içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Özet

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

Özet

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

Giriş

Sıtma her yıl bireylerin milyonlarca etkileyen bir sivrisinek yoluyla bulaşan bulaşıcı bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 2013 yılında beş yıllık ¹ yaşın altındaki çocuklarda meydana gelen yüzde 78 olan sıtma nedeniyle yaklaşık 584.000 ölüm, olduğunu bildiriyor. Insan sıtma neden olan patojenleri cins Plasmodium içinde sporlular parazitlerdir ve dişi Anopheles sivrisinekler tarafından insan bilgisayarlar arasında iletilir. Sivrisinek bir sonraki kan yemek bulaşmamış birey sonra içine mevduat enfektif parazitler bulaşmış bir kişiden bir kan yemek alır ve ne zaman İletim oluşur. Cins Anopheles içinde Anopheles gambiae büyük vektörel kapasiteye sahip türdür ve Sahra-altı Afrika'da ^1-3 en önemli sıtma vektörü.

Şu anda, böcek dağıtım ile sivrisinek vektör kontrol b devamİnsan sıtma yükünü azaltmak için kullanılan en önemli yöntem e. 1960'lardan bu yana insektisit kullanımı çok başarılı olduğu kanıtlanmıştır, ancak böcek direnci artış, yeni insektisidler ve alternatif vektör kontrol stratejilerinin ^4-7 geliştirilmesi için bir ihtiyaç sürdü. 2010 yılında, Dünya Sağlık Örgütü rapor 49 63 ülkelerinin toplam sıtma vektörleri ¹ insektisit direncinin oluşumu göstermiştir. Ayrıca, Afrotropikal bölgelerde direnç verilerini değerlendirmek için hakemli literatür kullanır IR Mapper aracı, 2001 ve 2012 yılları arasında sırasıyla ⁷ piretroidler ve Diklorodifeniltrikloroetan (DDT) direnç% 46 ve% 27 artış, olduğunu bildiriyor.

RNA enterferans (RNAi) Petunya fabrikasında ^8,9 ve mantar Neurospora crassa ^9,10 genleri etkisiz hale getirmek istihdam edilebilir bir teknik olarak 1990'ların başında tespit edilmiştir. Kısa bir süre sonra,1998 yılında, RNAi ilk enjeksiyon veya besleme yöntemleri ^9,11 ile antisens ya da çift iplikli RNA (dsRNA) katılmasıyla, bir hayvan modelinde, gen ekspresyonunu azaltmak için bir araç olarak Caenorhabditis elegans belgelenmiştir. keşfedilmesinden bu yana, RNAi araştırmacılar hızla oldukça seçici transkripsiyon sonrası gen susturma mekanizması ile ilgi genlerin fonksiyonel rolleri araştırmak için ters genetik kullanmasına izin vererek fonksiyonel genomik peşinde devrim yarattı. Drosophila melanogaster gibi organizmalarda, müdahale edici RNA yapılarını eksprese transgenik organizmaların kullanımı gen demonte (KD) için yaygın olarak başarılı olmuştur. An transgenlerin kullanımı rağmen. RNAi için gambiae kullanılmıştır ve büyük ölçekli ekranlar için yararlı olabilir, transgenik sivrisinek suşlarının nesil emek ve zaman yoğun, genellikle Generati ilgilendiren bir genin tanımlanması gitmek için iki ya da üç ayda bir alıyor hemUygun bir transgenik stokunun ¹² üzerinde. Şu anda, An gen KD birincil yöntem. gambiae dsRNA'nın yetişkin aşamasında, hemolimf içine enjeksiyon ile verilen bir genin ^12,13 özeldir. Bu işlem genellikle çok daha hızlı transgenik yöntemler ¹² daha olduğunu kanıtlamaktadır, gen KD değerlendirilmesine ilgi bir genin tanımlanması gitmek için yaklaşık bir ay sürer. Larva evre RNAi Yöntemleri An son zamanlarda kurulmuştur. ^14-17 beslenme nanoparçacık yoluyla veya ağızdan teslimat gambiae ve Aedes aegypti Mikroalglerin tabanlı dsRNA gelişimin erken evrelerinde fonksiyonel genomik analiz gerçekleştirmek için fırsatlar sunan, ¹⁸ molekülleri. Direkt enjeksiyon, beslenme ve nanoparçacık dağıtım yöntemleri olarak, dsRNA "kısa RNA'lar müdahale" 21-25 nükleotid uzunluğunda (siRNA) ^19,20 içine enzim Dicer hedef hücre tarafından özerk alınır ve ayrılır. Bu siRNA'lar daha sonra incorporiçine ated RNA kaynaklı kompleks (RISC) susturulması, tek iplikli RNA bağlı RISC kompleksi bağlamak ve hedef mRNA tutunmaya ve böylece onun düzeyini azaltmak ve çevirisini ^19,20 inhibe izin atılır hangi.

