Transdução-Transplante Rato Modelo de neoplasia mieloproliferativa

Resumo

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Resumo

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

Introdução

Transdução-transplante é um método útil para modelar doenças malignas hematológicas em ratinhos. Esta técnica tem sido particularmente valiosa para estudar malignidades mielóides que datam da primeira demonstração de que a expressão ectópica de BCR-ABL1 poderia fielmente recapitular leucemia mielóide crônica em ratos ^1. Esta técnica foi posteriormente facilitou o estudo extensivo de JAK2 ^V617F e MPL ^{W515K / L} mutado neoplasia mieloproliferativa (MPN).

NMP são um grupo de doenças hematológicas, caracterizado por o excesso de produção de células mielóides maduras e fibrose da medula óssea. Essas doenças geralmente surgem a partir da expansão clonal de uma célula-tronco hematopoiéticas, que adquiriu uma mutação somática em qualquer Jak2, MPL, ou Calr. Transdução-transplante JAK2 ^V617F e MPL ^{W515K L} modelos ^/ exibem as características clínicas da policitemia vera e mielofibrose ^{2-5 <}/ Sup>. Recentemente, também foi gerado um modelo de ratinho de NMP mutada-calreticulina com o método de transdução-transplante ^6. Estes ratinhos desenvolvem uma doença essencial thrombocythemia-like com o aumento das plaquetas, aumento do número de megacariócitos e fibrose da medula óssea. Juntos, esses modelos não só forneceram a oportunidade para obter insights sobre a patogênese molecular do MPN, mas também a capacidade de desenvolver e estudar terapias em um ambiente pré-clínica.

Este manuscrito fornece uma descrição detalhada da metodologia de transdução-transplante, com foco na mutação CALRdel52. Esta técnica envolve a transplantação de células de medula óssea transduzidas retroviralmente expressando o mutante de construir em ratinhos receptores singeneicos irradiados.

Protocolo

Este estudo foi aprovado e executado de acordo com as recomendações do Comité Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade da Califórnia, Irvine. Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia isoflurano e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

1. Produção de Retrovírus ecotrópico

1. Preparar plasmídeos de alta qualidade com uma concentração de pelo menos 1 mg / mL usando um kit Maxi-prep comercial ou purificação de cloreto de césio.
   Nota: Estes incluem um vector de espinha dorsal MSCV que codifica o gene de interesse (neste caso Calr ^7,8) e o marcador de escolha (GFP, neo, etc.), bem como um plasmídeo empacotamento ecotrópico, codificação de gag-pol-env (referido como aqui plasmídeo).
2. Descongelar e expandir células 293T de baixa passagem em DMEM suplementado com 10% de FBS e L-glutamina com penicilina / estreptomicina (D10). Placa 5 x 10 ⁶ células em um prato de 10 centímetros de tecido tratado com a cultura em um umidificadoincubador de cultura de tecido a 37 ° C e 5% de CO _2.
3. Expandir células 293T em cultura. No dia antes da transfecção, as células lavagem por adição de 1 ml de PBS e aspirar o sobrenadante para um balão de vácuo.
4. Para trypsinize células, adiciona-se 2 ml de tripsina a 0,05% e incubar pratos numa incubadora de cultura de tecidos humidificada durante 2-3 min a 37 ° C e 5% de CO _2.
5. Para parar a tripsinização, adicionar 3 ml D10 de prato e células de transferência para um tubo de 15 ml. Girar células a 400 xg durante 10 minutos.
6. Aspirar o sobrenadante para um agregado de células frasco de vácuo e ressuspender em 2 ml de D10.
7. Contagem das células por exclusão do azul de tripano utilizando um hemocitómetro.
8. Semente de 2 x 10 ⁶ culas por prato em três tecidos de 10 cm pratos tratados com cultura por vírus gerados.
   NOTA: Para melhores resultados, não permitem que as células de exceder 30-50% de confluência no momento da transfecção ou pode ser obtido um rendimento de vírus pobre.
9. Imediatamente antes da transfecção,media aspirado em um balão de vácuo e substituir com 5 ml D10 fresco.
10. Para cada placa de Petri de 10 cm para ser transfectada preparar um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml esterilizado individual.
11. Pipeta 760 ul de meio de soro reduzido em cada tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar cuidadosamente 40 mL de reagente de transfecção diretamente para a mídia. Incubar os tubos no capuz de cultura de tecidos à temperatura ambiente durante 5 min.
12. Adicionar 30 g de MSCV vector com o gene de interesse (15 ug se utilizando o vector vazio), bem como 5 ug de plasmídeo a cada tubo respectivo e misturar suavemente por pipetagem para cima e para baixo. Incubar à temperatura ambiente no capuz de cultura de tecidos durante mais 15 min.
    NOTA: vetores menores tendem a ter rendimentos virais mais elevadas.
13. Cuidadosamente adicionar o volume total de cada reacção (aproximadamente 800 mL) gota a gota em seu respectivo 10 centímetros de Petri e gentilmente incline o prato de lado a lado para misturar. células retornar ao cu tecido umidificadoincubadora LTURE.
14. Após 8 h ou uma incubação durante a noite na incubadora de cultura de tecidos, meios aspirado para um frasco de vácuo e colocar suavemente com 10 ml de D10 fresco.
15. Em 48 horas após a transfecção recolher o sobrenadante para uma seringa de 35 mL e filtrar através de uma membrana de 0,45 pm para remover detritos celulares.
16. OPCIONAL: Coloque 10 ml de volta fresco D10 nas células 293T e vírus adicional pode ser colhida em 72 horas após a transfecção.
17. Descarte as células 293T em resíduos de risco biológico quando nenhum vírus adicionais são coletadas.
18. sobrenadante viral alíquota em volumes de uso único (por exemplo, 1 ml de título do vírus ou 6,5 ml para a infecção BM). vírus flash-congelamento com nitrogênio líquido e vírus armazenar a -80 ° C.
    NOTA: Evitar ciclos de congelamento / descongelamento repetidos à medida que reduzir muito o título do vírus.

