RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

Resumen

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

Resumen

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

Introducción

La malaria es una enfermedad infecciosa transmitida por mosquitos que afecta a muchos millones de personas cada año. La Organización Mundial de la Salud (OMS) informa que en 2013 había aproximadamente 584.000 muertes debidas a la malaria, el 78 por ciento de los cuales ocurrieron en niños menores de cinco años ^1. Los patógenos que causan la malaria humana son parásitos apicomplejos dentro del género Plasmodium y se transmiten entre sus huéspedes humanos por los mosquitos Anopheles hembra. La transmisión se produce cuando el mosquito ingiere sangre de un individuo que está infectado, y luego los depósitos parásitos infecciosos en un individuo no infectado en una comida de sangre posterior. Dentro del género Anopheles, Anopheles gambiae es la especie de mayor capacidad vectorial y es el vector de la malaria más prominente en el África subsahariana ^1-3.

Actualmente, mosquito vector de control por el despliegue de insecticidas continúa a be el principal método empleado para reducir la carga de la malaria humana. Aunque el uso de insecticidas desde 1960 ha demostrado ser un gran éxito, el aumento de la resistencia a los insecticidas ha conducido una necesidad para el desarrollo de nuevos insecticidas y estrategias de control de vectores alternativa ^4-7. Durante el año 2010, un total de 49 de los 63 países que comunicaron a la OMS indica la aparición de resistencia a los insecticidas en los vectores de la malaria ^1. Además, la herramienta IR Mapper, que utiliza la literatura revisada por expertos para evaluar los datos de resistencia en las regiones de África tropical, informa que entre 2001 y 2012 hubo 46% y el 27% aumento de la resistencia a los piretroides y diclorodifeniltricloroetano (DDT), respectivamente ^7.

La interferencia de ARN (RNAi) fue identificado en la década de 1990 como una técnica que se podrían emplear para inactivar genes en la planta Petunia ^8,9 y en el hongo Neurospora crassa ^9,10. Poco después,en 1998, el ARNi se documentó por primera vez en Caenorhabditis elegans como un medio de reducir la expresión génica en un modelo animal mediante la introducción de antisentido o ARN de doble cadena (dsRNA) a través de inyección o métodos de alimentación ^9,11. Desde su descubrimiento, el ARNi ha revolucionado la búsqueda de la genómica funcional, permitiendo a los investigadores utilizan la genética inversa para investigar rápidamente el papel funcional de los genes de interés a través de un mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional altamente selectiva. En algunos organismos, tales como Drosophila melanogaster, el uso de los organismos transgénicos que expresan constructos de ARN de interferencia ha sido ampliamente exitosa para gen desmontables (KD). Aunque el uso de transgenes en An. gambiae de ARNi se ha utilizado y puede resultar útil para pantallas de gran escala, la generación de cepas de mosquitos transgénicos es tanto trabajo y tiempo intensivo, generalmente toman de dos a tres meses para pasar de la identificación de un gen de interés para los Generatien planta de un almacén transgénica apropiada ^12. Actualmente, el método primario de KD gen en An. gambiae es por inyección en la hemolinfa, durante la etapa de adulto, de dsRNA específico para un gen dado ^12,13. Este proceso generalmente tarda aproximadamente un mes para ir desde la identificación de un gen de interés a la evaluación de KD gen, demostrando ser mucho más rápida que los métodos transgénicos ^12. Los métodos para larvas en etapa de ARNi se han establecido recientemente en una. ARN de doble cadena a base de microalgas gambiae y Aedes aegypti a través de la alimentación de nanopartículas ^14-17 o mediante la administración oral de moléculas ^18, ofreciendo oportunidades para llevar a cabo el análisis genómico funcional durante las primeras etapas de desarrollo. En la inyección directa, la alimentación, y los métodos de liberación de nanopartículas, dsRNA se recoge de forma autónoma por la célula diana y se escinde por la enzima Dicer en 21-25 nucleótidos de longitud "corto de interferencia ARN" (siRNAs) ^19,20. Estos siRNAs son entonces incorado en el ARN inducida por silenciar complejo (RISC), de la que se descartará una hebra, permitiendo que el complejo RISC ARN unido para unirse y escindir el ARNm objetivo y por lo tanto reducir su nivel e inhiben su traducción ^19,20.

