Transducción-Trasplante modelo de ratón de Neoplasias mieloproliferativas

Resumen

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Resumen

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

Introducción

Transducción-trasplante es un método útil para modelar neoplasias hematológicas en ratones. Esta técnica ha sido particularmente valiosa para el estudio de las neoplasias mieloides que se remontan a la primera demostración de que la expresión ectópica de BCR-ABL1 podría recapitular fielmente la leucemia mielógena crónica en ratones ^1. Esta técnica ha facilitado posteriormente el amplio estudio de JAK2 ^V617F y MPL ^{W515K / L} mutado neoplasias mieloproliferativas (MPN).

NMP son un grupo de neoplasias malignas hematológicas caracterizadas por la sobreproducción de células mieloides maduras y fibrosis de la médula ósea. Estas enfermedades generalmente surgen de la expansión clonal de una célula madre hematopoyética que ha adquirido una mutación somática en cualquiera Jak2, MPL, o CALR. Transducción-trasplante de JAK2 ^V617F y MPL ^W515K modelos ^{/ L} presentan las características clínicas de la policitemia vera y mielofibrosis ^{2 - 5 <}/ Sup>. Recientemente, un modelo de ratón de la MPN calreticulin mutado también ha sido generado con el método de la transducción-trasplante ^6. Estos ratones desarrollan una enfermedad esencial trombocitemia-como con el aumento de las plaquetas, aumento del número de megacariocitos, y fibrosis de médula ósea. En conjunto, estos modelos no sólo han proporcionado la oportunidad de conocer mejor la patogénesis molecular del MPN, sino también la capacidad para desarrollar y estudiar la terapéutica en un entorno preclínico.

Este manuscrito ofrece una descripción detallada de la metodología de la transducción-trasplante con un enfoque en la mutación CALRdel52. Esta técnica implica el trasplante de células de médula ósea transducidas con retrovirus que expresan el mutante constructo en ratones receptores singénicos irradiados.

Protocolo

Este estudio fue aprobado y llevado a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California, Irvine. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia con isoflurano y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.

1. Generación de Ecotropic Retrovirus

1. Preparar plásmidos de alta calidad con una concentración de al menos 1 g / l usando un kit maxi-prep comercial o la purificación de cloruro de cesio.
   NOTA: Estos incluyen un vector de MSCV columna vertebral que codifica el gen de interés (en este caso CALR ^7,8) y marcador de elección (GFP, Neo, etc.), así como un plásmido de empaquetamiento ecotrópico, codificación gag-pol-env (en lo aquí como plásmido).
2. Descongelación y expandir las células 293T de bajo pasaje en DMEM suplementado con FBS al 10% y L-glutamina con penicilina / estreptomicina (D10). Placa de 5 x 10 ⁶ células en un tejido de 10 cm placa de cultivo tratadas en una atmósfera humidificadacultura incubadora de tejidos a 37 ° C y 5% de CO _2.
3. Expandir las células 293T en cultivo. En el día antes de la transfección, lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS y el sobrenadante aspirado en un matraz de vacío.
4. Para trypsinize células, añadir 2 ml 0,05% de tripsina y se incuba platos en un incubador de cultivo tisular humidificado durante 2 - 3 min a 37 ° C y 5% de CO _2.
5. Para detener la tripsinización, añadir 3 ml de D10 a plato y las células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml. Girar las células a 400 xg durante 10 min.
6. Aspirar el sobrenadante en un frasco de vacío sedimento celular y resuspender en 2 ml de D10.
7. Contar las células por exclusión de azul de tripano usando un hemocitómetro.
8. Semilla de 2 x 10 ⁶ células por placa de 10 cm en tres placas de cultivo de tejidos tratados por el virus generados.
   NOTA: Para obtener resultados óptimos, no permita que las células se exceden 30 - 50% de confluencia en el momento de la transfección o un rendimiento deficiente del virus puede ser obtenida.
9. Inmediatamente antes de la transfección,medios de aspirado en un frasco de vacío y reemplazan con 5 ml de D10 fresco.
10. Por cada 10 cm placa de Petri a transfectar preparar un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril individual.
11. Pipetear 760 l de medio de suero reducido en cada tubo de microcentrífuga, a continuación, añadir cuidadosamente 40 l de reactivo de transfección directamente en los medios de comunicación. Incubar los tubos en la campana de cultivo de tejido a temperatura ambiente durante 5 min.
12. Añadir 30 g de MSCV vector con el gen de interés (15 mg si se utiliza el vector vacío), así como 5 g de plásmido a cada tubo respectivo y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo. Se incuba a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejido durante 15 min adicionales.
    NOTA: Los vectores más pequeños tienden a tener rendimientos virales más altas.
13. Añadir con cuidado el volumen total de cada reacción (aproximadamente 800 l) gota a gota en su respectiva placa de 10 cm de Petri y se incline suavemente el plato de lado a lado para mezclar. Volver a la cu células del tejido humidificadolture incubadora.
14. Después de un 8 hr o incubación durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos, medios de aspirado en un frasco de vacío y suavemente reemplazan con 10 ml de D10 fresco.
15. A las 48 horas después de la transfección recoger el líquido sobrenadante en una jeringa de 35 ml y se filtra a través de una membrana de 0,45 micras para eliminar los restos celulares.
16. OPCIONAL: Colocar 10 ml de vuelta fresca D10 en las células 293T y el virus adicional puede ser cosechado a 72 horas después de la transfección.
17. Disponer de células 293T en residuos biológicos peligrosos cuando se recoge ningún virus adicional.
18. sobrenadante viral alícuota en volúmenes de un solo uso (por ejemplo 1 ml para el título del virus o 6,5 ml para la infección BM). virus de flash-congelación con nitrógeno líquido y el virus se almacena a -80 ° C.
    NOTA: Evitar ciclos de congelación / descongelación repetidos, ya que reducen en gran medida el título de virus.

