골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

요약

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

초록

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

서문

전달-이식 생쥐에서 혈액 악성 종양을 모델링하는 유용한 방법이다. 이 기술은 다시 BCR-ABL1의 이소성 표현이 충실 마우스 ⁽¹⁾ 만성 골수성 백혈병을 요점을 되풀이 수있는 최초의 시범 데이트 골수의 악성 종양을 공부에 특히 가치가있다. 이 기술은 이후에 골수 증식 성 신 생물 (MPN)에 돌연변이 JAK2 ^V617F 및 MPL ^{W515K / L의} 광범위한 연구를 촉진하고있다.

MPN 성숙한 골수 세포 및 골수 섬유증의 과잉 특징 혈액 종양의 그룹이다. 이 질환은 일반적으로 릴화 Jak2, MPL, 또는 CALR 하나의 체세포 돌연변이를 획득 한 조혈 줄기 세포의 클론 확장에서 발생한다. 전달 이식 JAK2 ^V617F 및 MPL ^{W515K / L 모델} 전시 진성 다혈 구증 및 골수 섬유증 ^(2)의 임상 적 특징 ^{- 5 <}/ SUP>. 최근, 칼레 티 큘린 돌연변이 MPN의 마우스 모델은 또한 전달 이식 방법 ^(6)로 생성되었다. 이러한 마우스는 증가 된 혈소판, 거핵구 증가 수, 골수 섬유증 필수적인 혈소판과 같은 질환을 개발한다. 함께, 이러한 모델은 MPN의 분자 기전에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회뿐만 아니라, 개발 및 전임상 설정에서 치료제를 연구 할 수있는 능력을 제공하고 있습니다뿐만 아닙니다.

이 원고는 CALRdel52 돌연변이에 초점을 전달 이식 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 기술은 조사 된 동계 돌연변이받는 마우스로 구성 retrovirally 형질 발현하는 골수 세포의 이식을 포함한다.

프로토콜

이 연구는 승인 및 캘리포니아 대학교 어바인에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 권고에 따라 실시 하였다. 모든 절차는 이소 플루 란 마취하에 수행 된 모든 노력은 고통을 최소화 하였다.

Ecotropic 레트로 바이러스의 1 세대

1. 상업적 맥시 프렙 키트 또는 세슘 클로라이드 정제를 이용하여 적어도 1 μg의 / μL의 농도로 고품질 플라스미드를 준비한다.
   주의 : 이러한는 MSCV 백본 (CALR ^7,8이 경우에) 관심의 유전자를 코딩 벡터 및 (등 GFP, 네오) 선택의 마커뿐만 아니라 ecotropic 포장 플라스미드, 인코딩 개그-POL-ENV를 포함 (함 여기 플라스미드 등).
2. DMEM에서 해동 및 확장 낮은 통로 293T 세포는 페니실린 / 스트렙토 마이신 (D10)와 10 % FBS와 L 글루타민 보충. 가습에서 10cm 조직 배양 처리 접시에 접시 5 × 10 ⁶ 세포조직 배양, 37 ℃ 배양기에서 5 % CO _2.
3. 문화 293T 세포를 확장합니다. 형질 전환 전날에, 진공 플라스크에 1 ml의 PBS와 대기음 뜨는을 추가하여 세포를 씻으십시오.
4. 세포를 Trypsinize하기 2ml의 0.05 % 트립신을 추가 부화 요리 2 습윤 조직 배양 인큐베이터에서 - 3 분, 37 ℃에서 5 % CO _2.
5. , 트립신을 중지 15 ML 원뿔 관에 접시 3 ML의 D10 및 전송 셀을 추가합니다. 10 분 동안 400 XG에 세포를 스핀.
6. 2 ML의 D10의 진공 플라스크에 resuspend 세포 펠렛에 기음 뜨는.
7. 혈구를 사용하여 트리 판 블루 배제하여 세포를 계산합니다.
8. 시드 생성 된 바이러스에 세 10cm 조직 배양 처리 된 요리로 접시 당 2 × 10 ⁶ 세포.
   참고 : 최적의 결과를 얻으 세포가 30을 초과하는 것을 허용하지 않습니다 - 형질 전환 또는 가난한 바이러스 수율을 얻을 수 있습니다 시간에 50 %의 합류.
9. 즉시 형질 전에,진공 플라스크에 넣고 흡인 미디어는 5 ml의 신선한 D10으로 대체합니다.
10. 모든 10cm를 들어 페트리 접시는 개별 멸균 1.5 ㎖의 microcentrifuge 관을 준비 형질합니다.
11. 피펫 각 microcentrifuge 관으로 감소 혈청 매체의 760 μL는 조심스럽게 직접 미디어로 형질 전환 시약의 40 μl를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 조직 배양 후드에서 튜브 부화.
12. 관심의 유전자 (빈 벡터를 사용하여 15 μg의 경우)뿐만 아니라 각각의 튜브에 플라스미드 5 μg의와 MSCV 벡터의 30 μg의를 추가로 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 추가로 15 분 동안 조직 배양 후드에서 실온에서 인큐베이션.
    참고 : 작은 벡터가 높은 바이러스 성 수율을 갖는 경향이있다.
13. 조심스럽게 드롭 현명한 각각의 10cm 페트리 접시에 각각 반응 (약 800 μL)의 전체 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞어 좌우로 접시를 기울이십시오. 가습 조직의 세제곱에 세포를 반환lture 인큐베이터.
14. 조직 문화 인큐베이터에서 8 시간 또는 하룻밤 배양 후, 부드럽게 흡인 진공 플라스크에 넣고 미디어와 신선한 D10의 10 ㎖로 교체합니다.
15. 48 시간 후 - 형질 감염에 35 mL의 주사기에 상등액을 수집하고 세포 찌꺼기를 제거하기 0.45 ㎛의 멤브레인 필터를 통하여.
16. 선택 사항 : 293T 세포 및 추가 바이러스에 장소 10 ml의 신선한 D10 백 72 시간의 후 형질 전환 수확 할 수있다.
17. 추가 바이러스가 수집되지 않을 때 생물 학적 폐기물 293T 세포를 폐기하십시오.
18. (예 : 바이러스 역가를 1 ml의 또는 BM 감염 6.5 ml의 경우) 단일 사용 볼륨으로 나누어지는 바이러스 상층 액. -80 ℃에서 액체 질소 저장 바이러스 플래시 동결 바이러스.
    주 : 크게 바이러스 역가 감소로 반복 동결 / 해동 사이클을하지 마십시오.

