizado para mejorar las aplicaciones posteriores y diferenciaciones.

Introducción

Las células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias (CES) tienen la capacidad de diferenciarse en casi cualquier tipo de célula del cuerpo humano. Por lo tanto, los protocolos de diferenciación in vitro se pueden utilizar para generar numerosos tipos de células de adultos, tales como cardiomiocitos, hepatocitos ^{1 2, las} células beta ^3, epitelial de pulmón ⁴ o células neuronales ^5. Esto hace que los CES una herramienta valiosa para el tratamiento potencial de diversas enfermedades degenerativas ^3.

La diferenciación in vitro de los CES hacia tejidos adultos del pulmón, hígado y páncreas requiere un pseudo-gastrulación en células que recuerdan el endodermo definitivo (DE) ^6. Puesto que la diferenciación de aguas abajo hacia los tipos de células somáticas antes mencionados es significativamente menos eficiente, una diferenciación endodermo óptima se considera como limitante de la velocidad ^7. Las células que se han comprometido hacia el linaje endodermo se someten chacaracterísti- cambios en su perfil de expresión génica. Regulador de los genes maestros pluripotencia están regulados hacia abajo, mientras que la expresión de otros factores de transcripción como FOXA2, SOX17, HNF1B, los miembros de la familia GATA y el receptor de la superficie CXCR4 está altamente regulada positivamente ^{6, 8, 9.} CXCR4 es conocido por estar transactivated por SMAD2 / 3, aguas abajo de la señalización nodal / TGF-β y SOX17 debido a los sitios de unión específicos en su región promotora ^10. Por lo tanto es un marcador muy adecuado usado en una serie de informes ^{6, 8, 11-13.} Estos cambios en la expresión refleja un evento pseudo-gastrulación, en el que los CES primera adquieren características de una población de células racha similar primitiva y, posteriormente, se comprometen en la capa de germen de endodermo ^6.

Sin embargo, los protocolos de diferenciación rara vez son 100% de eficiencia como algunas células pueden resistir el proceso de diferenciación o diferenciar hacia otros linajes no deseados ^14. Estas células pueden INFLUE negativamentena vez mayor diferenciación. Además, las células indiferenciadas residuales albergan grandes riesgos para posteriores experimentos de trasplante y pueden dar lugar a teratomas ^15-17.

Para eliminar estas células no deseadas se pueden utilizar para la purificación de las células que se han comprometido hacia la DE ¹⁸ temprano en el CXCR4 marcador de superficie. A continuación, describimos un método para la selección positiva de células CXCR4 + a partir de cultivos de diferenciación DE. Para ello, el CXCR4 marcador de superficie se une por un anticuerpo que luego a su vez se une a las microperlas magnéticas. A diferencia de las duras condiciones durante FACS clasificación, las células marcadas magnéticamente DE-como pueden ser fácilmente purificados en un formato de sobremesa usando un método de purificación suave. Este protocolo proporciona un método sencillo para la eliminación de poblaciones de células que resistió el proceso de diferenciación DE.

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Protocolo

1. La diferenciación de ESC humana hacia el endodermo definitivo

1. Cultivar células madre embrionarias humanas (CES) en una incubadora a 37 ° C y 5% de _CO2.
2. Escudo una nueva placa de cultivo celular de 6 pocillos con 1 ml de una matriz de membrana basal e incubar la cultura-ware durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Para obtener detalles específicos, por favor dirigirse a las instrucciones del fabricante respectivo.
3. Confirman que las CME humanas cultivadas han alcanzado el 80% -90% de confluencia en el microscopio utilizando una magnificación baja (por ejemplo, 4X). Aspirar el medio de las cavidades chupando el medio con una pipeta Pasteur de vidrio estéril. Lavar las células una vez con solución salina (PBS) tamponada con fosfato. Para ello, agregar 2 ml de PBS a cada pocillo suavemente sacudir la placa y chupar la solución para eliminar las células muertas y restos celulares.
4. Añadir 1 ml de reactivo de solución pases libre de enzimas para la disociación suave de grupos de células. Se incuban las células a 37 ° C unad CO2 al _5% hasta que las células muestran claros signos de perturbación en pequeños racimos.
   NOTA: El tiempo de incubación depende del reactivo utilizado. Para la solución pases libre de enzima se menciona en la sección de materiales, el tiempo de incubación es de aproximadamente 7 min.
5. Añadir 1 ml de medio DMEM / F-12 e interrumpir los agregados de células restantes en células individuales mediante la pipeta hacia arriba y hacia abajo usando una punta de pipeta de 1 ml. Utilice esta para eliminar las células de la superficie y transferir las células a un tubo de centrifugación. Para recuperar todas las células, lavar cada pocillo con 1 ml de medio DMEM / F-12 y añadir el medio al tubo de centrifugación.
6. Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio de cultivo de células ES que contienen Rho-quinasa inhibidor 10 mM (ROCK).
7. Contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro y sembrar 150.000 - 400.000 células por 6 pocillos o en otra disposición de la placa, dependiendo de la línea de células ES utilizado. uso cultura medio que contiene inhibidor de Rock 10 mM para evitar la apoptosis y cultivar las células en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
8. Aproximadamente 24 horas después de la siembra aspirado el medio con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y añadir 2 ml de medio de inducción línea primitiva.
   NOTA: Este medio contiene concentraciones finales de 1% de glutamina, 0,2% de FCS, 5 mM CHIR-99021 y 50 ng / ml de activina A en Avanzada medio RPMI-1640. Comúnmente, utilizar 2 ml de medio para el cultivo en placas de 6 pocillos.
9. 48 horas después de la siembra, vuelva a colocar el medio de endodermo medio de inducción. Cultivar las células en este medio durante otras 48 horas con cambio de medio día.
   NOTA: Este medio contiene 1% de glutamina, 0,2% de FCS y 50 ng / ml de activina A en Avanzada medio RPMI-1640. Las células que se han comprometido hacia el endodermo definitivo expresan el marcador de superficie CXCR4. La tinción de CXCR4 se puede usar para cuantificar el número de células comprometidas-DE.

