Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa

Riepilogo

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Abstract

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

Introduzione

Trasduzione-trapianto è un metodo utile per modellare neoplasie ematologiche nei topi. Questa tecnica è stata particolarmente utile per lo studio di neoplasie mieloidi risalenti alla prima dimostrazione che l'espressione ectopica di BCR-ABL1 potrebbe fedelmente ricapitolare leucemia mieloide cronica nei topi ^1. Questa tecnica ha successivamente facilitato l'ampio studio di JAK2 ^V617F e MPL ^{W515K / L} mutato neoplasia mieloproliferativa (MPN).

MPN sono un gruppo di neoplasie ematologiche caratterizzate dalla sovrapproduzione di cellule mieloidi mature e fibrosi del midollo osseo. Queste malattie in genere derivano dall'espansione clonale di una cellula staminale emopoietica che ha acquisito una mutazione somatica in entrambe le Jak2, MPL, o CALR. Trasduzione-trapianto di JAK2 ^V617F e MPL ^{W515K /} modelli ^L mostra le caratteristiche cliniche della policitemia vera e mielofibrosi ^{2-5 <}/ Sup>. Di recente, un modello murino di calreticulin-mutato MPN è stato anche generato con il metodo di trasduzione-trapianto ^6. Questi topi sviluppano una malattia trombocitemia essenziale simile ad un aumento delle piastrine, aumento del numero di megacariociti, e fibrosi del midollo osseo. Insieme, questi modelli non solo hanno fornito l'occasione al fine di conoscere la patogenesi molecolare di MPN, ma anche la capacità di sviluppare e studiare terapie in un ambiente pre-clinica.

Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata della metodologia di trasduzione-trapianto con una particolare attenzione per la mutazione CALRdel52. Questa tecnica prevede il trapianto di cellule del midollo osseo retrovirally trasdotte che esprimono il mutante costrutto in topi riceventi singenici irradiati.

Protocollo

Questo studio è stato approvato e realizzato in conformità con le raccomandazioni del Comitato Istituzionale Animal cura e l'uso presso l'Università della California, Irvine. Tutte le procedure sono state eseguite in anestesia isoflurano e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo le sofferenze.

1. Generazione di Ecotropic Retrovirus

1. Preparare plasmidi di alta qualità, con una concentrazione di almeno 1 mg / mL utilizzando un kit di maxi-prep commerciale o purificazione di cloruro di cesio.
   NOTA: Queste includono un vettore backbone MSCV codificante il gene di interesse (in questo caso CALR ^7,8) e marker di scelta (GFP, Neo, ecc) così come un plasmide di confezionamento ecotropic, codifica gag-pol-env (denominato qui come plasmide).
2. Scongelare ed espandere cellule 293T bassa di passaggio in DMEM supplementato con 10% FBS e L-glutammina con la penicillina / streptomicina (D10). Piastra 5 x 10 ⁶ cellule in un 10 centimetri di tessuto piatto di coltura trattata in un umidificatacoltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% CO _2.
3. Espandere le cellule 293T in coltura. Il giorno prima trasfezione, lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS e aspirare il surnatante in un pallone a vuoto.
4. Per trypsinize cellule, aggiungere 2 ml 0,05% tripsina e incubare piatti in umidificato coltura tissutale incubatore per 2 - 3 min a 37 ° C e 5% CO _2.
5. Per interrompere tripsinizzazione, aggiungere 3 ml D10 a piatto e le cellule di trasferimento ad un tubo da 15 ml. Spin cellule a 400 xg per 10 min.
6. Aspirare il surnatante in una boccetta di vuoto e risospendere pellet di cellule in 2 ml D10.
7. Contare le cellule di esclusione trypan blu utilizzando un emocitometro.
8. Seed 2 x 10 ⁶ cellule per piatto in tre 10 cm di tessuto piatti della cultura trattati per virus generati.
   NOTA: Per ottenere risultati ottimali, non consentono alle cellule di superano il 30 - 50% confluenza al momento della trasfezione o di una cattiva resa virus può essere ottenuto.
9. Immediatamente prima trasfezione,mezzi aspirato in un pallone a vuoto e sostituirli con 5 ml D10 fresco.
10. Per ogni 10 cm Petri da transfettate preparare un individuo sterile provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
11. Pipettare 760 ml di mezzi siero ridotto in ciascuna provetta, quindi aggiungere con cautela 40 ml di reagente di trasfezione direttamente nel supporto. Incubare le provette nella cappa coltura tissutale a temperatura ambiente per 5 min.
12. Aggiungere 30 mg di MSCV vettore con il gene di interesse (15 mcg se si utilizza vettore vuoto) e 5 mg di plasmide per ogni rispettivo tubo e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente nella cappa coltura tissutale per altri 15 min.
    NOTA: i vettori più piccoli tendono ad avere rendimenti più elevati virali.
13. Aggiungere con cautela il volume totale di ogni reazione (circa 800 ml) goccia a goccia nel rispettivo 10 centimetri Petri e inclinare leggermente il piatto da un lato all'altro per mescolare. Rientro cellule per il cu tessuti umidificataincubatore lture.
14. A seguito di una 8 ore o l'incubazione durante la notte in coltura tissutale incubatore, i media aspirato in una boccetta di vuoto e delicatamente sostituire con 10 ml di D10 fresco.
15. A 48 ore dopo la trasfezione raccogliere surnatante in una siringa da 35 ml e filtrare attraverso una membrana da 0,45 micron per rimuovere i detriti cellulari.
16. OPTIONAL: 10 ml D10 fresca torna sulle cellule 293T e virus supplementare può essere raccolto in 72 ore dopo la trasfezione.
17. Smaltire cellule 293T in rifiuti biologici in assenza di virus vengono raccolte.
18. surnatante virale Aliquota in volumi monouso (ad esempio 1 ml per titolo virale o 6.5 ml per l'infezione da BM). virus Flash-congelamento con azoto liquido e virus conservare a -80 ° C.
    NOTA: Evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento in quanto riducono notevolmente titolo virale.