Temel sivrisinek biyoloji birçok içsel özellikleri konak tercihi (örneğin, olfaction, tadına bakma), çiftleşme, üreme ve bağışıklık olmak üzere vektörel kapasitesini modüle. Bu biyolojik süreçlerin önemi göz önüne alındığında, bir genetik ya da farmakolojik düzeyde kendi modülasyon insektisit direnci atlatma dahil olmak üzere vektör kontrolü için yeni fırsatlar sunar ve vektör yönetimine daha geniş entegre yaklaşımlar için yepyeni araçlar sağlayan olasıdır. Bu içsel biyolojik özelliklerini altında yatan genlerin rollerini değerlendirmek için fonksiyonel genomik kullanımı yeni hedeflerin belirlenmesini sağlayacak ve etkili yeni, daha etkin kontrol strateg oluşturabilirsiniz nasıl yeni bakış açıları sağlayacakler. Biz An pupa aşamasında RNAi başlatmak için hızlı bir enjeksiyon yönteminin geliştirilmesini ve kullanımını tanımlamak. gambiae. Biz RNAi tetik pupa aşaması enjeksiyonu er demonte gen sonrası ortaya yetişkinlerde başlatılan olsaydı gözlenen olandan çıkmasından sonra, yani erken evre erişkinlerde bileşke fenotipleri gözlem sağladığını görüyoruz. Bu yöntemler, gen pupa gelişim aralığında başlangıç ​​ve erginleri, örneğin pupa gelişimi sırasında başlatılan gen yok etme sürmesi ve etkileyebilir erken yetişkin hemolimf erişilebilir hücre tipleri, hem de hücre tipleri içine uzanan demonte sağlayan başkalaşım boyunca daha hemolimf-erişilebilir böyle çıkması aşağıdaki yetişkin uzantıları bulunan duyusal nöronlar olarak yetişkin, daha.

Protokol

1. Sentezi ve Hazırlama dsRNA

1. Tanımlanabilen hedef dışı etkileri olduğu tahmin edilmektedir, ilgi konusu genin içinde (karşılık gelen dsRNA oluşturmak için), bir 200-800 bp'lik demonte bölgeyi belirlemek (örneğin, başka bir gen içinde herhangi bir sekans homolojisi ≥18 bp) ve negatif bir kontrol (örn örneğin Escherichia coli, lacZ geni gibi, (GenBank Gen ID: 945.006) hedef böcek genomu içinde mevcut olmayan bir heterolog sekansı. Alternatif olarak, bu SRPN2 ^21,22 gibi kolayca görülen bir fenotip veren örneğin pozitif kontrol (kullanımı _GenBank Gen ID:. 1270169) dsRNA hedef SRPN2 dizisi Michel ve ark tanımlanır (2005) ^21..
   Not: E-RNAi bu bölgelerin tanımlanması için ve oligonükleotit primerleri ²³ tasarımı olan yöntem için yararlı olan bir açık kaynak biyoinformatik kaynaktır.
2. s gerçekleştirintandard PCR (örneğin, Taq DNA polimeraz 30-35 döngü kullanılarak gerçekleştirilmiştir), bir T7 yükseltici seri ile çevrili dsRNA sentezi şablonu elde etmek için genomik DNA ya da cDNA şablonu kullanılarak (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') ve dsRNA hazırlanması devam edecek ve temiz-up üreticinin talimatlarına göre bir ticari in vitro transkripsiyon kiti kullanılarak. Kullanım SRPN2 PCR amplifikasyon koşulları ve An ve ark sunulan astar bilgi. (2011) ^22.
3. 260 nm dalga boyunda mor ötesi emme spektroskopisi ile saflaştırılmış RNA amplikon verimlerinin nicelendirilmesi ve RNase-barındırmayan su içinde istenen konsantrasyona (örneğin, 3 ug / ml) olacak şekilde ayarlanır.
   1. düşük RNA konsantrasyonları giderme için, aşağı doğru, oda sıcaklığında bir vakum santrifüjde örnekleri iplik veya örnekleri liyofilize su ve küçük hacimlerde sulandırılması sıvı hacmini azaltır. Örnek liyofilizasyon için gereken süre olarak değişecektirilk numune hacimleri ve dsRNA konsantrasyonları üzerindeki.
4. 1x TBE ve TAE ile hazırlanan% 2 agaroz jeli üzerinde dsRNA'nın kalitesi ve uzunluğunu kontrol tamponu ve transkripsiyon reaksiyonu için kullanılan şablon DNA ile birlikte, etidyum bromür (EtBr) ile boyanmıştır. dsRNA şablon DNA daha yavaş göç edecek. Kalite ve uzunluk hiçbir non-spesifik dsRNA ürünler vardır temin ederek ve sırasıyla bir standart DNA markeri ürünler karşılaştırılarak tespit edilebilir.
   Not: EtBr güçlü bir mutajen ve buna göre ele alınmalıdır.
   Not: 3 mg / ml bir dsRNA konsantrasyonunda, numune 0.5 ul EtBr-lekeli agaroz jeli üzerinde görüntülenmesi için yeterli olandan fazladır.
5. gerekli olana kadar -20 ° C'de dsRNA saklayın. alikotları dsRNA büyük miktarlar için hazırlanmalıdır birden çok donma / çözülme döngüleri, bozulmaya neden olabilir.

