인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

요약

여기서는 하류 어플리케이션 및 상기 분화의 개선을위한 결정적인 내배엽으로 분화 노력하고 인간 배아 줄기 세포의 정제를위한 방법을 설명한다.

초록

배아 줄기 세포 (는 ESC)와 같은 다 능성 줄기 세포의 분화 능력은 세포 대체 요법에 대한 잠재적 인 치료 적 적용을 허용한다. 말단 분화 세포 유형. 각종 퇴행성 질환의 치료에 사용되는 폐, 간 및 췌장 조직을 향해 이러한 세포의 체외 분화는 첫 단계로 최종 내배엽 세포의 생성을 필요로 할 수있다. 이 단계는 속도 제한 인슐린 - 생산 베타 세포, 간세포 등 내배엽 유래의 세포 유형으로 말단 성숙 세포 유형 향해 더 분화된다. 내배엽 계통을 향해 최선을 다하고 있습니다 세포는 매우 같은 FOXA2, SOX17, HNF1B, GATA 가족의 구성원, 표면 수용체 CXCR4 같은 전사 인자의 군중을 표현한다. 그러나, 분화 프로토콜은 거의 100 % 효율이 없습니다. 여기서는 분화 후 CXCR4 + 세포군의 정제 방법을 서술자기 마이크로 비드를 사용하여 DE에. 이 정제는 또한 원치 않는 계통의 세포를 제거합니다. 부드러운 정제 방법은 신속하고 신뢰성 및 하류 어플리케이션 및 분화를 개선하는 데 사용될 수있다.

서문

배아 줄기 세포 (는 ESC)와 같은 다 능성 줄기 세포는 신체의 거의 모든 세포 유형으로 분화 할 수있는 능력을 가지고있다. 따라서, 생체 외 분화 프로토콜은 심근 ¹ 간세포 ^{2, 3} 베타 세포, 폐 상피 ⁴ 또는 ⁵ 신경 세포 등 다양한 성인 세포 유형을 생성하기 위해 사용될 수있다. 이는 ESC에게 다양한 퇴행성 질환 ^(3)의 잠재적 인 치료를위한 유용한 도구를 만든다.

폐, 간, 췌장의 성인 조직으로는 ESC의 체외 분화는 최종 내배엽 (DE) ⁶ 연상 세포로 의사 낭 배기가 필요합니다. 상기 체세포 유형 하류쪽으로 분화 상당히 비효율적이기 때문에, 최적의 내배엽 분화는 ⁷ 레이트 제한으로 간주된다. 내배엽 계통을 향해 최선을 다하고 있습니다 세포는 차를 받다이들 유전자 발현 프로파일 racteristic 변한다. 능성 마스터 조절 유전자 다운 규제 예 ^9. CXCR4가 된 Smad2 의해 transactivated 것으로 알려져 FOXA2, SOX17, HNF1B, GATA 가족 구성원과 CXCR4 높은 ⁶ 상향 조절되어 표면 ^{수용체 (8)과} 같은 다른 전사 인자의 발현 반면 / 3, 인해 프로모터 영역 ^(10)의 특정 결합 부위에 결절 / TGF-β 신호 및 SOX17의 하류. 따라서 리포트 ^{6, 8, 11 ~ 13의} 번호를 사용 매우 적합한 마커이다. 이러한 발현 변화는 ESC는 먼저 기본 연속 형 세포 집단의 특성을 획득하고이어서 배아 내배엽 층 ^(6)에 투입하는 의사 낭배 이벤트를 반영한다.

몇 세포가 분화 과정에 저항 또는 다른 의도하지 않은 계통 ^(14)으로 구별 할 수있다 그러나, 분화 프로토콜은 거의 100 % 효율이 없습니다. 이러한 세포 부정적인 influe있다후부 더 차별화. 또한, 잔여 미분화 세포는 나중에 이식 실험에 대한 큰 위험을 항구 및 기형 종 ^15-17을 야기 할 수 있습니다.

초기에 표면 마커 CXCR4 드 ^(18)를 향해 최선을 다하고 있습니다 세포의 정제에 사용할 수있는 이러한 원치 않는 세포를 제거합니다. 여기서는 DE 분화 배양에서 CXCR4 + 세포의 양성 선별을위한 방법을 설명한다. 이를 위해 표면 마커 CXCR4 후 다시 자성 마이크로 비드에 결합 된 항체에 의해 결합된다. FACS 정렬 동안 가혹한 조건 달리 자기 표지 DE 같은 세포를 쉽게 부드러운 정제 방법을 사용하여 벤치 탑 형태로 정제 될 수있다. 이 프로토콜은 DE 분화 과정 저항 세포 집단을 제거하기위한 간단한 방법을 제공한다.