2. Determinar título viral Relativa por Citometria de Fluxo

1. Thaw 3T3 e manter em D10. Cultura as células em um 10 centímetrosda cultura de tecidos tratados prato numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. Realizar título virai em triplicado. Para preparar as células, lavar as células por adição de 1 ml de PBS e aspirar o sobrenadante para um balão de vácuo.
3. Para trypsinize células, adiciona-se 2 ml de tripsina a 0,05% e incubar pratos numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C e 5% de CO _2.
4. Para parar a tripsinização, adicionar 3 ml D10 de prato e células de transferência para um tubo de 15 ml. Girar células a 400 xg durante 10 minutos.
5. Aspirar o sobrenadante para um agregado de células frasco de vácuo e ressuspender em 2 ml de D10.
6. Contagem das células por exclusão do azul de tripano utilizando um hemocitómetro.
7. Semente células 3T3 a uma densidade de 1 x 10 ⁵ células em quinze 60 mm pratos de tecido de cultura tratados com e incubar durante a noite.
8. Adicione 1: 3, 1:10, 1:30, e 1: 100 de sobrenadante viral diluições descongelado, usando D10 em um total de 1 ml. Também incluem um controle livre de vírus.
9. aspirar meDiâmetro de células 3T3 em um frasco de vácuo e substituir com 4 ml de D10.
10. Sobrepor as células 3T3 com as diluições do sobrenadante viral e adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / ml a cada placa. Incubar durante 48 horas na incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO _2.
11. Determinar título virai em relação por citometria de fluxo:
    1. Para lavar as células, aspirar os meios de comunicação em um balão de vácuo e adicionar 5 ml PBS.
    2. Aspirar o PBS para um balão de vácuo. Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina e incubar a 37 ° C durante 2-5 minutos para separar as células do prato.
    3. Adicionar 3 ml D10 e pipeta cima e para baixo para destacar todas as células restantes da placa. Transferir as células num tubo de FACS e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
    4. Decantar o sobrenadante e lavar as células com 3 ml de PBS. Centrifuga-se a 400 xg durante 10 min e o sobrenadante decantado. Ressuspender em 200 ul de PBS.
    5. Células executado em um citômetro de fluxo ^9. Recolha entre 20.000 - 30.000 eventos dentro tele vive portão celular (determinado pelo FSC vs. SSC) e calcular a percentagem de GFP ⁺ e GFP ^- células.
       NOTA: O título virai é considerada aceitável quando a diluição do sobrenadante rendimentos virais, pelo menos, 50% ⁺ 3T3 células GFP 01:30. Se esta diluição resulta em menos do que 50% de células GFP ^+, em seguida, sub-óptimos resultados de transdução pode ser obtido. O cálculo para determinar título virai foi adaptado a partir Limon et ai. , Blood (1997) ^9.
    6. Para determinar o título do vírus relativo, use a equação: título do vírus = formando partículas unidades (UFP) / ml = [(Número de 3T3 × frequência de células GFP ⁺⁾ / Volume de sobrenadante (ml)] × Factor de diluição.