2. Determinare relativo titolo virale mediante citometria di flusso

1. Scongelare 3T3 e mantenere in D10. Coltivare le cellule in un cm 10tessuto-coltura trattata piatto in un incubatore umidificato coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Eseguire titolo virale in triplice copia. Per preparare le cellule, lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS e aspirare il surnatante in un pallone a vuoto.
3. Per trypsinize cellule, aggiungere 2 ml 0,05% tripsina e incubare piatti in un incubatore umidificato coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO _2.
4. Per interrompere tripsinizzazione, aggiungere 3 ml D10 a piatto e le cellule di trasferimento ad un tubo da 15 ml. Spin cellule a 400 xg per 10 min.
5. Aspirare il surnatante in una boccetta di vuoto e risospendere pellet di cellule in 2 ml D10.
6. Contare le cellule di esclusione trypan blu utilizzando un emocitometro.
7. Seme 3T3 con una densità di 1 x 10 ⁵ cellule in quindici tessuti piatti 60 mm coltura trattata e incubare durante la notte.
8. Rendere 1: 3, 1:10, 1:30 e 1: 100 diluizioni del surnatante virale scongelato utilizzando D10 in un totale di 1 ml. Anche un controllo privo di virus.
9. mi aspiraredia da 3T3 in una beuta da vuoto e sostituirlo con 4 ml di D10.
10. Sovrapponete le cellule 3T3 con le diluizioni di surnatante virale e aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 8 mg / ml per ogni piatto. Incubare per 48 ore in coltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% CO _2.
11. Determinare titolo virale relativa mediante citometria di flusso:
    1. Per lavare le cellule, aspirare i media in un pallone vuoto e aggiungere 5 ml di PBS.
    2. Aspirare il PBS in un pallone a vuoto. Aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina e incubare a 37 ° C per 2 - 5 minuti per staccare le cellule dal piatto.
    3. Aggiungere 3 ml D10 e pipetta su e giù per staccare i restanti cellule dalla piastra. Trasferire le cellule in una provetta FACS e centrifugare a 400 xg per 10 min.
    4. Decantare il surnatante e lavare le cellule con 3 ml di PBS. Centrifugare a 400 xg per 10 minuti e il surnatante decantare. Risospendere in 200 l di PBS.
    5. Cellule eseguito su un citofluorimetro ^9. Raccogliere tra 20.000 - 30.000 eventi all'interno tegli vive porta cellulare (determinata dalla FSC e SSC) e calcolare la percentuale di GFP ⁺ e GFP ^- cellule.
       NOTA: Il titolo virale è considerato accettabile 1:30 diluizione virale rendimenti surnatante almeno 50% GFP ⁺ cellule 3T3. Se poi i risultati non ottimali di trasduzione possono ottenere questo risultato diluizione nelle cellule meno del 50% GFP ^+. Il calcolo per determinare titolo virale è stato adattato da Limon et al. , Sangue (1997) ^9.
    6. Per determinare relativo titolo del virus, utilizzare l'equazione: titolo del virus = unità formanti di particelle (PFU) / ml = [(Numero di 3T3 × Frequenza di GFP ⁺ cellule) / volume del surnatante (ml)] × Fattore di diluizione.

