Быстрый и эффективный метод для очистки эндодермы клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека

Резюме

Здесь мы опишем метод очистки дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека, которые совершаются по отношению к окончательному энтодермы для улучшения последующих применений и дальнейших дифференцировок.

Аннотация

Возможности дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) позволяют потенциальное терапевтическое применение для клеточной заместительной терапии. Терминально дифференцированных типов клеток могут быть использованы для лечения различных дегенеративных заболеваний. В пробирке дифференцировки этих клеток по отношению к тканям легких, печени и поджелудочной железы требует в качестве первого шага генерации окончательных эндодермы клеток. Этот шаг является ограничивающим скорость для дальнейшей дифференциации по отношению к неизлечимо созревших типов клеток, таких как инсулин-продуцирующих бета-клеток, гепатоцитов или других эндодермы типов клеток. Клетки, которые совершаются в направлении энтодермы линии высоко выражают множество транскрипционных факторов, таких как Foxa2, SOX17, HNF1B, члены семьи GATA, и поверхностный рецептор CXCR4. Тем не менее, протоколы дифференциации редко эффективны на 100%. Здесь мы опишем метод для очистки популяции CXCR4 + клеток после дифференцировкив ДЭ с использованием магнитных микрогранул. Эта очистка дополнительно удаляет клетки нежелательных линий. Метод нежной очистки является простым и надежным и может быть использовано для улучшения вниз по течению приложений и дифференциацию.

Введение

Плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают способностью дифференцироваться в практически любой тип клеток человеческого организма. Таким образом, экстракорпоральное протоколы дифференцировки могут быть использованы для создания многочисленных типов зрелых клеток , таких как кардиомиоциты ^1, гепатоциты ^2, бета - клетки, эпителиальные ³ легких ⁴ или ⁵ нейрональных клеток. Это делает ESCS ценным инструментом для потенциального лечения различных дегенеративных заболеваний ^3.

Дифференциация в пробирке ЭСК в сторону взрослых тканей легких, печени и поджелудочной железы требует псевдо-гаструляции в клетки , напоминающие окончательное энтодермы (DE) ^6. Так как ниже по течению дифференциации по отношению к вышеупомянутым типов соматических клеток значительно менее эффективно, оптимальная дифференциация эндодермы рассматривается как ограничивающий скорость ^7. Клетки, которые совершаются в направлении энтодермы линии подвергаются тяracteristic изменения в их профиля экспрессии генов. Гены мастер Плюрипотентность регулятора вниз регулируется, тогда как экспрессия других факторов транскрипции , таких как Foxa2, SOX17, HNF1B, членов семейства GATA и поверхностного рецептора CXCR4 высоко активируемых ^{6, 8, 9.} CXCR4 , как известно, трансактивируется по SMAD2 / 3, ниже по потоку Узловое сигнализации / TGF-бета и SOX17 из - за специфических участков связывания в его промоторной области ^10. Таким образом , это очень подходит маркер , используемый в ряде докладов ^{6, 8, 11-13.} Эти изменения экспрессии отражает событие псевдо-гаструляции, в которой ЭСК сначала приобрести характеристики первичной полоски типа клеточной популяции , а затем совершить в энтодермы зародышевого слоя ^6.

Тем не менее, протоколы дифференциации редко 100% эффективны , как несколько клеток могут сопротивляться процессу дифференциации или дифференциации по отношению к другим непредвиденным родословных ^14. Эти клетки могут отрицательно influeсть дальнейшая дифференциация. Кроме того, остаточные недифференцированные клетки питают большие риски для последующих экспериментов по трансплантации и может привести к тератомы ^15-17.

