Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung von differenzierten humanen embryonalen Stammzellen, die in Richtung der endgültigen Endoderm zur Verbesserung der Downstream-Anwendungen und weitere Differenzierungen begangen werden.

Zusammenfassung

Die Differenzierung Fähigkeiten von pluripotenten Stammzellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) ermöglichen eine mögliche therapeutische Anwendung für Zell-Ersatz-Therapien. Ausdifferenzierten Zelltypen könnten für die Behandlung von verschiedenen degenerativen Krankheiten verwendet werden. In vitro Differenzierung dieser Zellen gegenüber Geweben der Lunge, der Leber und der Bauchspeicheldrüse erfordert als ersten Schritt die Erzeugung von endgültigen endodermalen Zellen. Dieser Schritt ist geschwindigkeitsbestimmend für die weitere Differenzierung zu endständig gereiften Zelltypen, wie beispielsweise Insulin-produzierenden Beta-Zellen, Hepatozyten oder anderen Endoderm-abgeleiteten Zelltypen. Die Zellen, die in Richtung der endoderm Linie verpflichtet sind ausdrücken sehr eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren wie FOXA2, SOX17, HNF1B, die Mitglieder der GATA-Familie, und der Oberflächenrezeptor CXCR4. Allerdings Differenzierungsprotokolle sind selten 100% effizient. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung eines CXCR4 + Zellpopulation nach der Differenzierungin der DE durch magnetische Mikrokugeln verwendet. Diese Reinigung entfernt zusätzlich Zellen von unerwünschten Linien. Die sanfte Reinigungsverfahren ist schnell und zuverlässig und kann verwendet werden, Downstream-Anwendungen und Differenzierungen zu verbessern.

Einleitung

Pluripotente Stammzellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) haben die Fähigkeit, in nahezu jedem Zelltyp des menschlichen Körpers zu unterscheiden. Somit können in vitro Differenzierungsprotokollen verwendet werden , um zahlreiche adulten Zelltypen wie Kardiomyozyten ^1, Hepatozyten ^2, beta - Zellen ^{3, 4} oder Lungenepithelzellen neuronalen Zellen ⁵ erzeugen. Dies macht WSR ein wertvolles Werkzeug für die mögliche Behandlung von verschiedenen degenerativen Erkrankungen ^3.

Die in vitro Differenzierung von ES- Zellen gegenüber adulten Geweben der Lunge, der Leber und der Bauchspeicheldrüse erfordert eine pseudo-Gastrulation in Zellen erinnert an die definitive Endoderm (DE) ^6. Da stromabwärts Differenzierung gegenüber den zuvor erwähnten Arten somatischer Zellen wesentlich weniger effizient ist, wird eine optimale Differenzierung Endoderm gilt als geschwindigkeitsbestimmender ^7. Die Zellen, die in Richtung der endoderm Linie begangen werden laufen characteristic Veränderungen in ihrem Genexpressionsprofil. Pluripotenz Master - Regulator - Gene herunterreguliert, während die Expression von anderen Transkriptionsfaktoren wie FOXA2, SOX17, HNF1B, die Mitglieder der GATA - Familie und der Oberflächenrezeptor CXCR4 hoch ⁶ hochreguliert ^{wird, 8, 9.} CXCR4 bekannt durch SMAD2 zu trans / 3, hinter Nodal / TGF-β - Signalisierung und SOX17 aufgrund der spezifischen Bindungsstellen in seiner Promotorregion ^10. Somit ist es ein sehr geeignet in einer Reihe von Berichten verwendet Marker ^{6, 8, 11-13.} Diese Expressions Änderungen spiegelt eine Pseudo-gastrulation Ereignis, bei dem WSR erste Merkmale eines primitiven streifenartige Zellpopulation zu erwerben und anschließend begehen in die endoderm Keimschicht ^6.

Allerdings sind Differenzierungsprotokolle selten 100% effizient wie wenige Zellen den Differenzierungsprozess widerstehen kann oder Differenzierung gegenüber anderen unbeabsichtigten Linien ^14. Diese Zellen können sich negativ auf Influence weitere Differenzierung. Darüber hinaus bergen Rest undifferenzierten Zellen große Risiken für spätere Experimente Transplantation und kann zu teratomas ^15-17 geben.