2. Determinar el título viral relativa por Citometría de Flujo

1. Descongelar las células 3T3 y mantener en D10. Cultivar las células en un 10 cmde cultivo de tejidos plato tratada en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 ° C y 5% de CO _2.
2. Realizar título viral por triplicado. Para preparar las células, lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS y el sobrenadante aspirado en un matraz de vacío.
3. Para trypsinize células, añadir 2 ml 0,05% de tripsina y se incuba platos en un incubador de cultivo tisular humidificado a 37 ° C y 5% de CO _2.
4. Para detener la tripsinización, añadir 3 ml de D10 a plato y las células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml. Girar las células a 400 xg durante 10 min.
5. Aspirar el sobrenadante en un frasco de vacío sedimento celular y resuspender en 2 ml de D10.
6. Contar las células por exclusión de azul de tripano usando un hemocitómetro.
7. Seed células 3T3 a una densidad de células de 1 x 10 ⁵ en quince 60 mm placas de cultivo de tejidos tratados e incubar durante la noche.
8. Hacer 1: 3, 1:10, 1:30, y 1: 100 diluciones de sobrenadante viral descongelado utilizando D10 en un total de 1 ml. También incluir un control libre de virus.
9. me aspirardia de células 3T3 en un matraz de vacío y reemplazar con 4 ml de D10.
10. Superposición de las células 3T3 con las diluciones de sobrenadante viral y añadir polibreno a una concentración final de 8 mg / ml a cada plato. Incubar durante 48 horas en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de _CO2.
11. Determinar el título viral relativa por citometría de flujo:
    1. Para lavar las células, aspirar los medios de comunicación en un matraz de vacío y añadir 5 ml de PBS.
    2. Aspirar el PBS en un matraz de vacío. Añadir 1 ml 0,05% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 2-5 min para separar las células del plato.
    3. Añadir 3 ml de D10 y la pipeta hacia arriba y abajo para separar las células restantes de la placa. Transferir las células a un tubo de FACS y se centrifuga a 400 xg durante 10 min.
    4. Decantar el sobrenadante y lavar las células con 3 ml de PBS. Centrifugar a 400 xg durante 10 min y el sobrenadante se decanta. Resuspender en 200 l de PBS.
    5. Las células se ejecutan en un citómetro de flujo ^9. Recoger entre 20.000 - 30.000 eventos dentro de tque viven puerta celular (determinada por el FSC frente a SSC) y calcular el porcentaje de GFP ⁺ y ^- GFP células.
       NOTA: El título viral se considera aceptable cuando la dilución 01:30 de los rendimientos de sobrenadante viral por lo menos 50% ⁺ GFP células 3T3. Si a continuación, se pueden obtener resultados esta dilución en células GFP menos de 50% ⁺ de transducción de resultados subóptimos. El cálculo para determinar el título viral fue adaptado de Limón et al. , Blood (1997) ^9.
    6. Para determinar el título de virus relativa, utilice la ecuación: el título del virus = unidades formadoras de partículas (UFP) / ml = [(Número de células 3T3 × Frecuencia de células GFP ⁺⁾ / volumen de sobrenadante (ml)] x Factor de dilución.