2. Hızlı Yeşil FCF Dye (FGD) Tüpler hazırlayın

1. Hızlı Yeşil FCF boya sulandırmakRNase içermeyen su içinde% 0.1 (h / h) (çalışma çözelti) stok çözeltisi (≥85% boya içeriği) elde edilmiştir.
2. Pipet 1,5 ml mikrosantrifüj tüp dibine boya 1 ul.
3. Yaklaşık 3 saat 65 ° C ısıya bloğunda yer tüpler kullanmadan önce soğutmak için, en az 30 dakika süre ile oda sıcaklığında sıvı, daha sonra bir yerde tüplerin buharlaştırılması için. Bu kuru katı boya dsRNA tabanda çözeltide sulandırmak olur.

3. çekin Enjeksiyon iğneleri

1. 10-30 um ucu çapına ısıtılmış bir iğne çektirmenin kullanarak borosilikat cam iğneler çekin. hayır Isıtıcı ayarı: Pull ayarları karşılık gelmektedir. = 100 1, Isıtıcı ayarı yok. 2 = 70.
2. iğne ince ucu zarar vermekten kaçınmak için, macun kalıp bir şerit üzerinde bir Petri kabındaki yatay tüm çekti iğne yerleştirin.
   Not: yöntemleri çekerek kılcal iğne Ek bilgiler Sıtma Araştırma ve Referans Reaktif Resource Center M daha ayrıntılı olarak bulunabilirR4 kılavuzu ^24.

4. Enjeksiyon İstasyonu hazırlayın

1. Gerekli malzemeleri toplamak: Cam microcapillary iğneler ince ucu, mikroenjektör, ince filtre kağıdı ve kalın filtre kağıdı, Petri, transfer pipetler, boya fırçası ve diseksiyon ışık mikroskobu çekti.
2. Mikroenjektör kılavuzunda belirtildiği gibi Mikroenjektör hazırlayın ve puls başına istenen hacme (örn puls başına 69 nl maksimum) enjeksiyon seviyesini ayarlamak.
3. Bir mikroskop altında manevra kolay bir platform üzerinde (örneğin, bir Strafor tüp raf düz tarafı), üstüne ince filtre kağıdı ile iki filtre kağıdı yaprak yığını ve kenarlarda bant ile sabitleyin.
4. buz üzerinde her dsRNA ayrı renkli boya tüpleri çözüm ve yerin 10 ul tekrar süspansiyon.

5. Enjeksiyon için Pupalar toplayın

1. iyonu giderilmiş su, 10 ml ve toplama ~ 50, uçuk pupa (Duri doldurun küçük 60 mm x 15 mm Petri kabıBir tek kullanımlık plastik transfer pipet kullanarak bir insectary tepsiden gelmesine sonra ilk 24 saat) ng.
2. Karanlık manikür tabaklama orta sahip herhangi bir pupa çıkarın.
   Not: kütikül tan başladığında, bu çok daha yüksek öldürücülüğü manikür ve enjeksiyon sonuçlarını nüfuz zorlaşır.