So entfernen Sie können diese unerwünschten Zellen früh auf den Oberflächenmarker CXCR4 zur Reinigung von Zellen verwendet werden , die in Richtung der DE ¹⁸ verpflichtet sind. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die positive Selektion von CXCR4 + -Zellen aus DE Differenzierungskulturen. Hierzu wird die Oberflächenmarker CXCR4 durch einen Antikörper gebunden, der dann wiederum mit magnetischen Microbeads bindet. Im Gegensatz zu den harten Bedingungen während FACS-Sortierung, die magnetisch markierten DE-ähnlichen Zellen können dann leicht in einem Benchtop-Format gereinigt werden, um eine sanfte Reinigungsverfahren verwendet wird. Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode zur Entfernung von Zellpopulationen, die die DE Differenzierungsprozess widerstanden.

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Protokoll

1. Differenzierung humaner ESC in Richtung Definitive Endoderm

1. Kultivieren humaner embryonaler Stammzellen ( ES- Zellen) in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Mantel ein neues 6-Well-Zellkulturplatte mit 1 ml einer Basalmembranmatrix und brüten die Kultur-ware für mindestens 30 min bei RT. Für spezielle Informationen wenden Sie sich an die Anweisungen des jeweiligen Herstellers.
3. Bestätigen Sie, dass die kultivierten menschlichen WSR 80% -90% Konfluenz unter dem Mikroskop erreicht haben eine geringe Vergrößerung (zB, 4X). Anzusaugen, das Medium aus den Hohlräumen durch das Medium mit einer sterilen Pasteur-Glaspipette Absaugen. Waschen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -Lösung. Dazu werden 2 ml PBS in jede Vertiefung sanft die Platte schütteln und die Lösung absaugen, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
4. 1 ml der enzymfreien Passagierung Lösung Reagenz für sanfte Dissoziation von Zellclustern. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C eind 5% CO ₂ , bis die Zellen deutliche Anzeichen einer Störung in kleinen Clustern zeigen.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit auf dem Reagenz hängt verwendet. Für die enzymfreie Passagierbarkeit Lösung in dem Materialien Abschnitt erwähnt, ist die Inkubationszeit etwa 7 min.
5. 1 ml DMEM / F-12-Medium und stören die verbleibenden Zellaggregate in einzelne Zellen durch Pipettieren nach oben und unten eine 1 ml Pipettenspitze. Verwenden, die Zellen von der Oberfläche zu spülen und die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen übertragen. Um alle Zellen abrufen, waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DMEM / F-12-Medium und fügen Sie das Medium zu dem Zentrifugenröhrchen.
6. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 300 x g. Den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen in 5 ml ES-Zellkulturmedium 10 uM Rho-Kinase (ROCK) Inhibitor enthält.
7. Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Zählkammer und Samen 150.000 - 400.000 Zellen pro 6-well oder in einem anderen Plattenlayout, abhängig von der ES-Zelllinie verwendet. Verwenden culture - Medium , das 10 uM ROCK Inhibitor der Apoptose und Kultur der Zellen in einem Inkubator zu vermeiden , bei 37 ° C und 5% CO _2.
8. Etwa 24 Stunden nach der absaugen das Medium mit einer sterilen Pasteur-Glaspipette Säen und 2 ml Primitivstreifen Induktionsmedium.
   Hinweis: Dieses Medium enthält Endkonzentrationen von 1% Glutamin, 0,2% FCS, 5 uM CHIR-99021 und 50 ng / ml Activin A in Advanced RPMI-1640 - Medium. Üblicherweise verwenden 2 ml Medium für den Anbau in 6-Well-Platten.
9. 48 Stunden nach dem Aussäen, ersetzen Sie das Medium Induktionsmedium zu Entoderm. Pflegen Sie die Zellen in diesem Medium für weitere 48 Stunden mit täglicher Mediumwechsel.
   HINWEIS: Dieses Medium enthält 1% Glutamin, 0,2% FCS und 50 ng / ml Activin A in Advanced RPMI-1640 - Medium. Die Zellen, die in Richtung der endgültigen endoderm begangen werden, um die Oberflächenmarker CXCR4 exprimieren. Die Färbung von CXCR4 kann verwendet werden, um die Anzahl der DE-determinierten Zellen zu quantifizieren.