3. transdução de Doadores Células de Medula Óssea

1. Para preparar ratinhos dadores de medula óssea (BM) de colheita, primeiro anestesiar ratos por vaporizador de isoflurano com uma taxa de fluxo de 5% suplementar combinadaoxigénio em 1 L / min. Comprima pé para avaliar a resposta.
   NOTA: Os ratinhos dadores (menos de 8 semanas de idade) deve ser preparado 5 dias antes da colheita de medula óssea (8 dias antes da transplantação). Um camundongos doadores irá fornecer células suficientes para pelo menos 2 receptores.
2. Injectar 150 mg / kg de 5-fluorouracilo (5-FU) por meio de injecção retro-orbital em ratos anestesiados usando um 27 L × ½ "agulha.
   CUIDADO! 5-FU um agente quimioterapêutico anti-câncer. Sempre lidar com 5-FU dentro de uma Cobertura de vapores químicos certificada ou de um gabinete de biossegurança canalizado. Consulte o comitê de segurança de laboratório e animal da instituição para determinar uma rotulagem adequada de camundongos tratados com 5-FU.
   1. Posicione o mouse anestesiado em seu lado e restringir usando tanto o polegar eo dedo indicador de modo a que o olho sai ligeiramente da cabeça.
   2. Começando com o lateral, agulha para o canto medial e com o bisel voltado para cima, insira a agulha em um 45° ângulo na direção medial e parar quando a agulha é inserida no meio do caminho. Lentamente injetar células e remover remova cuidadosamente agulha.
      NOTA: Se esta técnica é realizada corretamente, o olho deve recuar um pouco e nenhuma resistência deve ser sentida após a inserção da agulha.
   3. Examine o mouse para detectar quaisquer sinais de lesão, tais como inchaço ou hemorragia.
3. Colheita da medula óssea 5 dias após o tratamento com 5-FU (3 dias antes da transplantação).
   1. Anestesiar ratos por vaporizador de isoflurano com uma taxa de fluxo de 5% de oxigénio suplementar combinada em 1 L / min. Comprima pé para avaliar a resposta.
   2. Sacrifício do mouse por deslocamento cervical. Esterilizar rato pulverizando generosamente com etanol 70%, até a pele ficar molhada.
   3. Usando dissecando tesoura, fazer uma incisão na pele e dissecar a fáscia longe dos músculos da perna. Em seguida, dissecar a mão fora de rato, cortando o fêmur na altura do quadril e da tíbia, no tornozelo.
   4. dobrara perna em um "L" forma e separar cada osso da perna, cortando na articulação do joelho com uma tesoura de dissecção.
   5. Para remover cartilagem nas extremidades distais de cada osso da perna, usar as tesouras de dissecação para raspar suavemente músculo direcção de uma extremidade do osso da perna, até a cartilagem é desengatada.
   6. Usando uma seringa com uma agulha de 27 G x ½ polegada, lave cada osso da perna com PBS suplementado com 2% de FBS ao longo de um membrana de nylon de 100 um de um tubo de 50 ml. osso nivelado até osso torna-se branco para maximizar o número de células colhidas.
   7. Utilizar o êmbolo de uma seringa para triturar as células através da membrana de nylon no interior do tubo cónico de 50 ml para se obter uma suspensão de célula única. Repita com a outra perna mouse.
4. células Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 400 xg e rejeitar o sobrenadante. Ressuspender BM potássio em 5 ml de cloreto de amónio (ACK) tampão para lisar as células vermelhas do sangue. Incubar as células em gelo durante 10 min.
5. Encha o tubo com PBS para parar a lise celular. Centrifuge células a 4 ° C durante 10 min a 400 xg e rejeitar o sobrenadante. Repita o passo de lise se o pellet BM tem da cor vermelha.
6. Ressuspender em 5 ml de PBS e contagem de células por exclusão com azul de tripano utilizando um hemocitómetro.
7. Ressuspender as células a 2 x 10 ⁶ culas por M e um cocktail pré-STIM 2x que contém DMEM suplementado com 20% de FBS, L-glutamina, penicilina / estreptomicina, a IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml), e SCF (112 ng / ml). Placa de 2 ml por poço em placas de 6 cavidades.
8. Incubam-se as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO _2.
9. Adicionar 2 ml de sobrenadante virai para cada poço contendo células de MO e adicionar polibreno (8 ug / ml). chapas giram a 30 ° C durante 90 min a 1500 xg, em seguida, voltar a placa na incubadora de cultura de tecidos durante a noite.
10. suspensão de células em tubos cónicos de pipeta e centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg, não elimine a placa. Ressuspender as células em 2 ml fresco 2x cocktail pré-Stim por poço e voltar aos poços originais.
11. Executar uma spinoculation ^2º, repetindo os passos 3,7-3,9.