2. La tinción de células CXCR4 + endodermo definitivo para el análisis de citometría de flujo

1. Para el final de 24 hr, pero al menos 1 hora antes de recoger las células añaden inhibidor Rock 10 mM al medio de cultivo.
2. Escudo del cultivo de células-ware que será utilizado para la re-siembra con una matriz de membrana basal, es decir, placas de 12 pocillos para análisis qPCR o cámara de diapositivas para la tinción de inmunofluorescencia. Incubar las placas o los portaobjetos durante al menos 30 min a TA.
3. Aspirar el medio con una pipeta Pasteur de vidrio estéril de los pocillos de las células diferenciadas usadas para la coloración y / o de clasificación.
4. Añadir 1 ml de reactivo de solución pases libre de enzimas para la disociación suave de grupos de células. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de _CO2 hasta que las células muestran claros signos de perturbación en pequeños racimos.
   NOTA: El tiempo de incubación depende del reactivo utilizado. Para la solución pases libre de enzimas mencionado en la materisección del als, tiempo de incubación es de aproximadamente 7 min.
5. Añadir 1 ml de medio DMEM / F-12 e interrumpir restante agregados de células en células individuales mediante la pipeta hacia arriba y hacia abajo usando una punta de 1 ml. Utilice esta para eliminar las células de la superficie y transferir las células a un tubo de centrifugación. Para recuperar todas las células, lavar cada pocillo con 1 ml de DMEM / F-12 medio w / o FCS y añadir el medio al tubo de centrifugación.
6. Contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro. Las células de tres pocillos de una placa de 6 pocillos deben dar lugar a 10-15 x 10 ⁶ células después de tres días de diferenciación. Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g.
   NOTA: El número exacto de células obtenidas dependerá de la línea de células pluripotentes utilizado para la diferenciación.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en tampón PEB que contiene inhibidor de Rock 10 mM. Utilice 100 l de este tampón durante hasta 10 ⁷ células. Añadir el inhibidor Rock 10 M en el día de staining. Usar este tampón para todas las aplicaciones aguas abajo (que se refiere como tampón PEB + RI).
   NOTA: tampón PEB contiene BSA al 0,5% y EDTA 2 mM en PBS. Si más células deben ser de colores, ajustar el volumen de compensación en consecuencia.
8. Añadir 10 l de un anticuerpo CXCR4-APC por 10 ⁷ células en 100 l, esto representa más o menos una dilución de 1:10.
   NOTA: El uso de un anticuerpo ligado a APC no es obligatorio. En su lugar, puede ser sustituido en función de las microperlas utilizados. Si más células han de ser manchada ajustar el volumen del anticuerpo en consecuencia.
9. Mezclar por voltear suavemente el tubo con los dedos y se incuba a 4 ° C en un refrigerador durante 15 min. Resuspender las células con 1-2 ml de tampón PEB. Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g.
10. Aspirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y resuspender el sedimento celular en 80 l PEB por 10 ⁷ células y añadir 20 l microperlas anti-APC.
    NOTA: Si más células deben ser de colores, ajustar el volumen de microperlas en consecuencia.
11. Mezclar por voltear suavemente el tubo con los dedos y se incuba a 4 ° C en un refrigerador durante 15 min. Resuspender las células con 1-2 ml de tampón PEB + RI. Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g. Aspirar el buffer. Volver a suspender en 500 l de tampón PEB + RI.