2. Anfärben von CXCR4 + Definitive Entodermzellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

1. Für den letzten 24 Stunden, aber mindestens 1 Stunde vor der Ernte die Zellen werden 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor zu dem Kulturmedium.
2. Bestreichen Sie die Zellkultur-ware, die zur Wiederverwendung Impfen mit einer Basalmembranmatrix verwendet werden, das heißt, 12-Well - Platten für die qPCR - Analyse oder eine Kammer Dias für Immunfluoreszenzanfärbung. Inkubieren der Platten oder Folien für mindestens 30 min bei RT.
3. Anzusaugen, das Medium mit einer sterilen Pasteur-Glaspipette aus den Vertiefungen der differenzierten Zellen verwendet zum Färben und / oder sortiert werden.
4. 1 ml enzymfreien Passagierung Lösung Reagens zur schonenden Spaltung von Zellclustern. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ , bis die Zellen deutliche Anzeichen einer Störung in kleinen Clustern zeigen.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit auf dem Reagenz hängt verwendet. Für die enzymfreien Passagierung Lösung im Materi erwähntals Abschnitt, ist die Inkubationszeit etwa 7 min.
5. 1 ml DMEM / F-12-Medium und stören verbleibenden Zellaggregate in einzelne Zellen durch Pipettieren nach oben und unten eine 1 ml-Spitze mit. Verwenden, die Zellen von der Oberfläche zu spülen und die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen übertragen. Um alle Zellen abrufen, waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DMEM / F-12-Medium w / o FCS und fügen Sie das Medium zu dem Zentrifugenröhrchen.
6. Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Zählkammer. Zellen von drei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen in 10-15 x 10 ⁶ Zellen nach drei Tagen der Differenzierung führen. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 300 x g.
   HINWEIS: Die genaue Zahl der erhaltenen Zellen wird auf der pluripotenten Zelllinie für die Differenzierung verwendet abhängen.
7. Den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen in PEB-Puffer 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor enthält. Verwenden von 100 & mgr; l dieses Puffers für bis zu 10 ⁷ Zellen. Fügen Sie die 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor am Tag der staining. Verwenden Sie diesen Puffer für alle Downstream-Anwendungen (bezeichnet als PEB-Puffer + RI).
   HINWEIS: PEB - Puffer 0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS enthält. Wenn mehr Zellen werden gefärbt sind, justieren Sie entsprechend den Puffervolumen.
8. In 10 ul eines CXCR4-APC - Antikörper pro 10 ⁷ Zellen in 100 & mgr; l, das entspricht etwa einer Verdünnung von 1:10.
   HINWEIS: Die Verwendung eines APC-verknüpften Antikörper ist nicht zwingend. Stattdessen kann es verwendet in Abhängigkeit von den Mikrokugeln ersetzt werden. Wenn mehr Zellen entsprechend den Antikörper Volumen gefärbt werden sind einzustellen.
9. Mischen Sie vorsichtig den Schlauch mit den Fingern blätterte und Inkubation bei 4 ° C im Kühlschrank für 15 min. Resuspendieren der Zellen mit 1-2 ml PEB-Puffer. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 300 x g.
10. Saugen Sie den Überstand mit einer sterilen Pasteur - Glaspipette und Zellpellet in 80 ul PEB pro 10 ⁷ Zellen und fügen Sie 20 ul anti-APC - Mikrokügelchen.
    HINWEIS: Wenn mehr Zellen werden gefärbt sind, stellen Sie die Mikroperlen Volumen entsprechend.
11. Mischen Sie vorsichtig den Schlauch mit den Fingern blätterte und Inkubation bei 4 ° C im Kühlschrank für 15 min. Resuspendieren der Zellen mit 1-2 ml PEB-Puffer + RI. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 300 x g. Absaugen den Puffer. Resuspendieren in 500 ul PEB-Puffer + RI.