Muchas de las características intrínsecas de la biología básica de mosquitos modulan la capacidad vectorial, incluyendo la preferencia de acogida (por ejemplo, el olfato, gustation), el apareamiento, la reproducción y la inmunidad. Dada la importancia de estos procesos biológicos, es probable que su modulación a nivel genético o farmacológico ofrecerá nuevas oportunidades para el control de vectores, incluyendo la elusión de resistencia a los insecticidas, y proporcionar nuevas herramientas para enfoques más ampliamente integrados para el manejo de vectores. El uso de la genómica funcional para evaluar las funciones de los genes que subyacen a estas características biológicas intrínsecas permitirá la identificación de nuevas dianas y proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo podemos crear efectivamente nuevos, strateg control más efectivoIES. Se describe el desarrollo y el uso de un método de inyección rápida para iniciar RNAi durante la fase de pupa de An. gambiae. Observamos que la inyección estado de pupa de un disparador de ARNi permite la observación de los fenotipos resultantes en adultos en fase inicial, es decir, cuanto antes después de la emergencia de lo que se observaría si gen desmontables se iniciaron en adultos después del brote. Este método permite gen desmontables que comienza durante el intervalo del desarrollo de pupa y que se extiende en etapas adultas, tales principios adultos tipos de células de la hemolinfa de ruedas que desmontables gen iniciado durante el desarrollo pupal puede persistir y afectar, así como los tipos de células que son más hemolinfa de ruedas durante la metamorfosis que en el adulto, como las neuronas sensoriales que se encuentran en apéndices adultos siguientes emergencia.

Protocolo

1. Síntesis y Preparación dsRNA

1. Identificar una región de derribo 200-800 pb (para generar el correspondiente ARN de doble cadena) dentro del gen de interés que se prevé que no tienen efectos fuera de la meta identificables (por ejemplo, hay una homología de secuencia ≥18 pb dentro de otro gen) y un control negativo (por ejemplo, , una secuencia heteróloga que no está presente dentro del genoma de insectos objetivo, tal como el gen lacZ de Escherichia coli (GenBank gene ID: 945006). como alternativa, utilizar un control positivo (por ejemplo, que produce un fenotipo fácilmente observado, como SRPN2 ^21,22 _, GenBank gene ID:. 1270169) la secuencia de la SRPN2 orientación dsRNA se define en Michel et al (2005) ^21..
   Nota: E-ARNi es un recurso bioinformático de código abierto que es útil para la identificación de estas regiones y para el proceso de diseño de cebadores de oligonucleótidos ^23.
2. realizar samplificación tandard PCR (es decir, realizada con la Taq ADN polimerasa usando 30-35 ciclos) utilizando un ADN genómico o cDNA plantilla para obtener la síntesis de plantilla de dsRNA flanqueado por una secuencia de promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') y proceder con la preparación de dsRNA y limpiar-up utilizando un kit comercial transcripción in vitro según las instrucciones del fabricante. Uso SRPN2 PCR condiciones de amplificación y cartilla de información que se presenta en An et al. (2011) ^22.
3. Cuantificar el rendimiento de ARN de amplicón purificado por espectroscopia de absorción ultravioleta a longitud de onda de 260 nm y ajustar a la concentración deseada (por ejemplo, 3 g / l) en agua libre de RNasa.
   1. Para solucionar los problemas bajas concentraciones de ARN, reducir el volumen de líquido haciendo girar las muestras en una centrífuga de vacío a temperatura ambiente o por liofilización de muestras y la reconstitución en volúmenes más pequeños de agua. El tiempo necesario para la liofilización de la muestra variará dependiendoen los volúmenes iniciales de la muestra y las concentraciones de ARN de doble cadena.
4. Comprobación de la calidad y la longitud del dsRNA en un gel de agarosa al 2% preparada con 1x TBE o tampón TAE y se tiñeron con bromuro de etidio (EtBr), junto con la plantilla de ADN utilizado para la reacción de transcripción. El dsRNA migrará más lentamente que la plantilla de ADN. Calidad y la duración pueden ser evaluados al asegurar que no hay productos no específicos y ARN de doble cadena mediante la comparación de productos con un marcador de ADN estándar, respectivamente.
   Nota: EtBr es un potente mutágeno y debe ser manejado en consecuencia.
   Nota: A una concentración dsRNA de 3 g / l, 0,5 l de la muestra es más que suficiente para la visualización en el gel de agarosa EtBr-manchado.
5. Almacenar dsRNA a -20 ° C hasta que se necesite. ciclos de congelación / descongelación múltiples pueden causar la degradación, por lo alícuotas deben estar preparados para grandes volúmenes de ARN de doble cadena.