Чтобы удалить эти нежелательные клетки на ранней на поверхности маркера CXCR4 может быть использован для очистки клеток, которые совершаются в направлении DE ^18. Здесь мы опишем метод позитивного отбора CXCR4 + клеток от дифференциации культур DE. Для этого поверхность маркер CXCR4 связывается с антителом, которое затем, в свою очередь связывается с магнитными микрогранул. В отличие от жестких условий во время FACS сортировки, Магнитно меченых DE-подобные клетки могут затем легко быть очищены в формате стендовых, используя щадящий метод очистки. Этот протокол обеспечивает простой способ удаления клеточных популяций, противоставших процесса дифференцировки DE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Дифференциация человека ESC к Definitive энтодермы

1. Выращивают человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в термостате при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
2. Coat новый 6-луночный культуральный планшет с 1 мл матрицы базальной мембраны и инкубировать культуры стеклотару в течение по крайней мере 30 минут при комнатной температуре. Для конкретных деталей просьба обращаться к инструкции соответствующего изготовителя.
3. Убедитесь , что культивированные человеческие стволовые клетки достигли 80% -90% слитности под микроскопом с использованием низкой кратности (например, 4X). Аспирируйте среды из полостей путем отсасывания среды с стерильную стеклянную пипетку Пастера. Промывают клетки один раз фосфатным буферным раствором солевого раствора (PBS). Для этого, добавьте 2 мл PBS в каждую лунку мягко встряхните тарелку и отсасывать раствора для удаления мертвых клеток и клеточных обломков.
4. Добавьте 1 мл реагента пассажи раствора фермента бесплатно для бережной диссоциации клеточных кластеров. Инкубируйте клетки при 37 ° С А.Н.d 5% CO ₂ до тех пор , пока клетки не показывают явные признаки разрушения на мелкие кластеры.
   Примечание: в зависимости от используемого реагента Время инкубации. Для ферментного раствора без пассирования, указанного в разделе Материалы, время инкубации составляет примерно 7 мин.
5. Добавляют 1 мл DMEM / F-12 среду и разрушают оставшиеся клеточных агрегатов на отдельные клетки пипетированием вверх и вниз с помощью пипетки 1 мл. Используйте это, чтобы промыть клетки с поверхности и перенести клетки в центрифужную пробирку. Чтобы получить все клетки, промойте каждую лунку с 1 мл DMEM / F-12 среды и добавить среду в центрифужную пробирку.
6. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 300 х г. Аспирируйте супернатант и клетки вновь суспендируют в 5 мл ES клеточной культуральной среде, содержащей 10 мкМ Rho-киназы (ROCK) ингибитор.
7. Подсчитайте клетки под микроскопом использованием гемоцитометра и семян 150000 - 400000 клеток на 6-луночных или в другой компоновщик пластины, в зависимости от клеточной линии ES, используемой. Использование кульTURE среде , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ , чтобы избежать апоптоза и культивирования клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
8. Примерно 24 ч после посева аспирата среду с помощью стерильной стеклянной Пастера пипетку и добавьте 2 мл первичной полоски индукционной среде.
   Примечание: Эта среда содержит конечные концентрации 1% глутамина, 0,2% FCS, 5 мкМ Чир-99021 и 50 нг / мл активина А в Advanced RPMI-1640. Как правило, используют в 2 мл среды для культивирования в 6-луночных планшетах.
9. 48 ч после посева, замените носитель на энтодермы индукционную среду. Культивировать клетки в этой среде в течение еще 48 часов с ежедневной сменой среды.
   Примечание: Эта среда содержит 1% глутамина, 0,2% FCS и 50 нг / мл активин А в Advanced RPMI-1640 среде. Клетки, которые совершаются по отношению к окончательному энтодермы выразить поверхностный маркер CXCR4. Окрашивание CXCR4 может быть использован для количественного определения количества ДЕ-совершенных клеток.