3. trasdurre donatori cellule del midollo osseo

1. Per preparare topi donatori per il midollo osseo (BM) raccolto, prima anestetizzare topi di vaporizzatore isoflurano con una portata di 5% supplementare combinatoossigeno a 1 L / min. Pinch piede per valutare la reattività.
   NOTA: i topi donatori (meno di 8 settimane di età) devono essere preparati 5 giorni prima della raccolta di midollo osseo (8 giorni prima del trapianto). Uno topi donatori forniranno abbastanza cellule per almeno 2 destinatari.
2. Iniettare 150 mg / kg 5-fluorouracile (5-FU) tramite iniezione retro-orbitale nei topi anestetizzati con un 27 G × ½ "ago.
   ATTENZIONE! 5-FU un agente chemioterapico antitumorale. Maneggiare sempre 5-FU all'interno di una cappa certificata o un armadio biosicurezza canalizzata. Consultare il comitato di sicurezza di laboratorio e degli animali dell'istituzione per determinare un'adeguata etichettatura dei topi trattati con 5-FU.
   1. Posizionare il mouse anestetizzato su un lato e frenare utilizzando sia il pollice e l'indice tale che l'occhio sporge leggermente dalla testa.
   2. Partendo laterale ago al canto mediale e con lo smusso rivolto verso l'alto, inserire l'ago con un 45° l'angolo in direzione mediale e fermarsi quando è a metà strada inserito l'ago. Lentamente iniettare le cellule e rimuovere rimuovere con attenzione l'ago.
      NOTA: Se questa tecnica viene eseguita correttamente, l'occhio deve rientrare un po 'e nessuna resistenza deve essere sentito al momento dell'inserimento dell'ago.
   3. Esaminare il mouse per eventuali segni di lesioni, come gonfiore o sanguinamento.
3. Harvest midollo osseo 5 giorni dopo il 5-FU trattamento (3 giorni prima del trapianto).
   1. Anestetizzare topi di vaporizzatore isoflurano con una portata di 5% ossigeno supplementare combinata 1 L / min. Pinch piede per valutare la reattività.
   2. Sacrifice mouse dislocazione cervicale. Sterilizzare il mouse a spruzzo generosamente con il 70% EtOH fino pelliccia si bagna.
   3. Utilizzando dissezione forbici, fare una incisione nella pelle e sezionare la fascia lontano dai muscoli delle gambe. Successivamente, sezionare la gamba dal mouse recidere il femore a livello dell'anca e la tibia alla caviglia.
   4. piegarela gamba in una forma a "L" e separare ogni osso della gamba tagliando al ginocchio con le forbici dissezione.
   5. Per rimuovere la cartilagine alle estremità distali di ciascun osso della gamba, utilizzare le forbici dissezione per raschiare delicatamente muscolare verso una estremità della gamba ossa fino cartilagine è disimpegnato.
   6. Usando una siringa con un ago 27 G x ½ pollici, flush ogni osso gamba con PBS integrato con il 2% FBS su una membrana di nylon 100 mM in una provetta conica da 50 ml. osso a filo fino a quando l'osso diventa bianco per massimizzare il numero di cellule raccolte.
   7. Utilizzare lo stantuffo di una siringa per schiacciare cellule attraverso la membrana di nylon nel tubo conico 50 ml per ottenere una sospensione di cellule singole. Ripetere con l'altra gamba del mouse.
4. cellule centrifugare a 4 ° C per 10 min a 400 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere BM in 5 ml di cloruro di ammonio di potassio (ACK) buffer per lisare i globuli rossi. Incubare le cellule in ghiaccio per 10 min.
5. Riempire il tubo con PBS per fermare la lisi cellulare. Centricellule Fuge a 4 ° C per 10 min a 400 xg ed eliminare il surnatante. Ripetere il passaggio lisi se il pellet BM ha colore rosso.
6. Risospendere in 5 ml di PBS e contare le cellule di esclusione trypan blu utilizzando un emocitometro.
7. Risospendere le cellule a 2 x 10 ⁶ cellule per m con 2x cocktail pre-stimolazione contenente DMEM integrato con 20% FBS, L-glutammina, penicillina / streptomicina, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) e SCF (112 ng / ml). Piastra 2 ml per pozzetto in 6 pozzetti.
8. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C e 5% CO _2.
9. Aggiungere 2 ml di surnatante virale ad ogni pozzetto contenenti cellule BM e aggiungere polibrene (8 mg / ml). piastre Spin a 30 ° C per 90 min a 1500 xg per poi tornare piastra per coltura tissutale incubatore overnight.
10. sospensione cellulare Pipettare in tubi conici e centrifugare a 4 ° C per 10 min a 400 xg, non gettare la piastra. Risospendere le cellule in 2 ml fresca 2x cocktail pre-Stim per bene e tornare ai pozzi originali.
11. Eseguire un spinoculation 2 ^° ripetendo i passaggi 3.7-3.9.