6. dsRNA Enjeksiyon

1. Diseksiyon mikroskobu altında, ince forseps bir çift enjeksiyon iğnesinin distal ucu kesiyorum.
2. (3 inç, 30 gauge iğne ile bir şırınga kullanılarak) mineral yağı ile iğne dolgu ve mikroenjektör ile aşırı bir yağ atarak iğne hazırlayın.
3. Ön dsRNA azami miktar ile enjeksiyon iğnesi doldurmak ve sıvı dağıtılmasını sağlamak için mikroskop altında bir darbe çıkarmak. herhangi bir sıvı içine alınır ve / veya ihraç edilmesi halinde, tıkanmaya karşı İğnenin uzak ucu kontrol iğnenin microinjecto sabitlenmiş sağlamakr.
4. 1-3 pupa almak ve filtre kağıdı üzerine koyun.
5. boya fırçası yardımıyla, dorsal manikür erişilebilir filtre kağıdı üzerinde pupa yerleştirin ve filtre kağıdı üzerinde itin ve herhangi bir aşırı su absorbe fırça kullanın.
6. fırça ucu ile pupa stabilize ve pupa dorsal yüzeyi ile ilgili olarak yaklaşık 30 ° 'lik bir açıyla Göğüs ve karın arasında dorsal manikür içine iğne takın. Enjeksiyon pupa ve iğnenin arka ucuna doğru yönlendirilmelidir anterior-to-posterior yönde hareket ettirilmelidir.
7. hemolimf içine 3 ug / ul dsRNA çözeltisi iki bakliyat (darbe başına 69 nl) enjekte edilir ve vücutta renk dağıtımı için kontrol edin. renk tespit edilmesi halinde, tıkanması ucu temizlemek için hafifçe enjeksiyon iğne konumunu vardiya ve sıvı teslim tekrarlayın.
8. yavaşça kültür için suya iğne pupa taşımak için ıslanan fırça kullanın. TO ışık temas üzerine fırça sopa gerekir pupa.

7. Post-enjeksiyon Koşulları

1. Uygun hava akımı (örneğin, örgü kafes ya da örgü kapaklı kap) ile bir sivrisinek kafes içine enjekte pupa ile Petri kabı yerleştirin. Pupa yetiştirme koşulları, 27 ± 3 ° C sıcaklıkta sürekli kalması% 75 ± 5 nem ve olmak bir ışık altında olmalıdır: 8 saat: 16 karanlık döngüsü.
2. Yetişkin besleme için örgü glukoz çözeltisi (ağırlık / hacim), 10% hazırlayın ve sivrisinek kafesinin bir çözelti, doymuş pamuk yerleştirin.

8. demonte değerlendirin

1. İstenen zaman noktası (ler) de, kontrol grubuna kıyasla, deneme dsRNA enjekte edilen böcek fenotipleri değerlendirmek.
   1. -20 ° C'de yaklaşık 2-3 dakika boyunca yetişkin aşağı soğutma 2 ° C'de soğuk plaka aktarılması ve 15X bir mikroskop kullanılması ile bir sahte-tümör oluşumunu belirleyerek gün dsSRPN2 ve dsLacZ böcekler değerlendirilmesiaydınlık aydınlatma ile büyütme. değerlendirmenin ardından, insectary koşullarında (27 ± 3 ° C,% 75 ± 5 nem) yetişkinleri dönün.
      Not: Bu protokolde kullanılan deney ve kontrol dsRNAs sırasıyla dsSRPN2 ve dsLacZ vardır. kontroller için uygun birçok seçenek vardır; Bununla birlikte, bu önerilen olduğu fenotip ve / veya sentezleme kolay ve / ya da mıktarı [örneğin, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qRT-PCR), Western Blot] kullanılmalıdır (örn mikroskopi keserek) görüntülenmiştir olan pozitif kontrol Western blot ve QRT-PCR ile, bu teknik. SRPN2 protein ve transkript miktarının öğrenme zaman, sırası ile, ve ark. (2005) ²¹ Michel tarif edilmiştir.

Sonuçlar

Gen KD verimleri enjeksiyon erken pupa aşamasında gerçekleştirilir optimum sonuçlar, manikür bronzlaşma seviyeleri düşük olduğunda (Şekil 1A, sol ve 1B) için pupa enjeksiyon. Genellikle 24 saat, enjeksiyonu takiben artan pupa ölümle sonuçları (Şekil 1A, merkez ve sağ) sonra, bronzlaşma ve manikür sertliği artmış. Pupa gelişme oranı insectary koşullar ve yoğunluğu ^24,25 bağlı olarak değişebilir; Bu nedenle, görsel pigmentasyonu değerlendirmek için en iyisidir.

Enjeksiyon işlemi sırasında Kılcal iğne posterior yönde (Şekil 2A) anterior yaklaşık 30 ° 'lik bir açı ile dorsal deri içine sokulur. İğne eklenir ve dsRNA +% 0.01 sonra (a / h) FGD dağıtıldığı, boya dağılımı (hemolimf içinde Figu belirgindir) 2B'ye yeniden.