2. Preparar Fast Green FCF Dye tubos (FGD)

1. Diluir rápida de tinte verde FCFa partir de la solución madre (≥85% de contenido de colorante) a 0,1% (v / v) (solución de trabajo) en agua libre de RNasa.
2. Pipeta de 1 l de medio de contraste en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Colocar los tubos en un bloque de calor a 65 ° C durante aproximadamente 3 horas para evaporar, luego coloque los tubos de líquidos a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, enfriar antes de usar. Este colorante sólido seco se reconstituirá en solución de resuspensión ARN de doble cadena.

3. Tire las agujas de inyección

1. Tire de agujas de vidrio de borosilicato con un extractor de aguja calentada a un diámetro de la punta de 10-30 micras. Tire ajustes corresponden a: el ajuste del calentador no. 1 = 100, el ajuste del calentador no. 2 = 70.
2. Para evitar daños a la fina punta de la aguja, colocar todas las agujas tirados horizontalmente en una placa de Petri en una tira de masilla de moldeo.
   Nota: Información adicional de la aguja capilar tirando métodos se puede encontrar con más detalle en el Reactivo de Investigación y Referencia del Centro de Recursos malaria MR4 manual de ^24.

4. Preparar la estación de inyección

1. Recoger los materiales necesarios: agujas microcapillary vidrio sacaron a punta fina, microinyector, papel de filtro fino y papel de filtro grueso, placas de Petri, pipetas de transferencia, pincel y el microscopio de disección luz.
2. Preparar el microinyector como se indica en el manual microinyector, y establecer el volumen de inyección al volumen deseado por pulso (por ejemplo, máximo de 69 nl por pulso).
3. En una plataforma que es fácil de maniobrar bajo el microscopio (por ejemplo, el lado plano de un bastidor de tubo de espuma de poliestireno), apilar las dos hojas de papel filtro con el papel de filtro delgado en la parte superior, y seguro con cinta adhesiva alrededor de los bordes.
4. Resuspender 10 l de cada solución de ARN de doble cadena en tubos de teñir de colores distintos, y el lugar en el hielo.

5. Recoger pupas para Inyección

1. Llenar una pequeña de 60 mm x 15 mm placa de Petri con 10 ml de agua desionizada, y recoger ~ 50 pupas pálido (During de la primera 24 horas después de la fase de pupa) de una bandeja insectario con una pipeta de transferencia de plástico desechable.
2. Eliminar cualquier pupas que tienen medio de bronceado oscuro de la cutícula.
   Nota: Una vez que la cutícula comienza a broncearse, se hace más difícil de penetrar la cutícula, y los resultados de inyección en mucho mayor letalidad.

