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要約

ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。

要約

このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞の分化能力は、細胞置換療法のための潜在的治療用途を可能にします。分化した細胞型は、種々の変性疾患の治療のために使用することができる。、肺、肝臓、および膵臓の組織に向かって、これらの細胞のインビトロ分化は、第一段階として、決定的な内胚葉細胞の生成を必要とします。このステップは、レート制限などのインスリン産生β細胞、肝細胞または他の内胚葉由来の細胞型として末端成熟した細胞型に向けてさらなる分化のためのものです。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、非常にそのようなFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバー、および表面受容体CXCR4のような転写因子の多くを表現します。しかし、分化プロトコルはめったに100％効率的ではありません。ここでは、分化後のCXCR4 +細胞集団の精製のための方法を説明します磁性マイクロビーズを使用して、DEへ。この精製は、さらに不要な系統の細胞を除去します。穏やかな精製方法は、迅速で信頼性が高く、下流側のアプリケーションと分化を改善するために使用されるかもしれません。

概要

このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞は、ヒトの身体の実質的に任意の細胞型に分化する能力を有します。したがって、in vitroでの分化プロトコルは、心筋1、肝細胞2、β細胞3、肺上皮4または神経細胞5のような多数の成体細胞型を生成することができます。これは、様々な変性疾患3の潜在的な治療のためのESCの貴重なツールとなります。

肺、肝臓と膵臓の成体組織に向かってESCのインビトロ分化は、胚体内胚葉（DE）6を連想させる細胞への擬似原腸形成を必要とします。上記の体細胞型に向かって下流分化は著しく効率が低いので、最適な内胚葉分化は律速7とみなされます。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、茶を受けますそれらの遺伝子発現プロファイルのracteristic変化。例えばFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバーと表面受容体CXCR4のような他の転写因子の発現は非常6、8、9を上方制御される一方、多能性マスター調節遺伝子がダウンレギュレートされている。CXCR4はSMAD2によりトランスされることが知られています、そのプロモーター領域10内の特定の結合部位へのノーダル/ TGF-βシグナルとSOX17の下流/ 3、。したがって、レポート6、8、11〜13の数で使用される非常に適したマーカーです。これらの発現変化のESCが第原始線条様細胞集団の特性を獲得し、その後、内胚葉の胚層6にコミットする擬似原腸形成のイベントを反映しています。

少数の細胞が分化過程をレジストや他の意図しない系統14に分化することができるようしかし、分化プロトコルはめったに100％効率的ではありません。これらの細胞は、負influeありNCEさらなる分化。また、残余の未分化細胞は、後の移植実験のための大きなリスクを保有し、奇形腫15-17を生じさせる可能性があります。

早期に表面マーカーCXCR4 DE 18に向けてコミットされた細胞の精製に使用することができ、これらの不要な細胞を除去するために。ここでは、DE分化培養からのCXCR4 +細胞の正の選択のための方法を説明します。このため、表面マーカーCXCR4は、その後今度は、磁気マイクロビーズに結合する抗体によって結合されます。 FACS選別中過酷な条件とは異なり、磁気的に標識されたDE細胞様細胞は、その後、簡単に優しい精製法を用いて、ベンチトップ形式で精製され得ます。このプロトコルは、DE分化プロセスに抵抗する細胞集団を除去するための簡単​​な方法を提供します。

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プロトコル

胚体内胚葉に向けたヒトESCの1分化

  1. 37℃のインキュベーター中でヒト胚性幹細胞（ESC）を育成し、5％CO 2。
  2. コー​​ト基底膜マトリックス1mlの新たな6ウェル細胞培養プレート、室温で少なくとも30分間培養ウェアインキュベートします。具体的な詳細については、各メーカーの指示に回してください。
  3. 培養したヒトESCは、低倍率（ 例えば、4X）を使用して、顕微鏡下で80％-90％の密集度に達していることを確認してください。滅菌ガラスパスツールピペットで培地をオフに吸引することにより空洞から培地を吸引除去します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で1回細胞を洗浄します。このために、そっと各ウェルに2mlのPBSを追加し、プレートを振盪し、死細胞及び細胞破片を除去するために溶液を吸います。
  4. 細胞クラスターの穏やかな解離のための無酵素継代液試薬の1ミリリットルを追加します。 37°C ANで細胞をインキュベートD 5％CO 2の細胞は小さなクラスターに混乱の明確な兆候を示すまで。
    注：インキュベーション時間は、用いる試薬によって異なります。材料の項で述べた無酵素継代溶液について、インキュベーション時間はおよそ7分です。
  5. 1ミリリットルDMEM / F-12培地を加え、ピペッティングにより、1mlのピペットチップを使用してダウン単一細胞に残った細胞凝集体を崩壊させます。表面から細胞を洗い流し、遠心チューブに細胞を転送するために使用します。すべてのセルを取得するには、DMEM / F-12培地の1ミリリットルで各ウェルを洗浄し、遠心チューブに培地を追加します。
  6. G×300で5分間、細胞を遠心。吸引した上清および10μMのRhoキナーゼ（ROCK）阻害剤を含む5 mLのES細胞培養用培地中で細胞を再懸濁します。
  7. 血球計数器を用いて顕微鏡下で細胞を計数150,000シード - 使用するES細胞系に応じて、6ウェルあたりまたは他のプレートレイアウト40万細胞。 CULを使用してください37℃のインキュベーター内で細胞を、5％CO 2、アポトーシスや文化を避けるために、10μMのROCK阻害剤を含むトゥーレ媒体。
  8. 約24時間滅菌ガラスパスツールピペットで培地を吸引を播種し、原始線条誘導培地の2ミリリットルを追加した後。
    注：この培地は高度なRPMI-1640培地中で1％グルタミン、0.2％FCS、5μMCHIR-99021および50 ngの/ mlのアクチビンAの最終濃度が含まれています。一般的に、6ウェルプレートで培養に2mlの培地を使用します。
  9. 48時間播種した後、誘導培地を内胚葉する培地を交換してください。毎日培地交換を持つ別の48時間この培地中で細胞を培養。
    注：この培地は、1％グルタミン、0.2％FCSおよび高度なRPMI-1640培地中で50 ngの/ mlのアクチビンAが含まれています。胚体内胚葉に向けてコミットされた細胞は、表面マーカーCXCR4を発現します。 CXCR4の染色は、DE-コミットした細胞の数を定量するために使用することができます。
2。 CXCR4 +フローサイトメトリー分析のための胚体内胚葉細胞の染色