2. 유동 세포 계측법에 의해 상대 바이러스 역가를 결정

1. 3T3 세포를 해동 및 D10에 유지한다. 10cm의 문화 세포조직 배양 CO _2, 37 ℃에서 가습 된 조직 배양 인큐베이터에서 접시를 처리하고, 5 %.
2. 세중에서 바이러스 역가를 수행합니다. 진공 플라스크에 1 ml의 PBS와 대기음 뜨는을 추가하여 세포를 씻어 세포를 준비합니다.
3. 세포를 Trypsinize하기 2ml의 0.05 % 트립신을 추가 부화 요리 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37 ℃, 5 % CO _2.
4. , 트립신을 중지 15 ML 원뿔 관에 접시 3 ML의 D10 및 전송 셀을 추가합니다. 10 분 동안 400 XG에 세포를 스핀.
5. 2 ML의 D10의 진공 플라스크에 resuspend 세포 펠렛에 기음 뜨는.
6. 혈구를 사용하여 트리 판 블루 배제하여 세포를 계산합니다.
7. 시드 3T3 다섯 60mm 조직 배양 처리 된 접시에 1 × ¹⁰⁵ 세포의 밀도로 세포를 밤새 배양한다.
8. 3 1:10 1:30, 1 : 1 ML의 총 D10을 사용하여 고정 해제 바이러스 상층 액의 100 희석 일을합니다. 또한 바이러스가없는 컨트롤을 포함한다.
9. 저를 대기음진공 플라스크에 넣고 3T3 세포의 직경과 D10의 4 ㎖로 교체합니다.
10. 바이러스 상등액의 희석과 3T3 세포를 오버레이 각 접시 8 μg / ML의 최종 농도로 폴리 브렌을 추가한다. 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서 48 시간 및 5 % CO ₂ 부화.
11. 유동 세포 계측법에 의해 상대적으로 바이러스 역가를 결정합니다 :
    1. 세포를 세척하기 위해 진공 플라스크에 미디어를 대기음 5 ml의 PBS를 추가합니다.
    2. 진공 플라스크에 PBS를 대기음. 1 ml의 0.05 % 트립신을 추가하고 2, 37 ° C에서 부화 - 5 분 ​​접시에서 세포를 분리.
    3. 플레이트에서 남아있는 세포를 분리 아래로 3 ㎖의 D10을 추가하고 최대 피펫합니다. 10 분 동안 400 XG에서 FACS 튜브와 원심 분리기에 세포를 전송합니다.
    4. 뜨는을 가만히 따르다 3 ml의 PBS로 세포를 씻어. 10 분, 디 캔트 상층 액 400 XG에 원심 분리기. 200 ㎕의 PBS에 재현 탁.
    5. ⁹ 사이토 흐름에 실행 세포. t에서 30,000 이벤트 - 20000 사이를 수집그는 (SSC 대 FSC에 의해 결정) 세포 게이트를 살고 GFP ^+와 GFP의 비율을 계산 ^- 세포.
       참고 : 바이러스 역가가 허용 고려할 때 바이러스 성 뜨는 수율 50 % 이상에 GFP ⁺ 3T3 세포의 1시 반 희석. 경우 50 % 미만 GFP ⁺ 세포의 희석이 결과는 다음 차선 전달 결과를 얻을 수있다. 바이러스 역가를 결정하는 계산은 리몬 등의 알에서 적응했다. 혈액 (1997) ^9.
    6. 바이러스 역가 = 입자 형성 단위 (PFU) / ㎖ = [(GFP ⁺ 세포의 주파수 × 3T3 세포의 수) 상층 액 (㎖)의 / 볼륨] × 희석 요인 : 상대적 바이러스 역가를 결정하려면 방정식을 사용합니다.