6. inyección de dsRNA

1. Bajo el microscopio de disección, rompa la punta distal de la aguja de inyección con un par de pinzas finas.
2. Preparar la aguja de inyección por el relleno de la aguja con aceite mineral (usando una jeringa con una 3 pulgadas, aguja de calibre 30), y expulsar el exceso de aceite con el microinyector.
3. Frente llenar aguja de inyección con la máxima cantidad de ARN de doble cadena, y expulsar un pulso bajo el microscopio, asegurar la distribución del líquido. En el caso de que ningún líquido es absorbido y / o expulsado, compruebe la punta distal de la aguja en busca de obstrucciones y asegurarse de que la aguja está bien colocada en el microinjector.
4. Escoja 1-3 pupas, y colocarlos en el papel de filtro.
5. Utilizando el pincel, la posición de las pupas en el papel de filtro con la cutícula dorsal accesible, y utilizar el pincel para empujar sobre papel de filtro y absorber cualquier exceso de agua.
6. Estabilizar la pupa con la punta del pincel, e inserte la aguja en la cutícula dorsal entre el tórax y el abdomen en un ángulo de aproximadamente 30 ° en relación con la superficie dorsal de la pupa. La inyección debe ser dirigido hacia el extremo posterior de la pupa y la aguja se debe mover en una dirección anterior-a-posterior.
7. Inyectar dos impulsos (69 nl por impulso) de solución de 3 g / l ARN de doble cadena en la hemolinfa, y comprobar la distribución del color en todo el cuerpo. Si no se identifica el color, cambiar la posición de la aguja de inyección ligeramente para vaciar la punta de la obstrucción y repetir de suministro de líquido.
8. Con el pincel humedecido para mover suavemente las crisálidas de la aguja en el agua para el cultivo. Tpupa que debe atenerse a la brocha al entrar en contacto la luz.

7. Condiciones después de la inyección

1. Coloque placa de Petri con pupas se inyecta en una jaula de mosquitos con el flujo de aire adecuado (por ejemplo, la jaula de malla o un recipiente con tapa de malla). condiciones de cría de pupas deben permanecer constantemente a 27 ± 3 ° C de temperatura, 75 ± 5% de humedad y estar bajo un ciclo de luz: oscuridad de 16: 8 h.
2. Preparar una solución de glucosa al 10% (w / v), y colocar una bola de algodón solución saturada en la jaula de malla de mosquitos para la alimentación de adultos.

8. Evaluar Derribo

1. Al momento de punto (s) deseada, evaluar fenotipos en experimentales insectos inyectados con ARN de doble cadena, en comparación con los controles.
   1. Evaluar dsSRPN2 y dsLacZ insectos diaria enfriando hasta adultos durante aproximadamente 2-3 minutos a -20 ° C, transferirlos a un plato frío entre 2 ° C y la identificación de cualquier formación de pseudo-tumor mediante la utilización de un microscopio de disección a 15Xaumento con iluminación de campo claro. Después de la evaluación, los adultos a las condiciones de insectario (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% de humedad) de regreso.
      Nota: Los dsRNAs experimentales y de control utilizados en este protocolo son dsSRPN2 y dsLacZ, respectivamente. Hay muchas opciones para los controles adecuados; sin embargo, se sugiere que un control positivo para la que se visualiza fácilmente fenotipo y / o la expresión (por ejemplo, mediante la disección de la microscopía) y / o cuantificado [por ejemplo, cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR), Western blot] se debe utilizar cuando el aprendizaje de esta técnica. SRPN2 proteína y cuantificación transcripción a través de Western blot y QRT-PCR, respectivamente, se describen en Michel et al. (2005) ^21.

Resultados

La inyección de pupa para los rendimientos gen KD resultados óptimos cuando se realiza la inyección durante la fase de pupa temprano, cuando los niveles de bronceado de la cutícula son bajos (Figura 1A, izquierda y 1B). El aumento de bronceado y el endurecimiento de la cutícula, generalmente después de 24 horas, resulta en aumento de la muerte de pupa después de la inyección (Figura 1A, central y derecho). La tasa de desarrollo de pupa puede variar dependiendo de las condiciones de insectario y la densidad de animales ^24,25; Por lo tanto, lo mejor es evaluar visualmente la pigmentación.

Durante el proceso de inyección, la aguja capilar se inserta en la cutícula dorsal en un ángulo de aproximadamente 30 ° en la zona anterior a la dirección posterior (Figura 2A). Una vez que se inserta la aguja y la dsRNA + 0,01% (w / v) se dispensa FGD, la distribución de colorante es evidente a través de la hemolinfa (Figure 2B).