  1. 収穫前の最後の24時間が、少なくとも1時間のために、細胞を培養培地に10μMのROCK阻害剤を追加します。
  2. コート基底膜マトリックスで再播種するために使用される細胞培養ウェア、qPCR分析または免疫蛍光染色のためにチャンバースライドのため、すなわち、12ウェルプレート。 RTで少なくとも30分間、プレートまたはスライドをインキュベートします。
  3. 染色および/またはソートに使用分化した細胞のウェルから滅菌ガラスパスツールピペットで培地を吸引除去します。
  4. 細胞クラスターの穏やかな解離のための無酵素継代液試薬の1ミリリットルを追加します。細胞は小さなクラスターに混乱の明確な兆候を示すまで37℃で細胞を、5％CO 2をインキュベートします。
    注：インキュベーション時間は、用いる試薬によって異なります。 materiに記載された無酵素継代ソリューションのためのALS部は、インキュベーション時間はおよそ7分です。
  5. 1ミリリットルDMEM / F-12培地を加え、ピペッティングにより、1mlのチップを使用してダウン単一細胞に残った細胞凝集体を崩壊させます。表面から細胞を洗い流し、遠心チューブに細胞を転送するために使用します。すべてのセルを取得するには、/ FCS OワットDMEM / F-12培地の1ミリリットルで各ウェルを洗浄し、遠心チューブに培地を追加します。
  6. 血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。 6ウェルプレートの3つのウェルからの細胞は、分化の3日後に10〜15×10 6個の細胞をもたらすはずです。 G×300で5分間、細胞を遠心。
    注：得られた細胞の正確な数は、分化のために使用される多能性細胞株に依存するであろう。
  7. 上清を吸引除去し、10μMのROCK阻害剤を含むPEBバッファーで細胞を再懸濁します。最大10 7個の細胞のために、この緩衝液100μlを使用してください。 stainiの日に10μMのROCK阻害剤を追加します。ngの。 （PEBバッファー+ RIと呼ばれる）すべてのダウンストリームアプリケーションのためにこのバッファを使用します。
    注：PEBバッファーは、0.5％のBSA、PBS中2mMのEDTAが含まれています。より多くの細胞を染色する場合は、それに応じてバッファ量を調整します。
  8. 100μl中10 7個の細胞当たりCXCR4-APC抗体を10μlを追加し、これは、およそ1:10希釈を表します。
    注：APC結合抗体の使用は必須ではありません。その代わりに、使用されるマイクロビーズに応じて置換され得ます。より多くの細胞を染色する場合に応じて、抗体の音量を調整します。
  9. 軽く指でチューブを反転することにより混合し、15分間冷蔵庫で4℃でインキュベートします。 1〜2ミリリットルPEBバッファーで細胞を再懸濁します。 G×300で5分間、細胞を遠心。
  10. 滅菌ガラスパスツールピペットで上清を吸引除去し、10 7個の細胞あたり80μlのPEBに細胞ペレットを再懸濁し、20μlの抗APCマイクロビーズを追加します。
    注意： 、それに応じてマイクロビーズ音量を調整します。
  11. 軽く指でチューブを反転することにより混合し、15分間冷蔵庫で4℃でインキュベートします。 1〜2ミリリットルPEBバッファー+ RIを用いて細胞を再懸濁します。 G×300で5分間、細胞を遠心。バッファを吸引します。 500μlのPEBバッファー+ RIで再懸濁。