3. Magnetische Trennung von CXCR4 + Zellen

1. Legen Sie eine mittlere magnetische Säule in einem Magnetfeld nach Herstellung Anweisungen. Vorspülen der Säule mit 500 ul PEB-Puffer + RI. Tragen Sie die gesamte Zellsuspension auf die Säule. Sammeln Sie die Strömung durch, da nicht alle Zellen an die Säule binden. Achten Sie darauf, nicht die Spalten für eine optimale Wiedergewinnung von CXCR4 + Zellen zu stören.
2. Die Säule wird dreimal mit 500 ul PEB-Puffer + RI. Sammeln Sie die erste Strömung durch und kombinieren es mit den gesammelten Zellen aus Schritt 3.1. Entfernen Sie die Magnetsäule aus dem Magnetfeld und legen Sie sie in eingeeignete Sammelröhrchen. 1 ml PEB-Puffer + RI auf die Säule. Zum Eluieren die Zellen drücken Sie fest um den Kolben in die Säule.
3. Optional: Sammeln Sie alle Fluss durch Proben getrennt und verwenden 20 ul jeweils die Anzahl der CXCR4 + Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Ihre Zahl sollte mit jedem Waschschritt zurückgehen.
   HINWEIS: Mindestens 2 x 10 ⁴ lebensfähig, sollte gated Zellen für zuverlässige Ergebnisse gezählt werden.
4. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,3 mit dem gesammelten Strom durch Probe aus Schritt 3.1 und der ersten Strömung durch Probe aus Schritt 3.2 eine neue Spalte. Sie nicht die vorherige Spalte wiederverwenden. Durch die Verwendung der Kolben Luft in die Säule gedrückt werden, es blockier.
5. Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Zählkammer. Abhängig von der Effizienz der Differenzierung von bis zu 6 x 10 ⁶ Zellen kann zunächst und noch 1 x 10 ⁶ Zellen sortiert werden , indem eine zweite Spalte bei 10 ⁷ Zellen für das Verfahren.
6. Zentrifugieren der Zellen bei 300 xg für 5 min. Absaugen und der Überstand wird mit einer sterilen Pasteur-Glaspipette und Resuspendieren der Zellen in 1 ml Endoderm Induktionsmedium aus Schritt 1.9 mit zusätzlichen 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor.
7. Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Zählkammer. Seed die Zellen bei einer geeigneten Dichte, dh ~ 4 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung einer 12-Well - Platte (ca. 3,6 cm ² Fläche) oder ~ 1,5 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung eines 8-Well - Kammer-Folie.

4. Optional: Analyse von gereinigtem Definitive Endoderm Bevölkerung

1. Für Immunfluoreszenzanfärbung fixieren die gereinigten Zellen aus Schritt 3.7 in etwa 24 Stunden nach der mit 4% Paraformaldehyd und Beize für die endgültige Endoderm (DE) und / oder Pluripotenz Markerproteine ​​Aussaat.
   HINWEIS: Häufig verwendete DE Marker umfassen FOXA2 und SOX17, häufig verwendete Pluripotenz Marker umfassen OCT3 / 4, NANOG und SOX2 ^{6, 8.}
2. for RT-qPCR-Analyse, ernten die gereinigten Zellen direkt oder 24 h nach dem Aussäen extrahieren Total-RNA und transkribieren Reverse-cDNA aus den extrahierten Gesamt-RNA-Proben. Verwenden , 10 ng cDNA als Matrize pro RT-qPCR - Reaktion (Triplikaten) ^6, um die Expression von DE und Pluripotenz Markergene ⁸ zu analysieren.
   HINWEIS: Häufig verwendete Markergene werden in Schritt 4.1 erwähnt. Zyklusbedingungen sind 5 min bei 95 ° C und 40 Zyklen von 15 sec bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C, gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse.

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Ergebnisse

Bei der Differenzierung WSR laufen drastischen Veränderungen in der Gen und Proteinexpression. Figur 1 typische Markergene darstellt , die verwendet werden können , eine erfolgreiche Endoderm Differenzierung zu verifizieren. Prime Ziele für eine Genexpressionsanalyse sind GSC, FOXA2 und SOX17. In einer relativen Analyse der Genexpression insbesondere FOXA2 und SOX17 erhöht von> 2.000 - fache , wenn si...

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Diskussion

Derzeit verwendete Differenzierungsprotokolle ergeben sich selten 100% differenzierte Zellen. Aus Gründen, die noch einige Zellen angesprochen werden müssen widerstehen, den Differenzierungsprozess. Abhängig von der Effizienz der verwendeten Differenzierungsprotokoll und die Neigung des ESC Zeile eine bestimmte Anzahl von Rest pluripotenten Zellen häufig beobachtet werden, selbst nach der Differenzierung in die definitive Entoderm. Diese Restzellen können nachgeschaltete Differenzierungen beeinträchtigen oder weit...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 human embryonic stem cell line	Harvard Department of stem cell & regenerative biology		Suitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell line	ES Cell International		Suitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC culture medium
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	magnetic field
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK inhibitor
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stemcell Technologies	7174	Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately.
MS Columns	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Technologies
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan assay	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R&D Systems	AF1924