Evaluación de la emergencia de los adultos para pupas inyectado con 0,01% (w / v) FGD reveló una tasa promedio de 70% de emergencia, en comparación con 96,7% de emergencia de los controles no inyectados (Figura 3A). Es de destacar que se observó aparición parcial de la caja de pupa para un gran número de mosquitos no supervivientes (Figura 3B). Animales inyectados no presentan retrasos en el tiempo de la emergencia (Figura 4A) o sesgada de impacto en ambos sexos (Figura 4B). La evaluación adicional de la supervivencia de adultos lleva a cabo hasta el día 10 después del brote revela que no hay impacto evidente en post-emergencia de supervivencia de adultos (Figura 4C).

La validación de la calidad de KD se evaluó por el pseudo-tumor melanotic (cluster tejido pigmentación oscura) fenotipo asociado con SRPN2 desmontables ^21,22 como un control positivo para knockdown y la ausencia de fenotipos asociados con la inyección dsLacZ como control negativo. Los mosquitos adultos que emergieron fueron anotados en el día 8 después de la inyección (día 6-7 post-emergencia). Se observaron pseudo-tumores melánicos (Figura 5A y 5B) a través de la cutícula del 93,5% de la dsSRPN2 vs. 0% de los mosquitos dsLacZ adultos (Figura 6A). Agrupaciones de tejido oscuro melanizados se identificaron en la disección de los parches pigmentados (Figura 5C). Pseudo-tumores eran visibles en la cutícula de adultos ya en el día 3 post-emergencia y también estaban presentes en un subconjunto de dsSRPN2 hemolinfa y los tejidos intestinales (datos no mostrados). A las 5 de post-inyección (etapa adulta temprana), disminuyó significativamente los niveles de SRPN2 dsSRPN2, pero no se observó dsLacZ o aislados de proteína no inyectados hemolinfa (Figura 6B).

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Figura 1: puesta en escena del Desarrollo para la inyección de dsRNA inyección de pupa pupa temprana de los resultados de ARN de doble cadena en la supervivencia y la progresión óptima en la etapa adulta.. Los bajos niveles de pigmentación de la cutícula (A, a la izquierda, y B) se pueden observar dentro de la primera 0-24 horas después de la fase de pupa. Curtido de la cutícula precedente inyección de pupa resultados (derecha A, centro y) de moderada a baja supervivencia.

Figura 2:. Posición de inyección y la distribución de inyección de la aguja dsRNA (A) marcado con colorante capilar de dsRNA marcado con colorante en la cutícula dorsal en un ángulo de aproximadamente 30 °, en dirección anterior a posterior. (B) El medio de contraste se distribuye de forma visible en la hemolinfa de pupa. volumen de inyección de dsRNA de 138 nl, marcado con 0,01% FGD (w / v).

Figura 3:. Post-inyección emergencia del adulto (A) 70% de pupas inyectado con 0,01% FGD (w / v) emergió con éxito (n = 60), en comparación con 96,7% de los controles no inyectados (n = 60). Se realizaron tres réplicas biológicas. Se observó (B) aparición parcial de la caja de pupa para un gran número de mosquitos no sobrevivir. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM).

Figura 4: la tasa de emergencia, la evaluación sexo y adultos supervivencia (A) se observaron tiempos de emergencia comparables después de la inyección de pupa con 0,01% FGD (24 hr = 80% y 48 hr = 20%), en comparación con pupas no inyectado (24. HR = 83% y 48 hr = 17%). (B ) se observó Aproximadamente igual hombres y mujeres adultos surgimiento de 0,01% FGD pupas inyectado (mujer = 48% y hombres = 52%) y pupas no inyectado (mujer = 52% y hombres = 48%). Análisis (C) Supervivencia revela que la inyección con 0,01% FGD no afecta la supervivencia de adultos, evaluada hasta 10 días después del brote. Los resultados representan datos de tres experimentos independientes con 0,01% FGD inyectado (n = 60) y pupas no inyectado (n = 60) (igual número de machos y hembras). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM).