4. Células de transplantes em ratos destinatário

1. Prepare ratinhos receptores singeneicos para transplante com uma dose de irradiação corporal total letal <24 hr antes da injecção de células de MO.
   NOTA: irradiação dose letal para camundongos BALB / c é normalmente 800-900 cGy e 1.000-1.200 cGy para C57B / 6 ^10. A dose está tipicamente em duas sessões de irradiação espaçados, pelo menos, 3-4 horas de intervalo.
2. Continuação da etapa 3.11, células do doador colheita transduzida a partir das 6 placas de poços com cuidado pipetando sobrenadante para tubos cônicos. Lave cada poço com 1 ml de PBS para coletar células residuais e adicionar 50 ml tubos cônicos.
3. Adicionar 0,5 ml de tripsina a 0,05% aos poços e incuba-se a 37 ° C na incubadora de cultura de tecido durante 5 minutos.
4. Adicionar 1 ml D10 aos poços e retirar todas as células restantes por pipetagem suave. Adicionar células para o respectivo tubos a partir do passo 4.2 e sedimento por centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 400 x g.
5. Lavar células com PBS e centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 400 x g. Ressuspender em 5 ml PBS e contagem de células usando um hemocitômetro por exclusão azul de tripano.
   NOTA: Se o vector tem uma marcação GFP então quantificar a percentagem de células positivas para GFP com um citómetro de fluxo.
6. Ressuspender 5 x 10 ⁵ - 2 X 10 ⁶ células em 50 - 100 ul de PBS para injecção em ratinhos.
7. Injetar células através de injecção retro-orbital em ratos anestesiados usando um 27 G x ½ "agulha estéril.
   NOTA: Outras técnicas de injeção incluem tail-veia, baço, ou femoral.
   1. Anestesiar mouse usando isoflurano e pitada pé para avaliar a resposta.
   2. Posicione o mouse de lado e restringir usando tanto o polegar eo dedo indicador de modo a que o olho sai ligeiramente da cabeça.
   3. Com o bisel voltado para cima, insira o needle lateral ao canto medial em um ângulo de 45 °.
      NOTA: Se esta técnica é realizada corretamente, o olho deve recuar um pouco e nenhuma resistência deve ser sentida após a inserção da agulha.
   4. Examine o mouse para detectar quaisquer sinais de lesão, tais como inchaço ou hemorragia.
      NOTA: Seguindo ratos transplante terá baixa contagem do sangue para um número de semanas e por isso são suscetíveis à infecção. pode ser utilizada a profilaxia com antibióticos ou uso de água acidificada.
8. Um mês após o transplante, medir a GFP% no sangue periférico como indicador para células doadoras enxertados, por citometria de fluxo.
   NOTA: GFP sozinha não pode determinar o sucesso do enxerto de células. A transdução viral pode ter falhado ainda enxerto pode ter ocorrido. Neste caso, não há células GFP ⁺ seria detectado, mas o enxerto de células transplantadas foi bem-sucedida.
   1. Tome 10 ml de sangue periférico bY punção da veia safena da perna com um 21 L x 1 ½ "seringa e adicioná-lo ao EDTA 100 mM em PBS, para prevenir a coagulação.
   2. Adicionar 1 mL de ACK para o sangue e lise em gelo durante 10 min. as células por centrifugação a 400 xg durante 10 min.
   3. Aspirar o sobrenadante num balão de vácuo e adicionar 1 ml de PBS suplementado com FBS a 2% para parar a lise. as células por centrifugação a 400 xg durante 10 min.
   4. Aspirar o sobrenadante num balão de vácuo e sedimento ressuspender em 100 ul de PBS suplementado com 2% de FBS.
   5. Executar amostras em um citômetro de fluxo e recolher 300.000 eventos dentro do portão de células vivas (determinado pelo FSC vs. SSC) e calcular a percentagem de GFP ⁺ e GFP ^- células ^9.
9. Além disso em 1 mês pós-transplante, realizar hemogramas completos (CBC) usando um analisador de hematologia veterinária automatizado ¹⁸ para monitorar a progressão da doença.
   NOTA: Continue a monitorar a doença por%GFP no sangue periférico e CBC mensalmente.
10. Para terminar a experiência, anestesiar mouse usando isoflurano e pitada pé para avaliar a resposta. Sacrifício do mouse por deslocamento cervical e baço colheita e medula óssea para histopatologia.
    NOTA: A duração do experimento é subjetivo e a data da rescisão deve ser avaliada com base no fenótipo da doença esperado.