3. transducir donantes células de médula ósea

1. Para preparar ratones donantes de médula ósea (BM) de la cosecha, primero anestesiar los ratones por vaporizador de isoflurano con un caudal de 5% suplementario combinadode oxígeno a 1 L / min. Una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta.
   NOTA: Los ratones donantes (menos de 8 semanas de edad) se deben preparar 5 días antes de la cosecha de médula ósea (8 días antes del trasplante). Uno ratones donantes proporcionarán suficientes células durante al menos 2 receptores.
2. Inyectar 150 mg / kg 5-fluorouracilo (5-FU) a través de la inyección de retro-orbital en ratones anestesiados utilizando una × ½ "aguja 27 G.
   ¡PRECAUCIÓN! 5-FU un agente de quimioterapia contra el cáncer. Siempre maneje 5-FU dentro de una campana de humos química certificado o una cabina de bioseguridad por conductos. Consultar con el comité de seguridad en el laboratorio y animal de la institución para determinar el etiquetado apropiado de los ratones tratados con 5-FU.
   1. Coloque el ratón anestesiado en su lado y restringir utilizando tanto el pulgar y el índice tal que el ojo sobresale ligeramente de la cabeza.
   2. Comenzando con el lateral de la aguja para el canto medial y con el bisel hacia arriba, inserte la aguja en un 45° de ángulo en la dirección medial y se detendrá cuando se inserta la aguja hasta la mitad. Inyecte lentamente las células y eliminar eliminar cuidadosamente la aguja.
      NOTA: Si esta técnica se realiza correctamente, el ojo debe retraerse ligeramente y sin resistencia, deben ser sentidas tras la inserción de la aguja.
   3. Examine el ratón para detectar cualquier signo de daño tales como inflamación o sangrado.
3. Extracción de la médula ósea después de 5 días de tratamiento con 5-FU (3 días antes del trasplante).
   1. Anestesie ratones por vaporizador de isoflurano con un caudal de 5% de oxígeno suplementario combinado a 1 L / min. Una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta.
   2. Sacrificar el ratón por dislocación cervical. Esterilizar ratón pulverizando generosamente con EtOH al 70% hasta que la piel se moja.
   3. Usando tijeras de disección, hacer una incisión en la piel y la fascia diseccionar lejos de los músculos de las piernas. A continuación, diseccionar la pierna lejos de ratón mediante el corte del fémur en la cadera y la tibia en el tobillo.
   4. curvala pierna en forma de "L" y separar cada hueso de la pierna por el corte en la articulación de la rodilla con las tijeras de disección.
   5. Para eliminar el cartílago en los extremos distales de cada hueso de la pierna, utilizar las tijeras de disección muscular para raspar suavemente hacia un extremo del hueso de la pierna hasta que se desacopla del cartílago.
   6. El uso de una jeringa con una aguja de 27 G x ½ pulgadas, a ras cada hueso de la pierna con PBS suplementado con 2% de FBS sobre una membrana de nylon 100 mM en un tubo cónico de 50 ml. hueso Flush hasta que el hueso se vuelve blanco para maximizar el número de células cosechadas.
   7. Utilice el émbolo de una jeringa para triturar las células a través de la membrana de nylon en el tubo cónico de 50 ml para obtener una suspensión de células individuales. Repita con la otra pierna del ratón.
4. centrifugar las células a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg y desechar el sobrenadante. Resuspender en tampón BM 5 ml de cloruro de amonio potasio (ACK) para lisar las células rojas de la sangre. Se incuban las células en hielo durante 10 min.
5. Llenar el tubo con PBS para detener la lisis celular. CentriFUGE células a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg y desechar el sobrenadante. Repetir el paso de lisis si el sedimento BM es de color rojo.
6. Volver a suspender en 5 ml de PBS y contar las células por exclusión de azul de tripano usando un hemocitómetro.
7. Resuspender las células a 2 x 10 ⁶ células por m con el coctel pre-stim 2x que contiene DMEM suplementado con 20% de FBS, L-glutamina, penicilina / estreptomicina, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) y SCF (112 ng / ml). Placa de 2 ml por pocillo en placas de 6 pocillos.
8. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% de _CO2.
9. Añadir 2 ml de sobrenadante viral a cada uno de las células BM bien que contienen y añadir polibreno (8 mg / ml). placas de giro a 30 ° C durante 90 minutos a 1.500 xg entonces vuelven a la placa de cultivo de tejidos incubadora durante la noche.
10. suspensión celular pipeta en tubos cónicos y se centrifuga a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg, no descartan la placa. Resuspender las células en 2 ml 2x fresco cóctel antes de la estimulación por pozo y volver a los pozos originales.
11. Realizar una espinoculación ^2º repitiendo los pasos 3.7-3.9.