3. 형질 도입 기증자 골수 세포

1. 골수 공여 마우스를 준비하기 (BM) 수확 먼저 5 % 결합 기업의 유량으로 기화기에 의해 이소 플루 란 마취 생쥐/ 분 1 L의 산소. 응답 성을 평가하기 위해 발을 꼬집어.
   참고 : (미만 8 주 오래 된) 기증자 마우스 (8 일 전에 이식) 오일 전에 골수 수확 준비를해야합니다. 하나의 공여 마우스는 2 이상의 수신자에 충분한 세포를 제공 할 것이다.
2. 주사 150 밀리그램 / kg 27 G × ½ "니들을 사용하여 마취시킨 쥐의 레트로 궤도를 통해 주입 5- 플루오로 우라실 (5-FU).
   주의! 5-FU 항암 화학 요법 제. 항상 공인 된 화학 물질 흄 후드 나 덕트 바이오 안전성 캐비닛 내부에 5-FU를 처리합니다. 5-FU 치료 쥐의 적절한 라벨링을 결정하는 기관의 실험실과 동물 안전위원회에 문의하십시오.
   1. 옆으로 마취 된 마우스를 놓고 눈은 헤드로부터 약간 돌출되도록 엄지와 집게 손가락을 모두 사용하여 억제.
   2. 내측 눈구석과 위를 향하도록 경사와 바늘 측면을 시작으로, 45에서 바늘을 삽입내측 방향으로 각도를 ° 바늘이 중간에 삽입 될 때 중지합니다. 천천히 세포를 주입 조심스럽게 바늘을 제거하십시오.
      주 :이 기술이 정확하게 수행되는 경우, 눈은 약간 수축한다 아무런 저항 바늘 삽입시 생각되어서는 안된다.
   3. 이러한 부종이나 출혈 등의 부상의 흔적을 위해 마우스를 검사합니다.
3. 수확 골수 오일 (이식 3 일 이전) 5-FU 치료 후.
   1. / 분 1 L의 5 % 혼합 보충 산소의 유량으로 기화기 이소 플루 란 마취하여 쥐. 응답 성을 평가하기 위해 발을 꼬집어.
   2. 자궁 경부 전위로 마우스를 희생. 모피는 젖은 될 때까지 70 % EtOH로 관대하게 분사하여 마우스를 소독.
   3. 가위를 해부하여, 피부에 절개를 멀리 다리 근육의 근막을 해부하다. 다음으로, 고관절에서 대퇴골과 발목의 경골을 절단하여 마우스에서 떨어져 다리를 해부하다.
   4. 굽히다ㄱ "L"모양으로 다리가 해부 가위로 무릎 관절에서 절단하여 각 다리 뼈를 분리합니다.
   5. 각 다리 뼈의 말단부에 연골을 제거하려면, 연골이 해제 될 때까지 부드럽게 다리 뼈의 한쪽 끝을 향해 근육을 긁어 해부 가위를 사용합니다.
   6. 27 X G ½ 인치 바늘 주사기를 이용하여 PBS로 세척 각 다리 뼈는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 100 μM 나일론 막 위에 2 % FBS가 보충. 뼈까지 세척 뼈 수확 된 세포의 수를 최대화하기 위해 흰색집니다.
   7. 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 나일론 막을 통해 세포 매쉬 주사기의 플런저를 사용한다. 다른 마우스 다리로 반복합니다.
4. 4 ℃에서 원심 분리기 세포 400 XG에 10 분 동안 상층 액을 버린다. 재현 탁 BM 5 ml의 염화 암모늄 칼륨 (ACK) 버퍼에 적혈구를 용해시키기 위해. 10 분 동안 얼음에 세포를 품어.
5. 세포 용해를 중지 PBS로 튜브를 입력합니다. 센트리4 ° C에서 fuge 세포 400 XG에 10 분 동안 상층 액을 버린다. BM 펠렛은 붉은 색이있는 경우 용해 단계를 반복합니다.
6. 5 ml의 PBS에 재현 탁하고 혈구를 사용하여 트리 판 블루 배제하여 세포를 계산합니다.
7. DMEM은 20 % FBS, L- 글루타민, 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 포함 배 사전 STIM 칵테일 m 당 2 × ¹⁰⁶ 개 세포로 재현 탁 세포, IL-3 (14 NG / ㎖), IL-6 (24 NG / ㎖) 및 SCF (112 NG / ㎖). 플레이트 6 웰 플레이트에 웰 당 2 ml의.
8. 37 ℃에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션하고, 5 % CO _2.
9. 각 웰 포함 BM 세포에 바이러스 상층 액을 2 ㎖를 추가하고 폴리 브렌 (/ ㎖ 8 μg의)를 추가합니다. 1,500 × g으로 90 분 동안 30 ° C에서 스핀 플레이트를 하룻밤 동안 조직 배양 배양기에 플레이트를 반환한다.
10. 피펫 세포 원뿔 튜브에 서스펜션과 400 XG에 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리기는 판을 버리지 않습니다. 이 용액에 재현 탁 세포는 신선한 배 사전 STIM 아니라 당 칵테일과 원래의 우물로 돌아갑니다.
11. 단계 3.7-3.9를 반복하여 2 ^차의 spinoculation을 수행합니다.