Figura 5: Pseudo-tumoral fenotipo control positivo refleja caída éxito se observaron pseudo-tumores en el abdomen (A) y (B) de la cutícula torácica de dsSRPN2: se inyecta, pero no dsLacZ mosquitos adultos inyectadas en el día 8 después de la inyección..(C) aumento mayor (400X) de formación de imágenes (a) de la cutícula y la disección de los parches pigmentadas (b) revela grupos de células oscuramente melanized.

Figura 6: La cuantificación de la formación de pseudo-tumor y la disminución de los niveles de proteína SRPN2 (A) inyecciones fase de pupa resultan en la formación de pseudo-tumor en 93,5% de los adultos dsSRPN2 (n = 21) en comparación con 0% de los controles dsLacZ (n = 19). . Los resultados obtenidos el día 8 después de la inyección. (B) Western blot (izquierda) muestra una disminución en los niveles de SRPN2 dsSRPN2, pero no dsLacZ o aislamientos no inyectados proteínas hemolinfa (día 5 después de la inyección). Resultados basados ​​en tres experimentos independientes. Anti-SRPN2 ²¹ y anti-SRPN3 diluciones ²⁶ anticuerpos utilizados fueron 1: 1.000 y 1: 2.000, respectivamente. Cabra anti-raBBIT IgG-HRP (Producto sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) se utilizó a 1: 5000. Todos los niveles de proteína se cuantificaron (derecha) por la intensidad de banda (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normalizado a SRPN3, y estadísticamente comparado con la prueba t no pareada. P <0,05: *, P ≥0.05: ns (no significativo). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM).

Discusión

Los métodos actuales para inducir el ARNi no transgénico en los mosquitos implican la inyección directa de ARN de doble cadena en el hemocoel adulto ^12,13 o alimentación de las larvas de RNAi nanopartículas recubiertas de activación ^14-17 o ARN de doble cadena a base de microalgas moléculas ^18. Apuntando al mosquito adulto, aunque es extremadamente valiosa, puede excluir a un gran número de genes que funcionan durante los períodos anteriores del desarrollo. Caída iniciada por alimentación de las larvas puede producir fenotipos inconsistentes durante la etapa adulta, debido, en parte, a la posibilidad de la persistencia de proteínas a través de la variable de estado de pupa. Por lo tanto, se introduce un método adicional que se dirige específicamente a iniciar RNAi durante el desarrollo de pupa proporcionará un medio para evaluar más a fondo las funciones de genes durante las etapas de desarrollo pre-adultos, así como capacidades mejoradas para evaluar la función génica durante la etapa adulta. Como con enfoque de genes desmontables basado en la inyección de dsRNA o expresión, la persistencia del gen desmontablesno se puede predecir. Por lo tanto, los niveles de transcripción o proteínas deben ser evaluados para el gen de interés durante períodos de desarrollo de interés. Aunque se observa una continuación de la disminución de los niveles de proteína en el día 5 después de la inyección para SRPN2 en los animales inyectados con ARN de doble cadena SRPN2, factores como el recambio de proteínas y la vida media pueden ser diferentes para diferentes objetivos. Es fundamental para garantizar, además, que el ARN de doble cadena que se utilizará para la inyección es bien concentrado y parece intacto en un gel de agarosa. Recomendamos experimentadores reevaluar estos factores si los resultados no son suficientes desmontables, y pueden necesitar ser probado empíricamente para objetivos de genes específicos respectivas concentraciones de ARN de doble cadena.

Se describe un método para la iniciación de la interferencia de ARN durante la fase de pupa de An. desarrollo gambiae. Este método se basa en la introducción a través de microinyección de dsRNA directamente en el hemocoel de pupas temprano y permite la evaluación de la calidad de la inyección por elutilizar de dsRNA marcado con colorante. La capacidad de visualizar la calidad de inyección constituye una mejora fundamental para garantizar knockdown éxito y constituye un aspecto de la caída génica basada en la inyección que no se ha considerado en los protocolos basados ​​en dsRNA más informes anteriores se centran en la etapa adulta. Al dirigirse a la pupa en el inicio de este periodo de desarrollo, los genes que podrían desempeñar un papel durante este intervalo crítico del desarrollo, o durante las primeras etapas de la edad adulta se puede evaluar funcionalmente. Además, este método puede permitir la entrega dsRNA a las células, y el establecimiento de la interferencia de ARN en las células que son accesibles durante la metamorfosis, pero menos accesibles en mosquitos adultos completamente formados.