Pupa yetişkin çıkması değerlendirilmesi FGD olmayan enjekte kontrol (Şekil 3A)% 96.7 çıkması ile karşılaştırıldığında,% 70 çıkması arasında bir ortalama oranı saptandı (ağırlık / hacim),% 0.01 ile enjekte edilir. Notun, pupa halinde kısmi çıkması olmayan kalan sivrisinekler (Şekil 3B) çok sayıda gözlendi. Enjekte edilmiş hayvanların ortaya süresinde bir gecikme (Şekil 4A) veya her iki cinsiyet (Şekil 4B) ile ilgili taraflı etki gösterirler. Yetişkin hayatta kalma ek değerlendirme 10 sonrası ortaya çıkış sonrası yetişkin hayatta kalma (Şekil 4C) üzerinde herhangi bir belirgin etki ortaya güne kadar yürüttü.

KD kalite Doğrulama devirme ve bir pozitif kontrol olarak ^21,22 demonte SRPN2 ile ilişkili melanotik sözde tümör (koyu pigmentli doku küme) fenotip ile değerlendirildi Bir negatif kontrol olarak dsLacZ enjeksiyonu ile bağlantılı fenotipler olmaması. ortaya çıkan erişkin sivrisinek gün 8 enjeksiyon sonrası (günde 6-7 sonrası ortaya) de değerlendirildi. Melanotik sözde tümörleri (Şekil 5A ve 5B) dsSRPN2 genel% 93.5 üst deri yoluyla gözlenmiştir DsLacZ yetişkin sivrisinek (Şekil 6A) 0%. Koyu melanized doku Kümeler pigmentli yamalar (Şekil 5C) diseksiyonu üzerine tespit edilmiştir. Sözde tümörler gibi erken gün 3 sonrası ortaya çıkması olarak yetişkin manikür görünür ve aynı zamanda dsSRPN2 hemolimf ve bağırsak dokularında bir alt kümesi mevcuttu (veriler gösterilmemiştir). 5 enjeksiyon sonrası (erken yetişkin safha) 'de, önemli ölçüde dsSRPN2 bölgesindeki SRPN2 düzeyleri azalmıştır, ancak dsLacZ veya enjeksiyon hemolimf protein izolatları olup (Şekil 6B) görüldü.

ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg "/>
Şekil 1: pupa dsRNA enjeksiyon için Gelişimsel evreleme yetişkin aşamaya optimum hayatta kalma ve ilerlemesinde dsRNA sonuçlarının erken pupa enjeksiyonu.. Manikür pigmentasyon düşük seviyelerde (A, sol, ve B) ilk 0-24 saat aşağıdaki pupa devresi içinde görülebilir. Fakir hayatta kalması için orta olarak pupa kütikül önceki enjeksiyon (A, merkez ve sağ) sonuçları Bronzlaşma.

Şekil 2:. Anterior yaklaşık 30 ° 'lik bir açı ile enjeksiyon pozisyonu ve dorsal deri içine, boya etiketli dsRNA'nın boya etiketli dsRNA (A) Kılcal iğne enjeksiyonuyla dağılımı ve yönleri posterior. (B) boya gözle pupa hemolimf dağıtılır. % 0.01 F ile etiketlenmiş 138 nl dsRNA enjeksiyon hacmi,GD (a / h).

Şekil 3:. Enjeksiyon sonrası ergin çıkışı (A) pupa% 70 olmayan enjekte kontrol (n = 60) 96.7% göre (n = 60) (a / h) başarılı bir şekilde ortaya çıkan% 0.01 FGD enjekte. Üç biyolojik çoğaltır yapıldı. Pupa durumda (B) kısmi ortaya dağılan sivrisinek sayıda gözlenmiştir. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder.

Şekil 4: Emergence oranı, cinsiyet değerlendirme ve yetişkin hayatta kalma (A) non-enjekte pupa kıyasla Karşılaştırılabilir ortaya süreleri,% 0.01 FGD (24 saat =% 80 ve 48 saat =% 20) ile pupa enjeksiyonundan sonra gözlenmiştir (24. hr =% 83 ve 48 saat =% 17). (B ) Yaklaşık olarak eşit erkek ve dişi yetişkin ortaya çıkması% 0.01 OGG enjekte pupa (dişi =% 48 ve erkeklerde =% 52) ve non-enjekte pupa (dişi =% 52 ve erkeklerde =% 48) gözlendi. (C) Yaşam analizi% 0.01 FGD enjeksiyon gününde 10 sonrası ortaya kadar değerlendirilir, yetişkin hayatta etkisi olmadığını ortaya koymaktadır. Sonuçlar üç bağımsız enjekte% 0.01 FGD deneyler (n = 60) ve non-enjekte (n = 60) pupa (kadın ve erkek eşit sayıda) veri temsil etmektedir. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder.