3. Separación Magnética de CXCR4 + células

1. Colocar una columna magnética de tamaño medio en un campo magnético como por las instrucciones del fabricante. Pre-enjuagar la columna con tampón PEB 500 l + RI. Aplicar toda la suspensión de células a la columna. Recoger el flujo a través de las células ya que no todos se unirá a la columna. Asegúrese de no molestar a las columnas para la recuperación óptima de células CXCR4 +.
2. Lavar la columna tres veces con 500 l de tampón PEB + RI. Recoger el primer flujo a través y combinarlo con las células recogidas del Paso 3.1. Retire la columna magnética del campo magnético y colocarlo en unatubo de recogida adecuado. Añadir tampón PEB 1 ml + RI en la columna. Para eluir las células que presiona hacia abajo el émbolo en la columna.
3. Opcional: Recoger todo el flujo a través de muestras por separado y el uso de 20 l cada uno para analizar el número de células CXCR4 + mediante citometría de flujo. Su número debería disminuir con cada etapa de lavado.
   NOTA: Al menos 2 x 10 ⁴ viables, células cerradas deben contarse para obtener resultados fiables.
4. Repita los pasos 3.1-3.3 con el flujo de recogida a través de la muestra a partir del paso 3.1 y la primera muestra de flujo a través del paso 3.2 utilizando una nueva columna. No vuelva a utilizar la columna anterior. Al utilizar el aire del émbolo se presiona en la columna, que lo bloquea.
5. Contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro. Dependiendo de la eficiencia de la diferenciación hasta 6 x 10 ⁶ células se pueden clasificar inicialmente y otro 1 x 10 ⁶ células mediante el uso de una segunda columna utilizando 10 ⁷ células para el procedimiento.
6. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y resuspender las células en medio de inducción de endodermo 1 ml de la Etapa 1.9 con inhibidor adicional Rock 10 mM.
7. Contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro. Sembrar las células a una densidad apropiada, es decir, ~ 4 x 10 ⁵ células por pocillo de una placa de 12 pocillos (aprox. 3,6 ^cm2 de superficie) o ~ 1,5 x 10 ⁵ células por pocillo de 8 plantas, así cámara de diapositivas.

4. Opcional: Análisis de la Población purificada endodermo definitivo

1. Para la tinción de inmunofluorescencia fijar las células purificada de la etapa 3.7 más o menos 24 horas después de la siembra con 4% de paraformaldehído y manchas para endodermo definitivo (DE) y / o proteínas marcadoras pluripotencia.
   NOTA: se suele utilizar DE marcadores incluyen FOXA2 y SOX17, marcadores de pluripotencia de uso general incluyen OCT3 / 4, Sox2 y NANOG ^{6, 8.}
2. for análisis RT-qPCR, cosechar las células purificadas directa o 24 horas después de la siembra, extracto total-ARN y la transcripción reversa cDNA a partir de las muestras de ARN total extraído. Utilice 10 ng de cDNA como plantilla por reacción de RT-qPCR (por triplicado) para analizar la expresión de genes marcadores de DE y pluripotencia ^{6, 8.}
   NOTA: Los genes marcadores usados ​​comúnmente se mencionan en el paso 4.1. Las condiciones del ciclo son 5 min a 95 ° C y 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C, seguido por la fusión de análisis de la curva.

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Resultados

la diferenciación CES se someten a cambios drásticos en la expresión de genes y proteínas. La Figura 1 representa los genes marcadores típicos que se pueden utilizar para verificar el éxito de la diferenciación del endodermo. Los principales objetivos de un análisis de la expresión génica son GSC, FOXA2, y SOX17. En un análisis de la expresión génica relativa en especial FOXA2 y SOX17 se increme...

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Discusión

protocolos de diferenciación Actualmente se utilizan rara vez resultan en células diferenciadas 100%. Por razones que aún no se han abordado algunas células resisten el proceso de diferenciación. Dependiendo de la eficiencia del protocolo de diferenciación usado y de la propensión de la ESC línea A cierto número de células pluripotentes residuales se observa con frecuencia, incluso después de la diferenciación en el endodermo definitivo. Estas células residuales pueden poner en peligro diferenciaciones agua...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 human embryonic stem cell line	Harvard Department of stem cell & regenerative biology		Suitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell line	ES Cell International		Suitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC culture medium
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	magnetic field
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK inhibitor
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stemcell Technologies	7174	Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately.
MS Columns	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Technologies
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan assay	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R&D Systems	AF1924