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프로토콜

확실한 내배엽으로 인간의 ESC 1. 차별화

1. 37 ℃ 배양기에서 인간 배아 줄기 세포 (는 ESC)를 배양하고, 5 % CO _2.
2. 코트 기저막 매트릭스 1 ㎖와 새로운 6- 웰 세포 배양 접시에 RT에서 적어도 30 분 동안 배양 도자기 부화. 특정 자세한 내용은 각 제조업체의 지침을 켜십시오.
3. 배양 된 인간는 ESC (예 : 4X) 낮은 배율을 사용하여 현미경으로 80 % -90 %의 포화 상태에 도달했는지 확인합니다. 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 매체를 흡입하여 공동의 매체를 기음. 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액으로 한 번 세포를 씻으십시오. 이를 위해 부드럽게 각 웰에 2 ㎖의 PBS를 추가 플레이트를 흔들어 사균 및 세포 파편을 제거하는 용액을 빨아.
4. 세포 클러스터의 부드러운 해리에 대한 효소가없는 계대 솔루션 시약의 1 ML을 추가합니다. 37 ° C 형의 세포를 품어D 5 % CO ₂ 세포가 작은 클러스터로 중단의 명확한 징후를 표시 할 때까지.
   주 : 배양 시간을 사용 시약에 따라 달라집니다. 자료 섹션에서 언급 된 효소가없는 계대 솔루션의 경우, 배양 시간은 약 7 분입니다.
5. 1 ml의 DMEM / F-12 배지를 추가로 pipetting에 의해 1 ML의 피펫 팁을 사용하여 아래 하나의 세포에 남아있는 세포 집합체을 방해. 표면으로부터 세포를 세척하고, 원심 분리 튜브에 세포를 전송하기 위해를 사용한다. 모든 셀을 검색하려면, DMEM / F-12 배지 1 ㎖ 잘 각각의 세척 및 원심 분리 튜브에 매체를 추가 할 수 있습니다.
6. g X 300에서 5 분간 세포를 원심 분리기. 상등액을 흡인하고 10 μM의 Rho 키나아제 (ROCK) 억제제를 함유하는 5 ㎖의 ES 세포 배양 배지에서 세포를 재현 탁.
7. 혈구를 사용하여 현미경으로 세포를 세어 150,000 시드 - 사용 ES 세포주에 따라 6- 웰 당 또는 다른 플레이트 레이아웃 400,000 세포. 사용 막 다른37 ° C, 5 % CO _2에서 세포 사멸과 문화를 인큐베이터에서 세포를 방지하기 위해 매체를 포함하는 10 μM의 ROCK 저해제를 진짜야.
8. 약 24 시간 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 매체 대기음을 파종하고 원시적 인 행진 유도 배지 2 ㎖를 추가 한 후.
   참고 :이 매체는 고급 RPMI-1640 배지에 1 % 글루타민, 0.2 % FCS, 5 μM CHIR-99021 50 NG / ㎖ 티빈의 최종 농도가 포함되어 있습니다. 일반적으로, 6 웰 플레이트에서 배양을위한 배지 2 ㎖를 사용합니다.
9. 48 시간 시딩 후, 유도 매체를 내배엽 할 수있는 매체를 교체합니다. 매일 매체 변화에 또 다른 48 시간이 매체에 세포를 배양.
   참고 :이 매체는 고급 RPMI-1640 배지에 1 % 글루타민, 0.2 % FCS 50 NG / ㎖ 티빈이 포함되어 있습니다. 최종 내배엽을 향해 최선을 다하고 있습니다 세포 표면 마커 CXCR4를 표현한다. CXCR4의 염색 DE 결정 세포 수를 정량화하는데 사용될 수있다.