Şekil 5: Sözde tümör pozitif kontrol fenotip başarılı demonte yansıtan Sözde tümörler (A) karın ve -injected dsSRPN2 (B) torasik manikür gözlenen, ancak gün 8 sonrası enjeksiyon de -injected yetişkin sivrisinek dsLacZ değildi..(C) Yüksek büyütme (400X) manikür ve pigmentli yamalar diseksiyon görüntüleme (a), (b) koyu melanized hücrelerin kümeleri ortaya koymaktadır.

Şekil 6: sözde-tümör oluşumu miktarının belirlenmesi ve SRPN2 protein düzeyleri azalmıştır (A) Pupa aşaması enjeksiyonları 0 dsLacZ kontrollerin% (n = 19) ile karşılaştırıldığında (n = 21) dsSRPN2 yetişkinlerin% 93.5 sözde tümör oluşumuna neden olmaktadır. . Sonuçlar gün 8 sonrası enjeksiyon aldı. (B) bir Western blot (sol) gösterir dsSRPN2 bölgesindeki SRPN2 düzeyleri azalmıştır, ancak dsLacZ veya enjeksiyon hemolimf proteini izolatı (gün 5 enjeksiyon sonrası). Sonuçlar Üç bağımsız deneyden göre. 1000, 1: 2000, sırası ile kullanılan anti-SRPN2 ²¹ ve anti-SRPN3 ²⁶ antikoru seyreltileri 1 idi. Keçi anti-RA5000: BBIT IgG-HRP (Ürün sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) 1 de kullanıldı. Tüm protein düzeyleri eşleştirilmemiş t testi ile karşılaştırıldı istatistiksel SRPN3 bant yoğunluğu (ImageJ Yazılım, NIH, Bethesda, MD), normalize tarafından (sağda) sayısal ve bulundu. P <0.05: * P ≥0.05 NS (önemli değil). Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder.

Tartışmalar

Sivrisinekler transgenik olmayan RNAi uyaran için mevcut yöntemler yetişkin hemocoel ^12,13 veya RNAi tetik kaplı nanopartiküller ^14-17 veya mikroalg tabanlı dsRNA ¹⁸ molekülleri larva beslenmesi içine dsRNA direkt enjeksiyon içerir. yetişkin sivrisinek Hedefleme, son derece değerli iken, erken gelişim dönemlerinde işlev genlerin çok sayıda hariç tutabilirsiniz. larvaların başlatılan demonte pupa aşamasında değişkeni proteininin kalıcılık potansiyeli, kısmen, yetişkin safhasında tutarsız fenotipleri verebilir. Bu nedenle, daha tam yetişkin aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için gen öncesi yetişkin gelişim evreleri sırasında fonksiyonları, yanı sıra gelişmiş yeteneklerini değerlendirmek için bir araç sağlayacaktır pupa gelişimi sırasında RNAi başlatarak standartlarını hedefleyen ek bir yöntem tanıtan. dsRNA enjeksiyon veya ifade, demonte genin sebat dayalı gen demonte bir yaklaşım olduğu gibitahmin edilemez. Bu nedenle, transkript veya protein düzeyleri ilgi gelişim dönemlerinde ilgi gen için değerlendirilmelidir. SRPN2 dsRNA enjekte hayvanlarda SRPN2 için gün 5 post-enjeksiyon protein seviyelerini düşürmüştür biz bir devamı gözlemlemek rağmen, bu tür protein ciro ve yarılanma ömrü gibi faktörler farklı hedefler için farklı olabilir. İyi konsantre edilir dsRNA enjeksiyon için kullanılacak olan, hem de, elde etmek için önemlidir ve bir agaroz jeli üzerinde sağlam görünür. Biz demonte sonuçlar yeterli değilse deneyci bu faktörler yeniden değerlendirmek tavsiye ve dsRNA ilgili konsantrasyonları spesifik gen hedefleri için ampirik test edilmesi gerekebilir.

Biz An pupa evresinde RNA girişim başlatılması için bir yöntem açıklanmaktadır. gambiae gelişme. Bu yöntem, doğrudan erken pupa hemocoel içine dsRNA mikroenjeksiyon yoluyla tanıtılması dayanır ve enjeksiyon kalitesinin değerlendirilmesi için izin verirboya etiketli dsRNA'nın kullanımı. Enjeksiyon kalitesini görselleştirmek için yeteneği başarılı demonte sağlamak için kritik donanım oluşturur ve yetişkin sahnede odaklanarak en önce bildirilen dsRNA tabanlı protokoller kabul edilmemiştir enjeksiyon tabanlı gen demonte bir yönünü oluşturmaktadır. Bu gelişim döneminde, bu kritik gelişimsel aralık sırasında bir rol oynayabileceğini genlerin başlangıcında pupa hedefleyerek, ya da yetişkinlik erken aşamalarında fonksiyonel değerlendirilebilir. Ayrıca, bu yöntem metamorfoz sırasında erişilebilir hücrelerde dsRNA hücrelerine teslim ve RNA girişim kurulması mümkün kılabilir, ancak tam oluşmuş yetişkin sivrisinek az erişilebilir.