CXCR4 +細胞の3磁気分離

  1. 製造指示に従って磁界の中型の磁気カラムを配置します。 500μlのPEBバッファー+ RIでカラムを事前にすすぎます。列に全体の細胞懸濁液を適用します。カラムに結合するようではないすべてのセルを通過する流れを収集します。 CXCR4 +細胞の最適な検索のために列を乱さないことを確認してください。
  2. 500μlのPEBバッファー+ RIでカラムを3回洗浄します。介して第1の流れを収集し、ステップ3.1から採取した細胞とそれを組み合わせます。磁場から磁気カラムを削除し、それを配置します適切なコレクションチューブ。 1ミリリットルPEBバッファー+ RIをカラムに追加します。細胞を溶出するためには、しっかりと列にプランジャーを押し下げます。
  3. オプション：別途サンプルを介してすべての流れを収集し、フローサイトメトリーを用いて、CXCR4 +細胞の数を分析するために20μlのそれぞれを使用しています。その数は、すべての洗浄工程で辞退すべきです。
    注：少なくとも2×10 4生存し、ゲート細胞は、信頼性の高い結果を得るためにカウントする必要があります。
  4. 繰り返しますが、ステップ3.1と新しいカラムを用いて、ステップ3.2からのサンプルを通る第一の流からサンプルを通る収集・フローで3.1から3.3の手順。前回のコラムを再使用しないでください。プランジ​​ャ空気を使用しているブロックをカラムに押し込まれます。
  5. 血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。分化の効率に応じて最大6×10 6細胞を、手順10 7個の細胞を使用する場合に第二のカラムを使用して最初にソートされ、他の1×10 6細胞であり得ます。
  6. 5分間、300×gで細胞を遠心。吸引した上清と滅菌ガラスパスツールピペットを持つと追加10μMのROCK阻害剤でステップ1.9から1ミリリットル胚葉誘導培地で細胞を再懸濁します。
  7. 血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。 、適切な密度で細胞をシードすなわち、〜12ウェルプレートのウェルあたり4×10 5細胞（アプリ3.6 cm 2の表面）または〜8ウェルチャンバースライドのウェル当たり1.5×10 5個の細胞。

4.オプション：精製胚体内胚葉人口の分析

  1. 免疫蛍光染色のために、およそ24時間の胚体内胚葉（DE）および/または多能性マーカータンパク質のための4％パラホルムアルデヒドや汚れを接種した後、ステップ3.7から精製された細胞を固定。
    注：一般的に使用されるDEマーカーはFOXA2及びSOX17を含む、一般的に使用される多能性マーカーは、OCT3 / 4、NANOGとSOX2 6、8を含みます。
  2. フォーR RT-qPCR分析、直接精製された細胞を採取するか、播種後24時間、全RNAを抽出し、抽出した全RNAサンプルからcDNAを逆転写。 DEおよび多能性マーカー遺伝子6、8の発現を分析するためにRT-qPCRの反応（三重）あたりを鋳型として10 ngのcDNAを使用してください。
    注：一般的に使用されるマーカー遺伝子は、ステップ4.1に記載されています。サイクル条件は、融解曲線分析に続いて、95℃で5分間及び95℃で15秒間の40サイクル、60℃で1分間です。

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結果

分化すると ESCは、遺伝子およびタンパク質発現の急激な変化を受ける。 図1は、成功した内胚葉分化を確認するために使用することができる代表的なマーカー遺伝子を示します。遺伝子発現解析のための主要な標的は、GSC、FOXA2、及びSOX17ある。未分化のESCと比較した場合の相対的な遺伝子発現解析では、特にFOX...

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ディスカッション

現在使用されて分化プロトコルはほとんど100％に分化した細胞になりません。まだ対処されなければならない理由のために、いくつかの細胞は、分化過程に抵抗します。使用される分化プロトコルの効率とESCの傾向に応じて、残留​​多能性細胞の特定の数は、一般的にさえ胚体内胚葉への分化後に観察されているライン。これらの残留細胞は、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、?...

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開示事項

The authors declare that they have no competing financial interests.

謝辞

ジャスミンKresseの巧みな技術支援を深く感謝されています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Hues8 human embryonic stem cell lineHarvard Department of stem cell & regenerative biologySuitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell lineES Cell InternationalSuitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1Stemcell Technologies5850ESC culture medium
FCSBiowestS1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4)-APC, humanMiltenyi Biotec130-098-357
anti-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109magnetic field
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ROCK inhibitor
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
Gentle Cell Dissociation ReagentStemcell Technologies7174Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*Corning354277basement membrane matrix
* solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12.
Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature.
Remove the matrigel and use immediately.
MS ColumnsMiltenyi Biotec30-042-201
MACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Human FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaagtggaggtctggtt		Life Technologies
Human GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan assayApplied BiosystemsHs00751752_s1
Human SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Life Technologies
Human SOX7 REV
tgcgcggccggtacttgtag		Life Technologies
Human POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggagg		Life Technologies
Human POU5F1 REV
ctgcagtgtgggtttcgggca		Life Technologies
Human Nanog FW
ccgagggcagacatcatcc		Life Technologies
Human Nanog REV
ccatccactgccacatcttct		Life Technologies
Human TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		Life Technologies
Human G6PD REV
cga tga tgc ggt tcc agc cta t 		Life Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R&D SystemsAF1924

参考文献

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  2. Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
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