2. Окрашивание CXCR4 + Definitive эндодермы клеток для анализа потока цитометрии

1. Для последнего 24 ч, но не менее 1 ч до сбора клеток добавляют ингибитор ROCK 10 мкМ в культуральную среду.
2. Покрыть клеточной культуры посуда , которая будет использоваться для повторного сева с матрицей базальной мембраны, то есть, 12-луночные планшеты для анализа или камеры слайдов КПЦР для иммунофлуоресцентного окрашивания. Инкубируйте пластин или слайды в течение по крайней мере 30 минут при комнатной температуре.
3. Аспирируйте среду со стерильной стеклянной пастеровской пипеткой из скважин дифференцированных клеток, используемых для окрашивания и / или сортировки.
4. Добавьте 1 мл реагента пассажи раствора фермента бесплатно для бережной диссоциации клеточных кластеров. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO ₂ до тех пор , пока клетки не показывают явные признаки разрушения в небольшие кластеры.
   Примечание: в зависимости от используемого реагента Время инкубации. Для ферментного раствора без пассирования упомянутого в материаALS раздел, время инкубации составляет примерно 7 мин.
5. Добавляют 1 мл DMEM / F-12 среду и разрушают оставшиеся клеточные агрегаты на отдельные клетки пипетированием вверх и вниз с помощью 1 мл кончик. Используйте это, чтобы промыть клетки с поверхности и перенести клетки в центрифужную пробирку. Для того, чтобы получить все клетки, промойте каждую лунку с 1 мл DMEM / F-12 среды без FCS и добавить среду в центрифужную пробирку.
6. Граф клеток под микроскопом с использованием гемоцитометра. Клетки из трех лунках 6-луночного планшета должно привести к 10-15 х 10 ⁶ клеток после трех суток дифференцировки. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 300 х г.
   Примечание: Точное количество полученных клеток будет зависеть от линии плюрипотентных клеток , используемых для дифференциации.
7. Аспирируйте супернатант и клетки вновь суспендируют в буфере, содержащем ПЭБ ингибитор ROCK 10 мкМ. Используйте 100 мкл этого буфера до 10 ⁷ клеток. Добавить ингибитор раскачивать 10 мкМ в день stainiнг. Используйте этот буфер для всех последующих применений (называемый ПЭБ буфер + RI).
   Примечание: ПЭБ буфер содержит 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 2 мМ ЭДТА в PBS. Если больше клетки должны быть окрашены, регулировать громкость буфера соответственно.
8. Добавьте 10 мкл антитела CXCR4-АРС на 10 ⁷ клеток в 100 мкл, это примерно представляет собой разведение 1:10.
   Примечание: Использование БТР-связанного антитела не является обязательным. Вместо того, чтобы его можно заменить в зависимости от используемых микрошариков. Если все большее число клеток окрашиваться регулировать громкость антител соответственно.
9. Смешать, осторожно переворачивая трубку с пальцами и инкубировать при температуре 4 ° С в холодильнике в течение 15 мин. Ресуспендируют клеток с 1-2 мл буфера ПЭБ. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 300 х г.
10. Аспирируйте супернатант со стерильным стеклянным Пастера пипетку и ресуспендируют осадок клеток в 80 мкл PEB на 10 ⁷ клеток и добавляют 20 мкл анти-APC микрогранулы.
    ЗАМЕТКА: Если больше клетки должны быть окрашены, отрегулировать громкость микро-шарик соответственно.
11. Смешать, осторожно переворачивая трубку с пальцами и инкубировать при температуре 4 ° С в холодильнике в течение 15 мин. Ресуспендируют клеток с 1-2 мл буфера ПЭБ + RI. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 300 х г. Аспирируйте буфер. Ресуспендируют в 500 мкл буфера ПЭБ + RI.