Harker ve ark tarafından yapılan yeni bir mikrodizi analizi. (2012) bir 560 belirledi. yukarı regüle veya embriyo yetişkin arasında değişen, farklı gelişim evreleri sırasında en az 4 kat aşağı-regüle edildi gambiae transkript. 560 transkript tespit 309 bir dizi pupa gelişme ²⁷ sırasında up-regüle edildi. Bu bulgular pupa aşamasında meydana olanlar, organizma başkalaşım uğrar sırasında bir aralık da dahil olmak üzere sivrisinek gelişimi boyunca farklı gen ifadesi için birçok gereksinimleri vardır düşündürmektedir. An dahil olmak üzere birçok böcek türünün, içinde. gambiae, bu tür gelişme (yani, pupa cuticular ve kitin-bağlayıcı proteinlerin) olarak süreçlerine dahil genler ^27-31 ve bağışıklık tepkisi (yani, Toll-benzeri reseptör proteinler) ^27,32-34 yüksek pupa evresinde ifade edilir. Bir tam olarak oluşmuş yetişkin ortaya sonra, çevresel ve fizyolojik ³⁵ değişikliklere yanıt olarak gen ifadesini yok devam edilir. Özellikle, yetişkinliğin ilk gelişimi sırasında, bir gelişim genlerin (örneğin, yetişkin kütiküler ve Sarkoplazmik protein) ^36, ekspresyonunda artışın yanı sıra diğer önemli genler (yani Sperm spesifik protein ve sitokrom P450 metabolizması enzimleri) ^27,36.

Bu protokol, SRPN2 geliştirilmesinde kullanılan pozitif kontrol, bir IS. gambiae, serin proteaz inhibitörü (serpin). SRPN2 böcek melanization, böcek ^21,22 bir geniş spektrumlu doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin negatif regülasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Sözde-tümör oluşumu ^21,22 kolayca ışık mikroskobu kullanılarak gözlenmiştir bir fenotip ile, yetişkin sivrisinekler sonuçlarında SRPN2 demonte. Bu farklı fenotip kolaylıkla canlı böcekler gol olabilir göz önüne alındığında, biz ilk pupa aşaması RNAi enjeksiyonlar için SRPN2 kullanılır. Buna ek olarak, SRPN2 böylece erken yetişkin pupa aşaması RNAi enjeksiyonu ve fonksiyonunun değerlendirilmesi için iyi bir hedef temin edilir, tüm gelişim aşamalarında ³⁷ sırasında ifade edilebilir. Biz geliştirdik yöntem uyaran benzer yetişkin melanotik pseud yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir gelişme pupa aşamasında yapılan dsRNA enjeksiyonu bir sonucu olarak o-tümör oluşumu. Bu protokolü geliştirirken, biz (yani, larva-pupa tüy dökme sonra ilk 24 saat) optimum yetişkin çıkmasını elde etmek için kritik öneme sahiptir erken pupa gelişme sırasında enjeksiyon gözlemledim. kötü çıkması sonrası enjeksiyon elde edilmesi halinde, biz daha az kapsamlı manikür sertleştirme ile pupa elde etmek ve erken pupa aşamalı enjeksiyon elde edilir sağlamak için, daha doğru larva evreleme öneririz. Ayrıca, enjeksiyon sırasında optimum çıkması oranlarındaki manikür sonuçlarına hasar ve artan büyütme minimize hayvanın sadece amaçlanan bölge delinmiş emin yardımcı olabilir. İğne ventral manikür yoluyla delinme olursa, boya etiketli sıvının havuzu pupa dış yüzeyinde belirgin olacak ya da filtre kağıdı doyurmak olacak. Oldukça fazla kütikül patlağı olan herhangi bir pupa atmak için tavsiye edilir.