Un análisis de microarrays reciente de Harker et al. (2012) identificó 560 An. gambiae transcripciones que fueron hasta reguladas o hacia abajo-regulados por al menos 4 veces durante las etapas de desarrollo distintas, que van desde el embrión a adulto. De los 560 transcripciones identificado, un conjunto de 309 fue hasta reguladas durante el desarrollo de pupa ^27. Estos hallazgos sugieren que hay muchos requisitos para la expresión diferencial de genes en todo el desarrollo de mosquitos, incluyendo aquellos que se producen durante la fase de pupa, un intervalo durante el cual el organismo sufre metamorfosis. En muchas especies de insectos, incluyendo An. gambiae, genes implicados en procesos tales como el desarrollo (es decir, cuticular de pupa y proteínas de unión a quitina) ^27-31 y la respuesta inmune (es decir, las proteínas similares al receptor de tipo Toll) ^27,32-34 son altamente expresado durante la fase de pupa. Una vez que ha surgido un adulto completamente formado, no se continúa la expresión génica en respuesta a ambiental y fisiológica cambia ^35. Cabe destacar que, durante el desarrollo adulta temprana, hay un aumento en la expresión de genes del desarrollo (es decir, cuticular de adultos y proteínas sarcoplásmicas) ^36, así como otros genes clave (es decir, , La proteína específica del esperma y del citocromo P450 enzimas del metabolismo) ^27,36.

El control positivo utilizado en el desarrollo de este protocolo, SRPN2, es un An. gambiae inhibidor de serina proteasa (serpina). SRPN2 juega un papel importante en la regulación negativa de la melanización de insecto, una respuesta inmune innata amplio espectro en insectos ^21,22. Desmontables de SRPN2 en mosquitos adultos en los resultados de la formación de pseudo-tumor ^21,22, un fenotipo que se observa fácilmente mediante el uso de microscopía de luz. Dado que este fenotipo distinto puede ser fácilmente anotó en insectos vivos, se utilizó para las inyecciones SRPN2 fase de pupa RNAi iniciales. Además, SRPN2 se expresa durante todas las etapas de desarrollo ^37, proporcionando de este modo un buen objetivo para la fase de pupa inyección RNAi y evaluación de la función a principios del adulto. Se demuestra que el método que hemos desarrollado es capaz de inducir pseud melanótica adulta similares la formación de o-tumor como consecuencia de las inyecciones de dsRNA realizadas durante la fase de pupa de desarrollo. En el desarrollo de este protocolo, hemos observado que la inyección durante el desarrollo temprano de pupa (es decir, las primeras 24 horas después de la muda larval-pupal) es fundamental para la obtención de emergencia de los adultos óptima. En el caso de que los pobres emergencia se obtiene después de la inyección, se recomienda la estadificación larvas con mayor precisión, para obtener pupas con menos extensa endurecimiento cutícula y asegurar la inyección se consigue fase de pupa temprano. Además, minimiza el daño a los resultados de la cutícula en tasas de emergencia óptimos y aumentando la ampliación durante la inyección puede ayudar a asegurar que sólo la región que el animal está pinchada. Si la aguja debe perforar a través de la cutícula ventral, puesta en común de líquido marcado con colorante será evidente en el exterior de la pupa o saturará el papel de filtro. Es muy recomendable para descartar cualquier pupas que tienen más de una punción de la cutícula.