3. Магнитное разделение CXCR4 + клеток

1. Место среднего размера магнитного колонки в магнитном поле в соответствии с инструкциями производства. Предварительно промыть колонку с 500 мкл буфера ПЭБ + RI. Нанести всю клеточную суспензию в колонку. Собирают поток через так как не все клетки связываются с колонкой. Убедитесь в том, чтобы не нарушить столбцы для оптимального извлечения CXCR4 + клеток.
2. Промыть колонку три раза с 500 мкл буфера ПЭБ + RI. Возьмите первый поток через и объединить его с собранных клеток со стадии 3.1. Удалите магнитную колонку из магнитного поля и поместить его вподходящей коллекции трубки. Добавить 1 мл буфера PEB + RI на колонку. Для элюирования клетки плотно прижимать плунжер в колонну.
3. Дополнительно: Собрать все поток через образцы отдельно и использовать 20 мкл каждого для анализа количество CXCR4 клеток + с помощью проточной цитометрии. Их число должно уменьшаться с каждым шагом промывки.
   Примечание: По крайней мере , 2 х 10 ⁴ жизнеспособны, забор с воротами клетки должны быть подсчитаны для получения надежных результатов.
4. Повторите шаги 3.1-3.3 с собранными потока через образец из шага 3.1 и первого потока через образец со стадии 3.2, используя новый столбец. Не повторно использовать предыдущий столбец. С помощью плунжера воздух нагнетается в колонну, которая блокирует его.
5. Граф клеток под микроскопом с использованием гемоцитометра. В зависимости от эффективности дифференцировке до 6 х 10 ⁶ клеток могут быть отсортированы сначала и еще 1 х 10 ⁶ клеток с помощью второго столбца при использовании 10 ⁷ клеток для процедуры.
6. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Отберите супернатант и стерильной стеклянной Пастера пипетку и ресуспендирования клеток в 1 мл эндодермы индукции среды со стадии 1.9 с дополнительным ингибитором ROCK 10 мкМ.
7. Граф клеток под микроскопом с использованием гемоцитометра. Семенной клетки при соответствующей плотности, т.е. ~ 4 × 10 ⁵ клеток на лунку 12-луночного планшета (ок. 3,6 см ² поверхности) или ~ 1,5 × 10 ⁵ клеток на лунку 8-и камерного горкой.

4. Необязательно: Анализ Очищенный Definitive энтодермы населения

1. Для окрашивания иммунофлюоресценции фиксируют очищенные клетки от стадии 3,7 примерно 24 ч после посева с 4% параформальдегидом и пятна для окончательного энтодермы (DE) и / или плюрипотентности маркерных белков.
   Примечание: Обычно используемые DE маркеры включают Foxa2 и SOX17, обычно используемые маркеры плюрипотентности включают Oct3 / 4, NANOG и SOX2 ^{6, 8.}
2. FoАнализ г RT-КПЦР, собрать очищенные клетки непосредственно или 24 ч после посева, извлечения общей РНК и обратной транскрипции кДНК из извлеченных образцов общей РНК. Используйте 10 нг кДНК в качестве матрицы в реакции RT-КПЦР (трехкратном повторе) для анализа экспрессии DE и плюрипотентности маркеров генов ^{6, 8.}
   Примечание: Обычно используемые маркерные гены упоминаются в шаге 4.1. Условия цикла 5 мин при 95 ° С и 40 циклов 15 с при 95 ° С и 1 мин при 60 ° С, с последующим расплавлением анализа кривых.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

При дифференциации Стволовые клетки претерпевают резкие изменения в гене и экспрессии белка. На рисунке 1 представлена ​​типичные гены - маркеры , которые могут быть использованы для проверки успешной дифференциации энтодермы. Prime цели для анализ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В настоящее время используются протоколы дифференциации редко приводят к 100% дифференцированных клеток. По причинам, которые еще должны быть решены некоторые клетки сопротивляются процесса дифференцировки. В зависимости от эффективности используемого протокола дифференцировки и Ск...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 human embryonic stem cell line	Harvard Department of stem cell & regenerative biology		Suitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell line	ES Cell International		Suitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC culture medium
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	magnetic field
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK inhibitor
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stemcell Technologies	7174	Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately.
MS Columns	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Technologies
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan assay	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R&D Systems	AF1924