4. Las células trasplante de donante en ratones receptores

1. Preparar los ratones receptores singénicos para el trasplante con dosis de irradiación corporal total letal <24 h antes de la inyección de células BM.
   NOTA: la irradiación Dosis letal para los ratones Balb / c es típicamente 800-900 cGy y 1.000-1.200 cGy para C57B / 6 ^10. La dosis normalmente se divide en dos sesiones de irradiación espaciadas al menos 3-4 horas de diferencia.
2. Continuación de la etapa 3.11, las células del donante transducidas cosecha de las placas de 6 pocillos pipeteando suavemente sobrenadante en tubos cónicos. Lavar cada pocillo con 1 ml de PBS para recoger las células residuales y añadir a 50 ml tubos cónicos.
3. Añadir 0,5 ml de tripsina al 0,05% a los pocillos y se incuba a 37 ° C en la incubadora de cultivo de tejidos de 5 min.
4. Añadir 1 ml de D10 pozos y retire cualquier resto de las células por pipeteo suave. Añadir células al tubo respectivos de la etapa 4.2 y pellet por centrifugación a 4 ° C durante 10 minutos a 400 x g.
5. Lavar las células con PBS y centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 400 x g. Volver a suspender en 5 ml de PBS y contar las células usando un hemocitómetro por exclusión de azul de tripano.
   NOTA: Si el vector tiene una etiqueta GFP entonces cuantificar el porcentaje de células positivas para GFP con un citómetro de flujo.
6. Resuspender 5 x 10 ⁵ - 2 x 10 ⁶ células en 50 - 100 l de PBS para inyección en ratones.
7. Inyectar células mediante inyección retro-orbital en ratones anestesiados utilizando un 27 G x ½ "aguja estéril.
   NOTA: Otras técnicas incluyen la inyección de cola vena, esplénica, o femoral.
   1. Anestesiar ratón utilizando isoflurano y una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta.
   2. Coloque el ratón sobre su lado y restringir utilizando tanto el pulgar y el índice tal que el ojo sobresale ligeramente de la cabeza.
   3. Con el bisel hacia arriba, inserte el nEedle lateral al canto medial en un ángulo de 45 °.
      NOTA: Si esta técnica se realiza correctamente, el ojo debe retraerse ligeramente y sin resistencia, deben ser sentidas tras la inserción de la aguja.
   4. Examine el ratón para detectar cualquier signo de daño tales como inflamación o sangrado.
      NOTA: los ratones después de un trasplante tendrán recuentos sanguíneos bajos durante un número de semanas y por lo tanto son susceptibles a la infección. La profilaxis con antibióticos o el uso de agua acidificada puede ser utilizado.
8. Un mes después del trasplante, medir la GFP% en la sangre periférica como un indicador de las células del donante injertadas por citometría de flujo.
   NOTA: GFP sola no puede determinar el éxito de injerto de las células. La transducción viral puede haber fallado sin embargo, el injerto puede haber ocurrido. En este caso, se detectaron células GFP ^+, pero el injerto de las células trasplantadas se ha realizado correctamente.
   1. Tomar 10 l de sangre periférica by punción de la vena safena de la pierna con un 21 G 1 ½ "x jeringa y añadirlo a EDTA 100 mM en PBS para evitar la coagulación.
   2. Añadir 1 ml ACK a la sangre y se lisan en hielo durante 10 min. Precipitar las células por centrifugación a 400 xg durante 10 min.
   3. Aspirar el sobrenadante en un matraz de vacío y se añade 1 ml de PBS suplementado con 2% de FBS para detener la lisis. Precipitar las células por centrifugación a 400 xg durante 10 min.
   4. Aspirar el sobrenadante en un matraz de vacío y pellet se resuspende en 100 l de PBS suplementado con 2% de FBS.
   5. Ejecutar las muestras en un citómetro de flujo y recoger 300.000 eventos dentro de la puerta de células vivas (determinado por FSC frente a SSC) y calcular el porcentaje de GFP y GFP ^{+ -} células ^9.
9. Adicionalmente a 1 mes después del trasplante, realizar recuentos sanguíneos completos (CBC) utilizando un analizador de hematología veterinaria automatizado ¹⁸ para controlar la progresión de la enfermedad.
   NOTA: Continúe controlando la enfermedad por%GFP en sangre periférica y CBC mensual.
10. Para terminar el experimento, anestesiar ratón utilizando isoflurano y una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta. Sacrificio ratón por dislocación cervical y el bazo y la médula ósea de la cosecha para histopatología.
    NOTA: La duración del experimento es subjetiva y la fecha de terminación debe ser evaluada en base al fenotipo de la enfermedad se esperaba.