4. Cellule trapianti in topi riceventi

1. Preparare topi riceventi singenici per il trapianto con dose letale irradiazione corporea totale <24 ore prima dell'iniezione di cellule BM.
   NOTA: irradiazione dose letale per / c topi BALB è tipicamente 800-900 cGy e 1000-1200 cGy per C57B / 6 ^10. La dose è di solito divisa in due sessioni di irradiazione distanziati di almeno 3-4 ore di distanza.
2. Continua da punto 3.11, le cellule del donatore raccolto trasdotte dai 6 pozzetti pipettando delicatamente surnatante in tubi conici. Lavare ogni pozzetto con 1 ml di PBS per raccogliere le cellule residue e aggiungere a 50 ml provette coniche.
3. Aggiungere 0,5 ml di 0,05% tripsina ai pozzetti e incubare a 37 ° C in incubatore cultura tissutale per 5 min.
4. Aggiungere 1 ml D10 di pozzi e staccare eventuali cellule rimanenti delicatamente pipettando. Aggiungere cellule al rispettivo tubos dal punto 4.2 e pellet per centrifugazione a 4 ° C per 10 min a 400 x g.
5. Lavare le cellule con PBS e centrifugare a 4 ° C per 10 min a 400 x g. Risospendere in 5 ml di PBS e contare le cellule utilizzando un emocitometro da trypan blu.
   NOTA: Se il vettore ha un tag GFP quindi di quantificare la percentuale di cellule GFP-positive con un citofluorimetro.
6. Risospendere 5 x 10 ⁵ - 2 x 10 ⁶ cellule in 50 - 100 microlitri di PBS per iniezione in topi.
7. Iniettare cellule tramite iniezione retro-orbitale in topi anestetizzati con una sterile 27 G x ½ "ago.
   NOTA: Altre tecniche di iniezione includono coda vena splenica o femorale.
   1. Anestetizzare il mouse con isoflurano e un pizzico piedi per valutare la reattività.
   2. Posizionare il mouse su un lato e frenare utilizzando sia il pollice e l'indice tale che l'occhio sporge leggermente dalla testa.
   3. Con lo smusso rivolto verso l'alto, inserire il nEedle lateralmente al canto mediale a 45 °.
      NOTA: Se questa tecnica viene eseguita correttamente, l'occhio deve rientrare un po 'e nessuna resistenza deve essere sentito al momento dell'inserimento dell'ago.
   4. Esaminare il mouse per eventuali segni di lesioni, come gonfiore o sanguinamento.
      NOTA: i topi trapianto seguito dovranno emocromo bassi per un certo numero di settimane e quindi sono suscettibili alle infezioni. Profilassi con antibiotici o uso di acqua acidificata può essere utilizzato.
8. Un mese dopo il trapianto, misurare la GFP% nel sangue periferico come un indicatore per le cellule del donatore trapiantate mediante citometria di flusso.
   NOTA: GFP da sola non può determinare il successo di attecchimento delle cellule. La trasduzione virale potrebbe non essere riuscito ancora attecchimento potrebbe essersi verificato. In questo caso, non le cellule GFP ⁺ sarebbero rilevati, ma l'attecchimento delle cellule trapiantate ha avuto successo.
   1. Prendere 10 ml di sangue periferico By la puntura della vena safena della gamba con un 21 G x 1 ½ "siringa e aggiungerlo a 100 mm EDTA in PBS per prevenire la coagulazione.
   2. Aggiungere 1 ml di ACK al sangue e lisare in ghiaccio per 10 min. Cellule pellet per centrifugazione a 400 xg per 10 min.
   3. Aspirare il surnatante in un pallone vuoto e aggiungere 1 ml di PBS integrato con il 2% FBS per fermare lisi. Cellule pellet per centrifugazione a 400 xg per 10 min.
   4. Aspirare il surnatante in un pallone vuoto e risospendere pellet in 100 ml di PBS integrato con il 2% FBS.
   5. Esegui campioni su un citofluorimetro e raccogliere 300.000 eventi all'interno del cancello cellule vive (determinata dalla FSC e SSC) e calcolare la percentuale di GFP ⁺ e GFP ^- cellule ^9.
9. Inoltre a 1 mese post-trapianto, effettuare emocromo completo (CBC) utilizzando un processo automatizzato analizzatore ematologico veterinaria ¹⁸ per monitorare la progressione della malattia.
   NOTA: Continuare a monitorare la malattia da%GFP nel sangue periferico e CBC mensile.
10. Per terminare l'esperimento, anestetizzare il mouse con isoflurano e un pizzico piedi per valutare la reattività. Sacrifice mouse dislocazione cervicale e la raccolta della milza e del midollo osseo per istopatologia.
    NOTA: La durata dell'esperimento è personale e la data di scadenza dovrebbe essere valutata sulla base della malattia fenotipo atteso.