Resultados

A técnica de transdução-transplante resulta na reconstituição hematopoiética dos ratinhos receptores com células que expressam o gene de interesse. A Figura 1 mostra uma visão geral do modelo de rato transdução-transplante de calreticulina mutado MPN. Resumidamente, retrovírus que expressam CALRwt ou CALRdel52 é utilizado para infectar células de MO de um ratinho dador C57B / 6. transduzidas células são transplantadas para irradiado C57B / 6 rato receptor ...

Discussão

Este protocolo fornece uma descrição detalhada de como realizar os transplantes de medula óssea em ratinhos recapitular uma doença trombocitemia essencial, como com progressão para mielofibrose com mutação CALRdel52 como o controlador da doença. O transplante bem sucedido de células que expressam os resultados CALRdel52 no aumento de plaquetas, a expansão de megacariócitos e fibrose da medula óssea. Como o transplante de medula óssea é um processo de vários passos, é importante reconhecer passos onde err...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
293T cells	ATCC	CRL-11268
3T3 cells	ATCC	CRL-1658
PLASMIDS
EcoPak, also known as pCL-Eco	Addgene	12371	Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.
MSCV-IRES-GFP (MIG)	Addgene	20672	Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.
CONSUMABLES
27G x 1/2" needles	BD	305620
Fetal bovine serum	Corning	MT-35-010-CV
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Corning	MT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	MT-25-052-CI	Can be homemade
PBS	Corning	MT-21-031-CV
10cm dishes	Fisher	172931
15 ml conical tubes	Fisher	12565268
60mm dishes	Fisher	150288
Polybrene	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100um cell strainers	Fisher	22363549
50 ml conical tubes	Fisher	12565270
6-well plate	Fisher	130184
FACS tubes	Fisher	14-959-5
0.45um syringe filters	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
ACK buffer	Lonza	10-548E	Can be homemade
Recombinant murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant murine SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	Transfection reagent
1.5 ml centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
EQUIPMENT
BD Accuri C6
X-ray irradiator