받는 사람 마우스에 4 이식 기증자 세포

1. 24 시간 전에 BM 세포의 주입에 치사량 전신 조사 <와 이식 동계받는 사람 마우스를 준비합니다.
   참고 : BALB / c 마우스에 대한 치명적인 선량 조사는 일반적으로 800-900 cGy의 및 C57B / 6 ¹⁰ 1,000-1,200 cGy의입니다. 용량은 일반적으로 적어도 3~4시간 이격 조사의 두 세션으로 분할된다.
2. 부드럽게 원뿔 튜브에 뜨는을 피펫 팅하여 6 웰 플레이트에서 단계 3.11, 수확 형질 공여 세포로부터 계속됩니다. 잔여 세포를 수집하고 50 ML 원뿔 튜브에 추가 할 PBS 1 ml의 잘 각을 씻으십시오.
3. 웰을 0.05 % 트립신 0.5ml를 추가 5 분 동안 조직 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다.
4. 우물 1 ML의 D10을 추가하고 부드러운 피펫으로 남아있는 세포를 분리. 각각의 튜브에 세포를 추가400 × g으로 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 단계 4.2 펠릿에서의.
5. 400 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 PBS와 원심 분리기와 세포를 씻으십시오. 트리 판 블루 배제하여 혈구를 사용하여 5 ml의 PBS에 재현 탁하고 계산 세포.
   주 : 벡터는 GFP 태그가 있다면 유세포하여 GFP 양성 세포의 비율을 수치화.
6. 마우스에 주입을위한 100 ㎕의 PBS - 50 2 × 10 ⁶ 세포 - 5 × 10 ^5를 재현 탁.
7. 멸균 27 G X ½ "바늘을 사용하여 마취 마우스로 역 궤도 사출을 통해 세포를 주입한다.
   참고 : 다른 주입 기술은 꼬리 정맥, 비장, 또는 대퇴를 포함한다.
   1. 반응성을 평가하기 위해 핀치 이소 플루 란과 발을 사용하여 마우스를 마취.
   2. 그 측면에 마우스를 위치시키고, 눈은 헤드로부터 약간 돌출되도록 엄지와 집게 손가락을 모두 사용하여 억제.
   3. 베벨이 위를 향으로, N을 삽입45 ° 각도로 측방 내안 eedle.
      주 :이 기술이 정확하게 수행되는 경우, 눈은 약간 수축한다 아무런 저항 바늘 삽입시 생각되어서는 안된다.
   4. 이러한 부종이나 출혈 등의 부상의 흔적을 위해 마우스를 검사합니다.
      참고 : 다음 이식 마우스는 주 번호에 대한 낮은 혈액 카운트를 가지고 있으므로 감염에 취약합니다. 항생제 또는 산성화 된 물을 사용하여 예방이 사용될 수있다.
8. 이식 후 1 개월, 유동 세포 계측법에 의해 접목 공여 세포의 지표로서 말초 혈액에서의 GFP %를 측정한다.
   참고 : 혼자 GFP가 세포의 생착의 성공을 확인할 수 없습니다. 바이러스 성 전달이 실패했을 수 있습니다 아직 생착가 발생했을 수 있습니다. 이 경우, GFP ⁺ 세포가 검출되지 않지만 이식 세포의 생착이 성공된다.
   1. 말초 혈액 (b)의 10 μl를 타고y를 21 G × 1 ½ "주사기로 복재 다리 정맥을 천공 및 응고를 방지하기 위해 PBS 100 mM의 EDTA에 추가합니다.
   2. 10 분 동안 얼음에 혈액과를 Lyse 1 ml의 ACK를 추가합니다. 10 분 동안 400 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포.
   3. 대기음 진공 플라스크에 상층 액 1 ml의 PBS를 추가는 용해을 정지 2 % FBS로 보충. 10 분 동안 400 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포.
   4. 100 μl의 PBS에서 진공 플라스크에 resuspend 펠렛의 대기음 뜨는는 2 % FBS와 보충.
   5. 흐름 cytometer에 샘플을 실행하고 (SSC 대 FSC에 의해 결정) 라이브 세포 게이트에서 30 만 이벤트를 수집하고 GFP ^+와 GFP의 비율을 계산 ^- 셀 ^(9).
9. 또한 1 개월 후 이식에서 질병의 진행을 모니터링하는 자동화 된 동물 혈액 분석기 ^(18)를 사용하여 완전한 혈액 카운트 (CBC)을 수행합니다.
   참고 : %로 질병을 모니터링 계속월간 말초 혈액 및 CBC에서 GFP.
10. 실험을 종료하려면, 응답 성을 평가하기 위해 이소 플루 란과 핀치 발을 사용하여 마우스를 마취. 조직 병리학에 대한 자궁 경부 전위 및 수확 비장과 골수에 의해 마우스를 희생.
    참고 실험의 길이는 주관적 및 종료일 예상 질환의 표현형에 기초하여 평가한다.