Resultados

La técnica de transducción-trasplante resulta en la reconstitución hematopoyética de los ratones receptores con células que expresan el gen de interés. La Figura 1 muestra una visión general del modelo de ratón de transducción-trasplante de calreticulin mutado MPN. Brevemente, retrovirus que expresan CALRwt o CALRdel52 se utiliza para infectar las células BM a partir de un ratón donante C57B / 6. Las células transducidas se trasplantan en irradiado C57B / 6 r...

Discusión

Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo llevar a cabo trasplantes de médula ósea en ratones recapitular una enfermedad esencial trombocitemia-como con la progresión de la mielofibrosis con CALRdel52 mutación como el conductor de la enfermedad. el éxito del trasplante de células que expresan los resultados CALRdel52 en un aumento de las plaquetas, la expansión de megacariocitos, y fibrosis de la médula ósea. A medida que el trasplante de médula ósea es un proceso de varios pasos, es impo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
293T cells	ATCC	CRL-11268
3T3 cells	ATCC	CRL-1658
PLASMIDS
EcoPak, also known as pCL-Eco	Addgene	12371	Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.
MSCV-IRES-GFP (MIG)	Addgene	20672	Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.
CONSUMABLES
27G x 1/2" needles	BD	305620
Fetal bovine serum	Corning	MT-35-010-CV
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Corning	MT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	MT-25-052-CI	Can be homemade
PBS	Corning	MT-21-031-CV
10cm dishes	Fisher	172931
15 ml conical tubes	Fisher	12565268
60mm dishes	Fisher	150288
Polybrene	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100um cell strainers	Fisher	22363549
50 ml conical tubes	Fisher	12565270
6-well plate	Fisher	130184
FACS tubes	Fisher	14-959-5
0.45um syringe filters	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
ACK buffer	Lonza	10-548E	Can be homemade
Recombinant murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant murine SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	Transfection reagent
1.5 ml centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
EQUIPMENT
BD Accuri C6
X-ray irradiator