Risultati

La tecnica trasduzione-trapianto comporta ricostituzione ematopoietica dei topi riceventi con cellule esprimenti il ​​gene di interesse. La Figura 1 mostra una panoramica del modello di topo trasduzione-trapianto di calreticulin mutato MPN. In breve, retrovirus che esprimono CALRwt o CALRdel52 viene utilizzato per infettare le cellule BM da un topo donatore C57B / 6. cellule trasdotte vengono trapiantate in irradiato C57B / 6 del mouse ricevente e donatore di attecch...

Discussione

Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come eseguire trapianti di midollo osseo in topi ricapitolare una malattia essenziale trombocitemia simile con la progressione di mielofibrosi con CALRdel52 mutazione come il conducente della malattia. il trapianto di successo di cellule che esprimono i risultati CALRdel52 un aumento delle piastrine, l'espansione dei megacariociti, e fibrosi del midollo osseo. Come trapianto di midollo osseo è un processo a più fasi, è importante riconoscere passaggi dove ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
293T cells	ATCC	CRL-11268
3T3 cells	ATCC	CRL-1658
PLASMIDS
EcoPak, also known as pCL-Eco	Addgene	12371	Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.
MSCV-IRES-GFP (MIG)	Addgene	20672	Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.
CONSUMABLES
27G x 1/2" needles	BD	305620
Fetal bovine serum	Corning	MT-35-010-CV
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Corning	MT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	MT-25-052-CI	Can be homemade
PBS	Corning	MT-21-031-CV
10cm dishes	Fisher	172931
15 ml conical tubes	Fisher	12565268
60mm dishes	Fisher	150288
Polybrene	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100um cell strainers	Fisher	22363549
50 ml conical tubes	Fisher	12565270
6-well plate	Fisher	130184
FACS tubes	Fisher	14-959-5
0.45um syringe filters	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
ACK buffer	Lonza	10-548E	Can be homemade
Recombinant murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant murine SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	Transfection reagent
1.5 ml centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
EQUIPMENT
BD Accuri C6
X-ray irradiator