2. 유동 세포 계측법 분석을위한 CXCR4 + 확실한 내배엽 세포의 염색

1. 수확 전 마지막 24 시간 그러나 최소한 1 시간 동안 세포 배양 배지에 10 μM의 ROCK 억제제를 추가합니다.
2. 코트 즉, 기저막 행렬 재 파종에 사용되는 세포 배양웨어, 면역 형광 염색법에 대한 qPCR에 분석 또는 챔버 슬라이드 12 웰 플레이트. 실온에서 적어도 30 분 동안 판 또는 슬라이드를 품어.
3. 오염 및 / 또는 정렬을 위해 사용되는 분화 된 세포의 웰에서 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 흡인 매체.
4. 세포 클러스터의 부드러운 해리에 대한 효소가없는 계대 솔루션 시약의 1 ML을 추가합니다. 세포를 작은 클러스터로 중단 뚜렷한 표시까지 CO _2, 37 ℃에서 인큐베이션하고 세포를 5 %.
   주 : 배양 시간을 사용 시약에 따라 달라집니다. materi에 언급 된 효소가없는 계대 솔루션ALS 부는, 배양 시간은 약 7 분이다.
5. 1 ml의 DMEM / F-12 배지를 추가로 pipetting에 의해 1 ml의 팁을 사용하여 아래 하나의 세포로 세포 집합체 남아 방해. 표면으로부터 세포를 세척하고, 원심 분리 튜브에 세포를 전송하기 위해를 사용한다. 모든 셀을 검색하려면, / FCS 오 w DMEM / F-12 배지 1 ㎖ 잘 각각의 세척 및 원심 분리 튜브에 매체를 추가 할 수 있습니다.
6. 혈구를 사용하여 현미경으로 세포를 카운트. 6 잘 판의 세 우물에서 세포 분화의 삼일 후 10 ~ 15 × 10 ⁶ 세포에서 발생한다. g X 300에서 5 분간 세포를 원심 분리기.
   참고 얻어지는 세포의 정확한 수는 사용 된 분화 다 능성 세포주에 의존 할 것이다.
7. 뜨는을 기음과 10 μM의 ROCK 저해제를 포함하는 PEB 버퍼에 세포를 재현 탁. 최대 10 ⁷ 세포에 대한 버퍼 100 μl를 사용합니다. staini의 날에 10 μM의 ROCK 저해제 추가NG. (PEB 버퍼 + RI 라 함) 모든 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 버퍼를 사용합니다.
   참고 : PEB 버퍼가 0.5 % BSA와 PBS에서 2 mM의 EDTA가 포함되어 있습니다. 이상의 세포가 염색 할 경우, 이에 따라 상기 버퍼 볼륨을 조절한다.
8. 이 약 1:10 희석을 대표하는 100 ㎕의 10 ⁷ 세포 당 CXCR4-APC 항체의 10 μl를 추가합니다.
   참고 : APC 결합 항체의 사용은 필수가 아닙니다. 대신 사용 마이크로 비드에 따라 치환 될 수있다. 이상의 세포가 염색 될 경우 그에 따라 항체 량을 조정한다.
9. 부드럽게 손가락으로 튜브를 틀지하여 혼합하고 15 분 동안 냉장고에 4 ° C에서 품어. 1-2 ml의 PEB 버퍼와 세포를 재현 탁. g X 300에서 5 분간 세포를 원심 분리기.
10. 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 뜨는을 대기음 10 ⁷ 세포 당 80 μL의 PEB에있는 세포 펠렛을 resuspend 20 μl를 방지 APC 마이크로 비드를 추가합니다.
    노트: 따라서, 마이크로 비드 볼륨을 조절.
11. 부드럽게 손가락으로 튜브를 틀지하여 혼합하고 15 분 동안 냉장고에 4 ° C에서 품어. 1-2 ml의 PEB 버퍼 + RI와 세포를 재현 탁. g X 300에서 5 분간 세포를 원심 분리기. 버퍼를 대기음. 500 μL의 PEB 버퍼 + RI에 재현 탁.