jove_content "> Con las amplias experiencias de muchos laboratorios con el desempeño de las inyecciones de mosquitos adultos, los enfoques de microinyección previamente identificados se puede adaptar con modificaciones de protocolo sencillas para su uso en experimentos de RNAi pupa. En general, el objetivo de este método es proporcionar a los investigadores la capacidad de ampliar el período de tiempo durante el cual los análisis genéticos pueden llevar a cabo, lo que permite una mayor investigación que apoyará el desarrollo de nuevas estrategias de control de vectores inversa. Curiosamente, los experimentos en otras especies, como el Rhodnius prolixus, Spodoptera frugiperda, revelan que el gen efectos de silenciamiento tienden a ser mucho mayor cuando se inicia durante la pre-adulto etapas ^38,39. durante todas las etapas de desarrollo, gen mediada por RNAi desmontables está sujeta a consideraciones relativas a la rapidez y la persistencia del silenciamiento de genes, y la estabilidad de las proteínas codificadas por los genes objetivo. el objetivo ideal RNAi los genes tienden a ser las que codifican una protein o ARN que tiene una vida media corta y elevada tasa de rotación ^11,40.

Aunque las estrategias de RNAi transgénicos también pueden ser empleados para tratar las consideraciones con respecto a la rapidez y la persistencia de la RNAi durante las etapas de pre-adultos, técnicas transgénicas tienen muchos inconvenientes (por ejemplo, tiempo requerido para la generación de líneas transgénicas, experimentales calendarios de apareamientos de mosquitos para generar insectos con la expresión de ARN de doble cadena regulada, y el mantenimiento de las poblaciones de transgénicos). Por el contrario, nuestro protocolo proporciona un método más fácil y más rápido para iniciar la precipitación génica durante el desarrollo de pupa y en tipos de células que se originan y que son accesibles durante la metamorfosis, pero son menos accesibles en los adultos. El uso de suspensiones de dsRNA marcados con colorante permite una fácil evaluación del éxito de la inyección y la dispersión del material introducido dentro de las pupas. Nuestros datos sobre la aparición de la formación de tumores en adultos de pupa inyectado, en comparación con los animales inyectados como adultos, es coherente con initiation de RNAi mediada desmontables durante la fase de pupa. El uso de nuestra línea G3 mosquitos y bajo nuestras condiciones de insectario, se observa la formación de pseudo-tumor melánico adulta a los 10 días después de la inyección de adultos inyectó tres a cinco días después del brote. Mediante la realización de la inyección temprana de pupa-etapa, se observa la formación de melanotic pseudo-tumor visible ya en cinco días después de la inyección (es decir, de tres a cuatro días después del brote). Estos datos implican que este método permite la iniciación de knockdown de genes durante un período de desarrollo anteriormente con-estudiado (es decir, el desarrollo de pupa). Nuestro método de etiquetado de tinte también puede resultar útil para el desarrollo de nuevos protocolos de inyección de larvas, debido a la naturaleza translúcida de la cutícula durante todos los estadios larvales. Mientras que el control utilizado en este estudio requiere progresión en la etapa adulta para mostrar un fenotipo desmontables, futuros experimentos para evaluar fenotipos pupa etapa específica después de la inyección de pupas temprano proporcionaráinformación valiosa con respecto a la expansión de este método en unos periodos de desarrollo adicionales, tales como el desarrollo de pupa tarde. En resumen, este método proporciona un protocolo de ARNi valiosa para la iniciación de la fase de pupa gen desmontables mediante RNAi y amplía las herramientas de genómica funcional para su uso dentro de la comunidad de investigación insecto vector.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEGAscript RNAi kit	Ambion	AM1626
Nanoject II injector	Drummond	3-000-204
Nanoject II foot switch	Drummond	3-000-026
Borosilicate glass capillaries	Drummond	3-000-203-G/X
Glass micropipette puller	Narishigne	PB-7
Fast Green FCF dye	Sigma	F7258	Can substitute with a non-toxic food dye.
Plastic transfer pipettes	Thermo Scientific	1371150	¼ inch cut from tip to create a wider opening.
Whatman “thin” filter paper	GE Healthcare	1001-090	This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.
Western blot “thick” filter paper	BioRad	107-3931	This is the filter paper generally used for Western blots.
Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Paint brush (size 0)	Michael’s Art	10474940	Brush size and brand can vary based on availability and user preference.
Dissecting light microscope	----	-----	This can vary based on availability and user preference.