결과

형질 도입 이식 기술은 세포가 관심있는 유전자를 발현과받는 마우스의 조혈 재구성을 초래한다. 그림 1은 MPN 돌연변이 칼레 티 큘린의 전달 이식 마우스 모델의 개요를 보여줍니다. 간단히, CALRwt 또는 CALRdel52을 표현 레트로 바이러스는 C57B / 6 기증자 마우스에서 BM 세포를 감염하는 데 사용됩니다. 형질 세포는 첫 번째 달 후 이식시 발생 조사 C57B / 6받는 사람...

토론

이 프로토콜은 질병의 드라이버로 CALRdel52 변이 골수 섬유증으로 진행과 필수적인 혈소판 같은 질환 요점을 되풀이하는 생쥐 골수 이식을 수행하는 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 혈소판 증가, 거핵 세포의 확장 및 골수 섬유증에 CALRdel52 결과를 발현하는 세포의 이식에 성공. 골수 이식은 다단계 과정이기 때문에 기술적 오류 관심 또는 마우스 사망의 유전자를 발현하는 세포의 생착 불량?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
293T cells	ATCC	CRL-11268
3T3 cells	ATCC	CRL-1658
PLASMIDS
EcoPak, also known as pCL-Eco	Addgene	12371	Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.
MSCV-IRES-GFP (MIG)	Addgene	20672	Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.
CONSUMABLES
27G x 1/2" needles	BD	305620
Fetal bovine serum	Corning	MT-35-010-CV
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Corning	MT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	MT-25-052-CI	Can be homemade
PBS	Corning	MT-21-031-CV
10cm dishes	Fisher	172931
15 ml conical tubes	Fisher	12565268
60mm dishes	Fisher	150288
Polybrene	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100um cell strainers	Fisher	22363549
50 ml conical tubes	Fisher	12565270
6-well plate	Fisher	130184
FACS tubes	Fisher	14-959-5
0.45um syringe filters	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
ACK buffer	Lonza	10-548E	Can be homemade
Recombinant murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant murine SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	Transfection reagent
1.5 ml centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
EQUIPMENT
BD Accuri C6
X-ray irradiator