CXCR4 + 세포의 3. 자기 분리

1. 제조 지침에 따라 자기장에 중간 크기의 자석 열을 놓습니다. 500 μL의 PEB 버퍼 + RI와 열을 미리 씻어. 열에 전체 세포 현탁액을 적용합니다. 컬럼에 결합되므로, 모든 셀을 통해 유동을 수집한다. 확인 CXCR4 + 세포의 최적의 검색을 위해 열을 방해하지합니다.
2. 칼럼 500 μL의 PEB 버퍼 + RI로 3 회 씻는다. 내지 제 유동을 수집 단계 3.1에서 수집 된 세포와 결합. 자기장에서 자기 열을 제거하고에 배치적절한 포집 관. 컬럼에 1 ML의 PEB 버퍼 + RI를 추가합니다. 세포가 단단히 열에 플런저를 눌러 용출합니다.
3. 선택 사항 : 개별적으로 샘플을 통해 모든 흐름을 수집하고 유동 세포 계측법 사용 CXCR4 + 세포의 수를 분석하는 20 ㎕를 각각 사용한다. 그들의 수는 모든 세척 단계로 감소한다.
   참고 : 적어도 2 × 10 ⁴ 가능한, 게이트 세포가 신뢰할 수있는 결과를 계산해야한다.
4. 반복 단계 3.1에서 샘플을 통해 수집 된 흐름과 새 열을 사용하여 단계 3.2에서 샘플을 통해 제 1 유동와 3.1-3.3 단계. 하지 마십시오 이전 칼럼을 다시 사용합니다. 플런저 공기를 사용하여이를 차단하는 열로 가압된다.
5. 혈구를 사용하여 현미경으로 세포를 카운트. 6 × ¹⁰⁶ 세포로 분화 최대의 효율에 따라 초기 정렬 및 절차 ¹⁰⁷ 세포를 사용하는 경우 두 번째 열을 사용하여 다른 1 × ¹⁰⁶ 세포 수있다.
6. 5 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 기음 뜨는 및 멸균 유리 파스퇴르 피펫와 추가로 10 μM의 ROCK 저해제와 단계 1.9에서 1 ml의 내배엽 유도 배지에서 세포를 재현 탁.
7. 혈구를 사용하여 현미경으로 세포를 카운트. 적절한 밀도로 세포를 시드 즉, ~ 12 웰 플레이트의 웰 당 4 × 10 ⁵ 세포 (응용 프로그램. 3.6 cm ^2면) 또는 ~ 8 잘 챔버 슬라이드의 웰 당 1.5 × 10 ⁵ 세포.

4. 선택 사항 : 정제 된 결정적인 내배엽 인구의 분석

1. 면역 형광 염색법의 경우 약 24 시간 최종 내배엽 (DE) 및 / 또는 능성 마커 단백질 4 % 파라 포름 알데히드와 얼룩 시드 후 단계 3.7에서 정제 된 세포를 고정합니다.
   참고 : 일반적으로 사용되는 DE 마커 FOXA2 및 SOX17을 포함, 일반적으로 사용되는 만능 마커는 OCT3 / 4, NANOG와 SOX2 ^{6, 8을} 포함한다.
2. FOR RT-qPCR에 분석, 직접 또는 24 시간 시딩 후 정제 된 세포를 수확 총-RNA 추출하고 추출 된 총-RNA 샘플에서의 cDNA를 전사 역. DE 및 다 능성 마커 유전자 ^{(6), (8)의} 발현을 분석하기 위해 RT-qPCR의 반응 (삼중) 당 10 ng의 주형으로서 cDNA를 사용합니다.
   참고 : 일반적으로 사용되는 마커 유전자는 단계 4.1에 언급되어있다. 사이클 조건은 곡선 분석을 용융 다음 95 ℃에서 5 분, 95 ° C에서 15 초 40주기와 60 ° C에서 1 분입니다.

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결과

분화시 는 ESC 유전자와 단백질 발현의 급격한 변화를 겪는다. 1 성공적인 내배엽 분화를 확인하는 데 사용할 수있는 일반적인 마커 유전자를 보여주고있다. 유전자 발현 분석을위한 주요 목표 GSC, FOXA2 및 SOX17있다. 미분화는 ESC에 비해 상대적 유전자 발현 분석에서 특히 FOXA2 및 SOX17는> 000 배 증가?...

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토론

현재 사용 분화 프로토콜은 거의 100 % 차별화 된 세포에서 발생합니다. 아직 해결해야 할 몇 가지 이유로 세포 분화 과정 레지스트. 사용 된 분화 프로토콜의 효율 및 ESC의 성향에 따라 잔류 다 능성 세포의 소정 수는 일반적으로, 심지어 최종 내배엽으로 분화 후에 관찰되는 광고. 이러한 잔류 세포는 transcriptomics, 단백질 체학 및 miRNA의 발현 분석 등 다운 스트림 분화 또는 추가 분석을 방해 할 수 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 human embryonic stem cell line	Harvard Department of stem cell & regenerative biology		Suitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell line	ES Cell International		Suitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC culture medium
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	magnetic field
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK inhibitor
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stemcell Technologies	7174	Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately.
MS Columns	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Technologies
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan assay	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R&D Systems	AF1924