Yetişkin sivrisinek enjeksiyonları bir performansla laboratuarların geniş deneyimleri ile jove_content ">, daha önce tanımlanmış olan mikroenjeksiyon yaklaşımlar pupa RNAi deneylerinde kullanılmak üzere basit bir protokol modifikasyonlar ile uyarlanabilir. Genel olarak, bu yöntemin amacı, araştırmacılar yeteneği sağlamak için genetik analizler ayrıca yeni vektör kontrol stratejilerinin geliştirilmesini destekleyecek araştırma sağlayarak, yapılabilir ters sırasında zaman çerçevesini genişletmek. İlginçtir, bu tür Rhodnius prolixus ve Spodoptera frugiperda gibi diğer türler, deneyler, susturulması etkileri çok olma eğilimi geni ortaya ön yetişkin sırasında başlatılan zaman büyük gelişme tüm aşamalarında. ^38,39 aşamaları, demonte RNAi-aracılı gen hız ve gen susturma kalıcılığı ve hedeflenen genler tarafından kodlanan proteinlerin stabilitesi ile ilgili hususlar geçerlidir. İdeal RNAi hedef genlerin protein, şifreleyenlere olma eğilimindedirn veya RNA kısa bir yarılanma ömrüne ve yüksek devir hızı ^11,40 vardır.

Transgenik RNAi stratejiler yetişkin öncesi aşamalarında ve hızını RNAi kalıcılığı ile ilgili dikkat edilmesi gereken adres için kullanılabilir olsa da, transjenik teknikler pek çok sakıncaları (sivrisinek çiftleşmelerin böcekleri oluşturmak için örneğin, transjenik çizgileri üretimi için gerekli olan süre, deney zaman çerçeveleri düzenlenmiş dsRNA ifadesi ve transgenik stokların bakım) ile. Buna karşılık, bizim protokol pupa gelişimi sırasında ve köken ve metamorfoz sırasında erişilebilir ancak erişkinlerde daha az erişilebilir hücre tiplerinde gen demonte başlatmak için daha kolay ve hızlı bir yöntem tanıyor. boya etiketli dsRNA süspansiyonlar kullanımı kolay enjeksiyon başarı değerlendirilmesi ve pupa içinde tanıtılan malzemenin dağıtılması için izin verir. yetişkin olarak enjekte edilmiş hayvanların, karşılaştırıldığında pupa enjekte yetişkinlerde tümör oluşumu başlangıcı ile ilgili verilerimiz, init ile tutarlıdırve iation pupa aşamasında demonte RNAi aracılı. Bizim G3 sivrisinek hattı kullanılarak ve insectary koşullar altında, biz yetişkinlerin enjeksiyon sonrası üç ila beş gün sonrası ortaya çıkması enjekte kadar erken 10 gün gibi yetişkin melanotik sözde tümör oluşumunu gözlemlemek. Erken pupa evre enjeksiyon yaparak, biz erken beş gün enjeksiyon sonrası (yani, üç dört gün ortaya çıkması sonrası) olarak görünür melatonik sözde tümör oluşumunu gözlemlemek. Bu veriler, bu yöntem daha önce altında çalışılmış gelişim döneminde (yani, pupa gelişme) döneminde gen demonte başlatılmasını sağlayan ima. Bizim boya etiketleme yöntemi nedeniyle de tüm larva instars sırasında manikür saydam doğası gereği, yeni larva enjeksiyon protokollerinin geliştirilmesi için yararlı olabilir. Bu çalışmada kullanılan kontrolü yok etme fenotipi görüntülemek için yetişkin aşamaya ilerlemesini gerektirirken, gelecekteki deneyler sağlayacak erken pupa enjeksiyonundan sonra pupa safha spesifik fenotipleri değerlendirmekBöyle geç pupa gelişme gibi ek gelişim dönemleri içine bu yöntemin genişleme ile ilgili değerli bir fikir. Özet olarak, bu yöntem, RNAi aracılı gen demonte pupa aşaması başlatılması için değerli bir RNAi protokolü sağlar vektör böcek araştırma grupları içinde kullanılmak için uygun fonksiyonel genomik araçları genişler.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEGAscript RNAi kit	Ambion	AM1626
Nanoject II injector	Drummond	3-000-204
Nanoject II foot switch	Drummond	3-000-026
Borosilicate glass capillaries	Drummond	3-000-203-G/X
Glass micropipette puller	Narishigne	PB-7
Fast Green FCF dye	Sigma	F7258	Can substitute with a non-toxic food dye.
Plastic transfer pipettes	Thermo Scientific	1371150	¼ inch cut from tip to create a wider opening.
Whatman “thin” filter paper	GE Healthcare	1001-090	This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.
Western blot “thick” filter paper	BioRad	107-3931	This is the filter paper generally used for Western blots.
Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Paint brush (size 0)	Michael’s Art	10474940	Brush size and brand can vary based on availability and user preference.
Dissecting light microscope	----	-----	This can vary based on availability and user preference.